Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sıçan Astrositleri ve Mikroglia'nın Birincil Kültürleri ve Amiyotrofik Lateral Skleroz Çalışmalarında Kullanımları

3.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63483

⸱

23 Haziran 2022

 ,  ,  , 
1Center for Laser Microscopy, Institute for Physiology and Biochemistry “Jean Giaja”, University of Belgrade Faculty of Biology

Bu makalede

Özet

Burada, hSOD1G93A sıçan modelinde amiyotrofik lateral sklerozun patofizyolojisi üzerine araştırmalar için hücre içi Ca2+'nın hızlandırılmış video görüntülemesi için sıçan kortekslerinden glial hücrelerin, astrositlerin ve mikrogliaların primer kültürlerinin nasıl hazırlanacağına dair bir protokol sunuyoruz.

Özet

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarının kortekslerinden glial hücrelerin, astrositlerin ve mikrogliaların birincil kültürlerinin nasıl hazırlanacağını ve bu hücrelerin sıçan hSOD1G93A modelinde amiyotrofik lateral skleroz (ALS) patofizyolojisini incelemek amacıyla nasıl kullanılacağını göstermektedir. İlk olarak, protokol astrositlerin ve mikrogliaların doğum sonrası sıçan kortekslerinden nasıl izole edileceğini ve kültürleneceğini ve daha sonra astrositlerin glial fibriler asidik protein (GFAP) belirtecini ve iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (Iba1) mikroglial belirtecini kullanarak immünositokimya ile bu kültürlerin saflık için nasıl karakterize edileceğini ve test edileceğini göstermektedir. Bir sonraki aşamada, kültürlenmiş hücrelerin boya yüklemesi (kalsiyuma duyarlı Fluo 4-) ve canlı hücreler üzerindeki video görüntüleme deneylerinde Ca2+ değişikliklerinin kayıtları için yöntemler açıklanmaktadır.

Video kayıtlarının örnekleri şunlardan oluşur: (1) ALS hastalarından izole edilen immünoglobulin G'ye (IgG) akut olarak maruz kalan kültürlü astrositlerin Ca2+ görüntüleme vakaları, aynı deneyde gösterildiği gibi ATP'ye verilen cevaba kıyasla karakteristik ve spesifik bir yanıt göstermektedir. Örnekler ayrıca, hSOD1G93A astrositlerinde ALS IgG tarafından uyarılan hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda, transgenik olmayan kontrollere kıyasla daha belirgin bir geçici artış göstermektedir; (2) Endoplazmik retikulum Ca 2+ ATPaz'ın rekabetçi olmayan bir inhibitörü olan thapsigargin (Thg) tarafından kalsiyum depolarının tükenmesi sırasında kültürlenmiş astrositlerin Ca 2+ görüntülenmesi, ardından kayıt çözeltisine kalsiyum ilavesiyle ortaya çıkan depo tarafından işletilen kalsiyum girişi, hSOD1G93A'da ve transgenik olmayan astrositlerde Ca 2+ depo çalışması arasındaki farkı gösterir; (3) Kültürlü mikroglianın Ca 2+ görüntülemesi ağırlıklı olarak ALS IgG'ye yanıt eksikliği gösterirken, ATP uygulaması Ca2+ değişikliğine neden olmuştur. Bu makale aynı zamanda kritik hücre yoğunluğu ve kültürlerin saflığı ile ilgili olası uyarıları ve uyarıları vurgulamakta, Ca2+ boya ve boya yükleme tekniklerinin doğru konsantrasyonunu seçmektedir.

Giriş

Hücre kültürü teknikleri, sağlık ve hastalıkta hücresel nörofizyolojinin çeşitli alanlarında sayısız ilerlemeye yol açmıştır. Özellikle, bir laboratuar hayvanının nöronal dokusundan yeni izole edilmiş birincil hücre kültürleri, deneycinin farklı biyokimyasal ortamlardaki ve fizyolojik kurulumlardaki çeşitli hücrelerin davranışlarını yakından incelemesine izin verir. Hızlandırılmış video mikroskobu ile birlikte Ca2 + duyarlı boyalar gibi farklı floresan fizyolojik göstergelerin kullanılması, hücresel biyofiziksel ve biyokimyasal süreçler hakkında gerçek zamanlı olarak daha iyi bir fikir verir.

