Yöntem makalesi

Darbe Genliği Modülasyonlu Klorofil Florometrisi Kullanılarak Mahsullerde Fotokimyasal Olmayan Söndürmenin Yüksek Verimli Analizi

DOI:

10.3791/63485

⸱

6 Temmuz 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Plant Biology, Morrill Hall, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Environmental Plant Physiology group, Department of Plant Sciences, University of Cambridge

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, fotokimyasal olmayan söndürmenin gevşemesini darbe genliği modülasyonlu klorofil florometri ile ölçmek için yüksek verimli bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, tarlada yetiştirilen Glisin max'a uygulanır ve genetik çeşitliliği veya üreme popülasyonlarını taramak için diğer türlere uyarlanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotosentez, modern mahsul çeşitlerinde optimize edilmemiştir ve bu nedenle iyileştirme için bir fırsat sağlar. Fotokimyasal olmayan söndürmenin (NPQ) gevşemesini hızlandırmanın, fotosentetik performansı artırmak için etkili bir strateji olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, gelişmiş NPQ için üreme potansiyeli ve NPQ gevşemesinin genetik temelinin tam olarak anlaşılması, tarlada yetiştirilen mahsul bitkilerinden aşırı örnekleme ve veri toplama sınırlamaları nedeniyle eksiktir. Önceki raporlara dayanarak, nabız genliği modülasyonlu (PAM) klorofil florometrisi kullanılarak Glisin max'taki (soya fasulyesi) NPQ gevşeme oranlarının analizi için yüksek verimli bir test sunuyoruz. Yaprak diskleri, NPQ gevşemesinin kapalı bir PAM-florometrede ölçüldüğü bir laboratuvara taşınmadan önce tarlada yetiştirilen soya fasulyesinden örneklenir. NPQ gevşeme parametreleri, yüksek ışıktan düşük ışığa geçişi takiben ölçülen NPQ değerlerine iki üstel bir fonksiyon takılarak hesaplanır. Bu yöntemi kullanarak, bir gün içinde yüzlerce genotipi test etmek mümkündür. Prosedür, NPQ gevşemesindeki varyasyon için mutant ve çeşitlilik panellerini tarama potansiyeline sahiptir ve bu nedenle hem temel hem de uygulamalı araştırma sorularına uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotosentez, ışık emilimi, birincil elektron transferi, enerji stabilizasyonu ve fotosentetik ürünlerin sentezi ve taşınmasından oluşur1. Her adımı anlamak, mahsulün fotosentetik verimliliğini artırma çabalarına rehberlik etmek için hayati öneme sahiptir. Işık, fotosentez hızını etkiler, fotonlar şeklinde dengeleyici enerji arzı gerektirir ve eşdeğerleri azaltma talebi vardır. Arz talebi aştığında, örneğin yüksek ışık altında veya stoma kapanmasının neden olduğu azaltılmış CO2 fiksasyonu sırasında, indirgeyici gücün birikmesi, fotosentetik cihaza zarar verme ve elektron taşınımını bozma potansiyeli olan reaktif oksijen türlerinin oluşma olasılığını artırır. Bu nedenle, hasarı önlemek için, bitkiler reaktif oksijen türlerinin detoksifikasyonu ve uyarılmış klorofil durumlarının (NPQ) fotokimyasal olmayan söndürülmesi de dahil olmak üzere çeşitli foto-koruyucu mekanizmalar geliştirmiştir.

Yüksek fotosentez oranlarını korumak, bir saha ortamında zordur. Mevsimsel ve günlük değişiklikler, rüzgara bağlı yaprak hareketleri ve geçici bulut örtüsü gibi çevresel dalgalanmalarla birlikte, bitkiler tarafından fotosentez için alınan ışığın miktarında ve yoğunluğunda kaymalara neden olur3. NPQ, aşırı ışık enerjisini dağıtır ve yüksek ışıkta4'te sürekli fotosentez oranlarına izin verirken foto-hasarı önlemeye yardımcı olabilir. Bununla birlikte, yüksek ila düşük ışık geçişleri sırasında uzun süreli NPQ, karbon azaltma5 için kullanılabilecek enerjiyi dağıtmaya devam ediyor. Sonuç olarak, NPQ'nun gevşemesini hızlandırmak, fotosentez6'nın verimliliğini artırabilir ve NPQ gevşemesini mahsul iyileştirme için çekici bir hedef haline getirebilir.

Ölçülebilir parametrelerden NPQ'yu hesaplamak için darbe genliği modülasyonlu klorofil floresan (PAM) analizi kullanılabilir (Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2) 7,8,9. Bu makale, germplazmadaki doğal varyasyonun taranması amacıyla tarlada yetiştirilen bitkilerde NPQ gevşeme oranlarının belirlenmesine odaklanmaktadır. Bununla birlikte, PAM klorofil florometri analizi, alglerden daha yüksek bitkilere kadar değişen türlere uygulanan çok çeşitli amaçlar için de kullanılabilir ve başka bir yerdegözden geçirilmiştir 7,8,9.

Koyu renkli uyarlanmış bir yaprak veya hücrede, fotosistem II (PSII) reaksiyon merkezleri elektron almak için açıktır ve NPQ yoktur. Düşük yoğunluklu bir ölçüm ışığını açmak, PSII üzerinden elektron taşınmasını önlerken klorofil floresansını ortaya çıkarır. Bu karanlık uyarlanmış durumda kaydedilen minimum floresan, F o parametresi ile tanımlanır. Koyu renkli uyarlanmış bir yaprağa yüksek yoğunluklu bir ışık darbesi uygulamak, kinon A bölgesine bağlı kinonların ilk kararlı elektron alıcı havuzunu hızla azaltabilir. Bu, PSII reaksiyon merkezlerinde elektron transfer kapasitesini geçici olarak bloke eder, daha sonra kapalı olduğu ve su bölünmesinden elektron alamadığı söylenir. Kısa bir nabız süresi kullanarak, NPQ'yu uyarmak için yeterli zaman yoktur. Elde edilen klorofil floresansı, NPQ veya maksimum floresan Fm yokluğunda elde edilebilecek maksimum değere eşdeğerdir. Minimal ve maksimum floresan arasındaki fark, değişken floresan, F v olarak adlandırılır. Fotosistem II'nin (F v / Fm) maksimum fotokimyasal kuantum verimi, aşağıdaki denklem kullanılarak bu iki parametreden hesaplanır:

Fv/F m = (F m-Fo)/F m

Bu, fotosistem fonksiyonunun ve stresin önemli bir göstergesi olabilir. Aktinik (fotosentetik) bir ışığın açılması, fotokimyasal olmayan söndürmeyi uyarır ve daha sonra doygun bir flaşın uygulanması, ışığa uyarlanmış maksimum floresan, Fm'nin ölçülmesine izin verir. Karanlık ve ışığa adapte maksimum floresan arasındaki farkı karşılaştırarak, NPQ Stern-Volmer denklemi10'a göre hesaplanabilir:

NPQ = F m