ALS, üst ve alt motor nöronları etkileyen yıkıcı bir nörodejeneratif hastalıktır1. Hastalık ailesel tipte kompleks bir patogeneze sahiptir, ancak çoğunlukla sporadik formdadır (vakaların %90'ı)2. Hücre dışı otonom mekanizmaların, öncelikle glial hücrelerin temel rolü nedeniyle ALS patofizyolojisine katkıda bulunduğu iyi bilinmektedir3. ALS ayrıca inflamasyonun humoral ve hücresel faktörlerinin tutulumu olan nöroinflamatuar bir hastalık olarak da karakterizedir.

İmmünoglobulin G, ALS ve diğer nörodejeneratif hastalıklarda moleküler bir belirteç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu belirtecin serum seviyesinin incelenmesi, hastalıkta nöroinflamasyonun varlığını ve evresinigösterebilir 4,5,6, beyin omurilik sıvısındaki varlığı ise kan beyin bariyerinin ihlalini gösterebilir 7. IgG'ler ayrıca ALS hastalarının omurilik motor nöronlarında birikintiler olarak tanımlandı7. Bununla birlikte, bu yaklaşım IgG düzeyinin hastalığın evresi ve özellikleri ile korelasyonunda bazı tutarsızlıklar göstermiştir6.

ALS hastalarının serumlarından izole edilen IgG (ALS IgG), naif astrositlerde8 ve nöronlarda glutamat salınımında kalsiyum yanıtı indükleyebilir ve bu da ALS patolojisi9'un bir işareti olan eksitotoksik bir etkiye işaret eder. Bununla birlikte, hSOD1G93A ALS sıçan modeli üzerine yapılan çalışmalar (insan SOD1 mutasyonu10'un birden fazla kopyasını içeren), kültürlenmiş nöroglial hücrelerde11, dokularda 12,13,14 veya canlı hayvanlarda oksidatif stresin bir dizi belirtecini göstermiştir 13. ALS sıçan modelinden kültürlenen astrositlerin, peroksit tarafından indüklenen oksidatif strese, transgenik olmayan çöp arkadaşlarından gelen astrogliadan daha yatkın olmaları dikkat çekicidir11.

Kültürdeki mikroglial hücreler ALS IgG'den daha az belirgin bir şekilde etkilenir. Yani, bir BV-2 mikroglial hücre hattı, sadece 4/11 ALS IgG hasta örneklerinin uygulanmasına yanıt olarak oksidatif stresin floresan belirteçlerinden gelen sinyalde bir artış gösterdi15. Mikroglia'nın birçok nöroinflamatuar patolojiye katıldığı, ALS16,17'nin hücre dışı otonom mekanizmasında oksidatif strese ve geç progresyon fazına katkıda bulunduğu iyi bilinmektedir. Bununla birlikte, ALS IgGs ile ilgili veriler, bu hücrelerin ALS iltihabının bu humoral faktörlerine astrositler kadar reaktif olmayabileceğini göstermiştir. ALS murin modellerinden primer astrositlerle, sadece yavrularda değil, aynı zamanda semptomatik hayvanlarda, beyinde veya omurilikte 18,19,20,21 üzerinde çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Bu aynı zamanda mikroglial primer kültürler için de geçerlidir, ancak astrositlerden daha az ölçüde ve çoğunlukla embriyonik aşamadaki beyin bölgelerinden22,23,24.

Kültürdeki hücreler üzerinde Ca2 + 'nın hızlandırılmış video görüntülemesini, öncelikle eksitotoksisitenin fizyolojik bir belirteci olarak bu iyonun hücre içi geçicilerini takip etmenin bir aracı olarak kullanıyoruz. Böylece, bu geçicilerin biyofiziksel karakterizasyonu ile (genlik, geçici altındaki alan, yükselme zamanı, frekans) araştırmacı, nörodejenerasyonun çeşitli hücresel modellerinden deneysel tanı parametreleri elde edebilir. Bu nedenle bu teknik, IgG'lerin hastalık biyobelirteçleri olarak kantitatif fizyolojik değerlendirmesinin bir avantajını sunar. ALS indüksiyonunda IgGs ve Ca2+'nın rolü hakkında geniş bir literatür bulunmaktadır. Bu çalışmaların çoğu, hasta IgG'leri deney hayvanlarına 25,26,27,28,29 enjekte ederek ALS'yi indükleyerek gerçekleştirildi ve daha sonra hücre içi Ca 2+ yükselmesi ve IgG birikintileri görüldü. Bir dizi çalışma, ALS IgG'lerin in vitro30,31,32 motor sinaps üzerindeki etkisini araştırdı. Yukarıdaki bağlamda, burada sunulan teknik, ALS'nin hücre dışı otonom mekanizmasında önemli oyuncular olarak glial hücrelere odaklanmakta ve nöroinflamasyonun humoral faktörleri olarak IgG'lere potansiyel eksitotoksik yanıtlarını ölçmektedir. Bu yaklaşım, farklı hücre kültürü sistemlerinde ve genel inflamasyonun hücresel modellerinde bütün serumlar, BOS veya sitokinler gibi diğer humoral faktörlerin test edilmesinde daha geniş bir uygulamaya sahip olabilir.

Bu yazıda, Sprague Dawley sıçanlarının kortekslerinden glial hücrelerin, astrositlerin ve mikrogliaların birincil kültürlerinin nasıl hazırlanacağı ve bu hücrelerin hasta sera kaynaklı IgG ile ALS patofizyolojisini incelemek için nasıl daha fazla kullanılacağı açıklanmaktadır. Protokoller, kültürlenmiş hücrelerin boya yüklenmesi (Şekil 1) ve hızlandırılmış video görüntüleme deneylerinde Ca2+ değişikliklerinin kayıtları için detaylandırılmıştır. Video kayıtlarının örnekleri, glial hücrelerin ALS IgG'ye ATP'ye kıyasla nasıl tepki verdiğini gösterecektir, ikincisi pürinerjik membran reseptörlerini aktive eder. İlk kez gösterilen, hSOD1G93A ALS sıçan beyninden izole edilen astrositlerin, transgenik olmayan kontrollere kıyasla ALS IgG'ye daha belirgin bir Ca2+ yanıtı ile nasıl tepki verdiğine ve bu sürecin Ca2 + depo operasyonundaki farklılıklarla nasıl ilişkilendirileceğine dair bir örnektir. Ayrıca, ALS IgG ile akut olarak meydan okuyan mikroglial hücrelerde, hücre içi kalsiyumun sadece mütevazı bir cevabı ile kalsiyum görüntülemenin bir örneği gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler, hayvanların bilimsel amaçlarla korunmasına ilişkin AB direktiflerine uygun olarak ve Belgrad Üniversitesi Biyoloji Fakültesi Etik Komisyonu'nun izniyle (onay numarası EK-BF-2016/08) gerçekleştirilmiştir. Hasta materyali (IgG'ler için serum) ile ilgili olarak, insanları içeren deneyler için Dünya Tabipler Birliği Etik Kurallarına (Helsinki Deklarasyonu) uygun olarak bilgilendirilmiş hastanın rızası ile rutin klinik muayene için toplanmıştır. Protokol, Sırbistan Klinik Merkezi Etik Kurulu (No. 850/6) tarafından onaylanmıştır.

1. Birincil hücre kültürü hazırlığı

  1. Beyin dokusu izolasyonu
    NOT: İzolasyon, buz gibi soğuk çözeltiler kullanılarak buz üzerinde yapılmalıdır.
    1. Primer yenidoğan hücre kültürü 33 için1-3 günlük yenidoğan yavruları kullanın.
      NOT: Burada sunulan çalışmada Sprague Dawley hSOD1G93A ve transgenik olmayan sıçanlar kullanılmıştır. Genotipleme için, daha sonra DNA ekstraksiyonu ve PCR için sıçan kuyrukları kullanıldı.
    2. Yavrunun kafasına% 70 etanol serpin ve makas kullanarak hemen hızlı bir şekilde kafasını kesin.
    3. Kafatasını ortaya çıkarmak için küçük açılı makas kullanarak cildi kesin. Foramen magnumundan yörüngelere doğru bir kesim yaparak kafatasını açın. Ardından, dik bir orta hat kesimi yapın. Beyni kafatasından çıkarın ve fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir Petri kabına yerleştirin.
      NOT: Transgenik ve transgenik olmayan yavrular arasındaki çapraz kontaminasyonu önlemek için yavrular arasındaki aletleri temizleyin. Kortiklerin beynin geri kalanından izolasyonu bir stereomikroskop altında yapılmalıdır.
    4. Forsepslerin ucunu kullanarak, her iki yarım küre arasındaki bağlantıları yırtın. Ardından, bir yarımküreyi merkezden yana doğru hafifçe iterek yarım küreleri kavisli forseps ile ayırın.
    5. Meninksleri düz ve kavisli forsepslerle dikkatlice yırtarak çıkarın.
    6. Hipokampüsü kavisli bir forseps ile sıkıştırarak çıkarın. Hipokampüsü atın veya başka bir hücre kültürü hazırlığı için kullanın.
      NOT: Steril koşulları sağlamak için laminer akış başlığı altında başka adımlar da gerçekleştirilmelidir.
  2. Doku homojenizasyonu ve ayrışması
    1. Bir korteksi 3 mL soğuk PBS ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Süspansiyonu 1 mL'lik bir uçla yukarı ve aşağı doğru pipetleyin, süspansiyon homojen hale gelene kadar 10-15 vuruşu tamamlayın.
      NOT: Bu süreçte kabarcık üretmemek için çok dikkatli olun.
    2. 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve peleti 1 mL'lik bir uçla yukarı ve aşağı pipetleyerek 3 mL soğuk PBS'de yeniden askıya alın. Santrifüjleme adımını tekrarlayın.
      NOT: Bu noktadan itibaren kullanılan tüm çözeltiler 37 °C'ye kadar ısıtılmalıdır.
    3. Süpernatantı atın ve peleti,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotikler (penisilin ve streptomisin) ile desteklenmiş 2 mL'lik tam Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (DMEM) geri koyun. Homojenatı 2 mL'lik bir tüpe aktarın.
    4. Tek hücrelerin süspansiyonunu yapmak için homojenatı 21 G ve 23 G iğnelerden (her biri üç kez) geçirin.
      NOT: Bu süreçte kabarcık üretmemek için çok dikkatli olun.
  3. Bir korteksten hazırlanan hücre süspansiyonunu, 3 mL tam DMEM içeren 60 mm çapında bir Petri kabına veya bir T25 şişesine (yüzey yapışkan hücrelerin büyümesi için bir polipeptit kaplama ile önceden işlenmiş) dökün. Petri kabını hafifçe sallayın, böylece süspansiyon eşit olarak dağıtılır.
  4. İnkübatördeki hücreleri, 37 ° C'de% 5 CO2/95% havanın nemlendirilmiş bir atmosferinde büyütün.
  5. İzolasyondan 48 saat sonra ortamı değiştirin ve ortamı her 3 günde bir değiştirin.
  6. Astrosit büyümesini teşvik etmek için, hücreler% 70 -% 80 akıcılığa ulaştığında, gevşek bir şekilde bağlanmış glial hücreleri ve ortamdaki FBS izlerini çıkarmak için önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.
    1. 1 mL önceden ısıtılmış tripsin çözeltisi (% 0.25 tripsin,% 0.02 PBS'de% 0.02 EDTA, steril filtrelenmiş) ekleyerek astrositlerin altta yatan tabakasını tripsinize edin.
    2. Çanağı inkübatöre 2-5 dakika boyunca 37 ° C'de yerleştirin.
    3. Mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin. Ayrılmaya başladıklarında, 4 mL tam DMEM ekleyin.
    4. Hücre süspansiyonunu toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj.
    5. Süpernatantı atın ve peleti 1 mL tam ortamda yeniden askıya alın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
    6. Hücreleri, 5 mL'lik taze tam DMEM'de 104 hücre /cm2 yoğunluğunda yeniden hazırlayın.
  7. Ortamı her 3 günde bir değiştirin. Diğer glial hücre tiplerinin varlığını en aza indirmek için, astrositler% 50 birleşime ulaştıktan sonra ve her ortam değişiminden önce, hücreleri tam DMEM ile yıkayın.
    1. Süpernatant ortamı 1 mL'lik bir pipetle aspire edin ve birkaç kez yavaşça hücre tabakasına dağıtın. Bu yıkama adımı sırasında hücre tabakasının tüm yüzeyinin kaplandığından emin olun.
  8. Hücreler% 80 birleşime ulaştığında (genellikle 14 gün sonra), tripsinizasyonu ve astrositlerin toplanmasını adım 1.6'da açıklandığı gibi tekrarlayın.
  9. Tohum 5 × poli-L-lizin (50 μg / mL) ile kaplanmış 7 mm'lik dairesel cam kapak kapağı üzerinde astrositlerin 103'ü . Bunları 48 saat sonra deneylerde kullanın.
  10. Mikroglia'yı teşvik etmek için, adım 1.7'den sonra, glial hücrelerin akıcı bir tabaka34'e ulaşmasına izin verin. Mikroglial hücreler astrosit tabakasının üstünde göründüğünde (10-15 gün sonra, daha küçük, daha oval gövdeleri ve daha kısa süreçleri tarafından tanınan), Petri kabını 220 rpm'de 2 saat boyunca yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.
  11. Mikroglial hücrelerin dağıtılması ve tohumlanması
    1. Süpernatant ortamı 1 mL'lik bir pipet ucuyla aspire ederek ayrılan ve gevşek bir şekilde bağlanmış hücreleri hafifçe yıkayın ve birkaç kez yavaşça hücre tabakasına dağıtın. Bu yıkama adımı sırasında hücre tabakasının tüm yüzeyini kapladığınızdan emin olun, ortamı ayrılmış hücrelerle toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
    2. 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj. Süpernatantı atın ve peleti 1 mL ortamda yeniden askıya alın.
    3. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücre süspansiyonunu 21 G'lik bir iğneden geçirin.
      NOT: Yayınlanan yöntemlerin çoğu, dokuyu ayırmak için tripsin veya papain kullanır; Bununla birlikte, 21 G iğneleri, hücrelerin aşırı sindirimini önleme avantajına sahiptir ve daha yumuşak bir ayrışmaya izin verir.
    4. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Tohum 5 × poli-L-lizin (50 μg / mL) ile kaplanmış 7 mm'lik dairesel cam kapak kapağı üzerinde 103 mikroglial hücre. Bunları 48 saat sonra deneylerde kullanın.
      NOT: Sallanarak saf bir mikroglial kültür elde etmek zordur, çünkü oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositler, deneycinin deneyimine bağlı olarak hala değişken bir sayıda mevcut olabilir. Glial kültürlerde farklı hücre popülasyonlarının varlığını tahmin etmek için kullanılan immünositokimyasal protokol başka bir yerde tanımlanmıştır35.

2. İmmünositokimya

  1. Kapak kapakları üzerine kaplanmış hücreleri PBS'de durulayın, 2 x 1 dakika.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
  3. PBS 3 x 5 dakika içinde yıkayın.
  4. RT'de 45 dakika boyunca% 10 normal eşek serumu (NDS) / % 1 sığır serum albümini (BSA) / % 0.1 Triton X-100 içeren bir bloke edici çözeltide inkübe edin.
    1. 10 mm çaplı kapak kayması başına 50 μL blokaj çözeltisi ekleyin.
  5. Aşağıdaki seyreltmelerde birincil antikorları %1 NDS/%1 BSA/%0,1 TritonX-100'de hazırlayın: fare anti-GFAP 1:300, keçi anti-Iba1 1:500. Hücreleri birincil antikorlarla gece boyunca +4 ° C'de inkübe edin.
  6. PBS'de durulayın, 3 x 10 dk.
  7. Bir florofor ile konjuge edilmiş ikincil antikorlarla inkübe edin: eşek anti-fare (uyarma 488 nm [1:200)) veya eşek anti-keçi (647 nm [1:200)). Karanlıkta RT'de hücreleri 2 saat boyunca inkübe edin.
  8. PBS'de yıkayın, 7 x 5 dakika.
  9. RT'de 10 dakika boyunca hücreleri 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:4,000) ile inkübe edin.
  10. PBS 5 x 5 dk.
  11. Kapak kapaklarını bir montaj çözeltisi kullanarak mikroskop slaytlarına monte edin; kapak kapağı başına bir damla kullanın.
    NOT: Antikor seyreltmeleri üreticiye bağlı olarak değişebilir. Kullanıcılar deneyleri için en uygun seyreltmeleri belirlemelidir.

3. Hızlandırılmış video görüntüleme

NOT: Floresan boyayı içeren çözeltiler doğrudan ışıktan korunmalıdır. Görüntüleme deneyine başlamadan önce, perfüzyonu açarken cam kapak kaymasının hareket etmediğinden emin olun.

  1. Çözeltilerin ve hücrelerin hazırlanması
    1. Görüntüleme için hücre dışı çözelti (ECS) hazırlayın: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glukoz ve 10 mM HEPES. PH'ı 7,4'e ayarlayın. Ozmolaritenin 280-300 mOsm/kg olduğundan emin olun ve Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glukoz, 10 mM HEPES ve 0,1 mM EGTA olmadan ECS hazırlayın.
    2. Test çözeltilerini hazırlayın: ECS'de çözünmüş 100 μM ATP, Ca2+ içermeyen ECS'de 1 μM Thg ve ECS 8'de 0.1 mg/mL ALSIgG.
    3. DMEM'in tamamını yıkamak için bir kapak kapağını ECS'li bir kaba aktarın. ECS ile 1 mM stok Fluo-4 stok çözeltisini 5 μM Fluo-4 nihai konsantrasyonuna kadar seyrelterek boya yükleme çözeltisini hazırlayın.
      1. Kapaklı kapağı karanlıkta RT'de 30 dakika boyunca boya yükleme çözeltisine hücrelerle birlikte yerleştirin. ECS'deki hücreleri 20 dakika yıkayın.
    4. Hücreler yeterince yüklenmemişse (yani, bazal floresan seviyesi, 400 ms'den fazla pozlama süresine sahip kameranın dinamik aralığının% <5'i kadar düşükse), yükleme süresini 37 ° C'de 45 dakikaya 1 saate kadar artırın. Alternatif olarak, ECS'de seyreltmeden önce Fluo-4 stok çözeltisini DMSO'da eşit hacimde% 20 (w / v) deterjan (Pluronik) ile karıştırın ve son Pluronik konsantrasyonu ~% 0.02 yapın.
      NOT: Bu çalışmanın deneysel örnekleri, daha önce tarif edildiği gibi ALS hastalarının kan serumlarından izole edilen insan IgG'si ile gerçekleştirilmiştir 4,5,11. Her deney tek bir hastanın IgG örnekleri ile yapıldı.
  2. Video görüntüleme
    NOT: Bu protokolde, Video Görüntüleme Sistemi bir ksenon kısa ark lambası, bir polikromatör sistemi ve su, gliserin ve yağ daldırma hedefi ile donatılmış ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskop ile birleştirilmiştir. Timelapse görüntüleme bir Dijital Kamera Sistemi kullanılarak gerçekleştirildi.
    1. Sistemin çalışma sıcaklığına ulaşmasını sağlamak için deneyden 15 dakika önce görüntüleme kurulumunun bileşenlerini açın.
    2. Kapak kapağını 1 mL çalışma çözeltisi (Ca2+ olmadan ECS veya ECS) ile kayıt odasına yerleştirin.
    3. Doğru görüntüleme protokolünü seçmek için görüntüleme yazılımını açın ve Edinme panelinde, 480 nm'de uyarma dalga boyu, 505 nm'de dikroik ayna ve 535 nm'de emisyon dalga boyuna sahip Fluo4-filtre çiftlerini seçin.
    4. Deneme boyunca tutarlı sayıda hücreye sahip olmaya dikkat ederek görüş alanını seçin. Maruz kalma süresini ve dedektör kazancını, sinyalin doygun olmayacağı şekilde uygun şekilde ayarlayın. Elde etmek için pseudocolor modunu seçin. Daha ayrıntılı yönergeler için, üretici tarafından sağlanan el kitabına bakın.
    5. Örnekleme hızını 1 Hz'e (saniyede 1 kare) ayarlayın.
    6. Temel belirleme (F0) için 3-5 dakika boyunca bazal floresan seviyesini elde ederek görüntülemeye başlayın. Çalışma çözümünün sürekli akışını sağlayın.
    7. Çalışma çözümünün akışını durdurun ve istenen süre boyunca test çözümüne geçin (ayrıca Şekil 2 ve Şekil 3 örneklerindeki zaman çubuklarına bakın). Her test çözeltisi arasında, hücreleri 3-5 dakika boyunca çalışma çözeltisinin sabit bir akışıyla yıkayın.
    8. Çözeltinin üstünden sabit bir emme ayarlayarak kayıt odasındaki çözelti hacmini ~1 mL'de tutun (bkz. Şekil 2E).
      NOT: İşlemi doğrudan görüntülenen hücrelere uygulamak için, bir cam pipetten (0,8 mm iç çap) yapılmış özelleştirilmiş bir dağıtım sistemi, sıkıştırma valfleri ve bir elektronik valf kontrolörü içeren çözelti değişim sistemi ile birlikte 45°'lik bir açıyla ~350 μm uzağa ve hücrelerin ~1 mm yukarısına yerleştirilmiştir (bkz. Şekil 2E).

4. Veri analizi

  1. Tek tek hücreye karşılık gelen bir ilgi bölgesi (ROI) tanımlayın.
    1. En yüksek sinyal yoğunluğuna sahip çerçeveyi seçin (yani, ATP uygulamasından) ve Poligonal Araç uygulamasını kullanarak bir hücreyi çevreleyin. Edinilen alandaki tüm hücreler için tekrarlayın. Daire Aracı'nı kullanarak arka planda beş YG seçin.
    2. Tek bir hücrenin ortalama sinyal yoğunluğunu ve her zaman diliminin arka planını ölçmek için tüm YG'leri seçin ve ImageJ'deki ROI Manager'da Çoklu Ölçüm komutunu veya ticari yazılımlardaki eşdeğer bir komutu kullanın (bkz.
  2. Yatırım getirilerinin ortalama sinyal yoğunluğu değerlerini bir elektronik tablo olarak dışa aktarın.
  3. Ortalama beş arka plan yatırım getirisidir ve her karenin ortalama arka planını, aynı anda elde edilen çerçevenin ortalama YG yoğunluğundan çıkarın.
  4. Elde edilen verileri temel sinyale normalleştirmek için denklem (1) kullanın:
    ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
    burada F, arka plan çıkarma işleminden sonra her zaman diliminin sinyal yoğunluğudur ve F0 , temel Fluo-4 floresansıdır.
    NOT: Bu çalışmada kişiye özel bir kod kullanılmıştır.
  5. Kalsiyum aktivitesini analiz etmek için, birkaç parametreyi belirleyin4: kalsiyum zirvesinin genliği (ΔF / F 0), kalsiyum geçicisinin entegre değişimi (zaman integrali, yanıt kaydı altındaki yüzey) (ΔF / F 0 × s), stimülasyonun başlangıcından maksimum kalsiyum geçici (s) değerine kadar geçen zirveye kadar geçen süre, stimülasyonun başlangıcından ΔF / F 0 değerine kadar geçen artış süresi maksimum genlik (ler) in% 50 -% 80'ine, yarı maksimum genlikte (s) geçici bir genliğin yarı genişliği-tam genişliğine, tekrarlayan ise yanıt sıklığına (Hz) ulaşır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kültürde farklı glial hücre tiplerinin karakterizasyonu
Deneyler için astrositlerin üretilmesi genellikle 15-21 gün sürerken, mikroglial hücrelerin büyümesi 10-15 gün sürer. Kültürün hücre saflığını değerlendirmek için immün boyama yapıldı. Şekil 1 , astrositik işaretleyici GFAP ve mikroglial işaretleyici Iba1'in ilgili kültürlerdeki çift etiketleme ekspresyonunu göstermektedir.

Kalsiyum görüntülemenin sağlıklı ve hastalıklı astrositlerin hücre...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda, sıçan hSOD1G93A modelinde ALS gibi hücre (pato) fizyolojisinin farklı yönlerini incelemek için hızlı ve "bütçeye uygun" bir araç olarak birincil hücre kültürleme yöntemi sunulmaktadır. Bu nedenle teknik, daha yüksek bir organizasyon seviyesinde (yani, doku dilimlerinde veya canlı bir hayvanda) ekstrapolasyon yapılabilen ve daha fazla araştırılabilen tek hücre seviyesindeki çalışmalar için uygundur. Bununla birlikte, bir teknik olarak hücre kültürlemenin birkaç uyarısı vardır. Beyin dokusu izolasyonu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Sırbistan Eğitim Bilim ve Teknolojik Kalkınma Bakanlığı Sözleşmesi No. 451-03-9/2021-14/ 200178, MDBF - NENS Eğitim ve Öğretim Kümesi projesi "Nöroinflamasyonda Glia Üzerine Üçlü Kurs" ve EC H2020 MSCA RISE hibe #778405 tarafından desteklenmiştir. İmmünohistokimya görüntülerini sağladıkları için Marija Adžić ve Mina Perić'e ve kağıt yazımında yardımcı oldukları için Danijela Bataveljić'e teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL tüpSarstedt, Almanya62 554 502
2 mL tüpSarstedt, Almanya72.691
21 G iğneNipro, JaponyaHN-2138-ET
23 G iğneNipro, JaponyaHN-2338-ET
5 mL şırıngaNipro, JaponyaSY3-5SC-EC
6 mm dairesel cam lamelMenzel Glasser, Almanya630-2113
60 mm Petri kabıThermoFisher Sientific, ABD130181
ATPSigma-Aldrich, AlmanyaA9062
AxioObserver A1Carl Zeiss, Almanya
Sığır serum albüminiSigma-Aldrich, AlmanyaB6917
Kalsiyum klorürSigma-Aldrich, Almanya2110
SantrifüjEppendorf, Almanya
DAPISigma-Aldrich, Almanya10236276001
D-glukozSigma-Aldrich, Almanya158968
DMEMSigma-Aldrich, AlmanyaD5648
Eşek anti keçi AlexaFluor 647 IgG antikoruInvitrogen, ABDA-21447
Eşek karşıtı fare AlexaFluor 488 IgG antikoruInvitrogen, ABDA-21202
EDTASigma-Aldrich, AlmanyaEDS-100G
EGTASigma-Aldrich, AlmanyaE4378
" evolve"-EM 512 Dijital Kamera SistemiFotometri, ABD
Fetal sığır serumu (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific, ABD10500064
Fiji ImageJ YazılımıGNU Genel Kamu Lisansı
FITC filtre setiChroma Technology Inc., ABD
Fluo-4Moleküler Problar, ABDF14201
Keçi anti-Iba1Fujifilm Wako Chemicals, ABD011-27991
HEPESBiowest, FransaP5455
Yüksek Hızlı Çözüm Değişim SistemiALA Scientific Instruments, ABD
İnkübatörMemmert GmbH + Co. KG, Almanya
Magnezyum klorürSigma-Aldrich, AlmanyaM2393
Matlab yazılımıMath Works, ABD
Fare anti-GFAPMerck Millipore, ABDMAB360
Mowiol 40-88Sigma-Aldrich, Almanya324590
Normal eşek serumuSigma-Aldrich, AlmanyaD9663
ParaformaldehitSigma-Aldrich, Almanya158127
Penisilin ve StreptomisinThermoFisher Sientific, ABD15140122
Poli-L-lizinSigma-Aldrich, AlmanyaP5899
Potasyum klorürSigma-Aldrich, AlmanyaP5405
Potasyum dihidrojen fosfatCarlo Erba Reaktifleri, İspanya471686
Çalkalayıcı DELFIA PlateShakePerkinElmer Yaşam Bilimleri, ABD
Sodyum bikarbonatSigma-Aldrich, AlmanyaS3817
Sodyum klorürSigma-Aldrich, AlmanyaS5886
Sodyum fosfat dibazik heptahidratCarl ROTH GmbHX987.2
Sodyum piruvatSigma-Aldrich, AlmanyaP5280
ThapsigargineTocris Bioscience, İngiltere1138
Triton X - 100Sigma-Aldrich, AlmanyaT8787
TripsinSigma-Aldrich, AlmanyaT4799
Vapro Buhar Basıncı Ozmometresi 5520Wescor, ELITechGroup Inc., ABD
ViiFluor Görüntüleme SistemiVisitron System Gmbh, Almanya
VisiChrome PolikromatörSistemi Visitron System GmbH, Almanya
VisiView yüksek performanslı kurulumVisitron System Gmbh, Almanya
Xenon Kısa Ark lambasıUshio, Japonya
altında açık kaynak

Kaynaklar

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  3. Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957(2022).
  4. Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
  5. Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6(2009).
  6. Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710(2021).
  7. Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
  8. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
  9. Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
  10. Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
  11. Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
  12. Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
  13. Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
  14. Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
  15. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619(2017).
  16. Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
  17. Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  18. Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
  19. Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
  20. Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355(2021).
  21. Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209(2020).
  22. Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880(2019).
  23. Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
  24. Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
  25. Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
  26. Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121(2016).
  27. Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573(2019).
  28. Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
  29. Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
  30. Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
  31. Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
  32. Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
  33. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  34. Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100(2020).
  35. Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
  36. Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
  37. Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
  38. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079(2013).
  39. Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
  40. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198(2020).
  41. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
  42. Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
  43. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Primer Astrosit K lt rMikroglia K lt rKalsiyum G r nt lemeGlial H cre zolasyonuhSOD1G93A Modelimm nositokimyaGFAP Mark rIba1 Mark rFluo 4 AM Boyas
Sıçan Astrositleri ve Mikroglia'nın Birincil Kültürleri ve Amiyotrofik Lateral Skleroz Çalışmalarında Kullanımları
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.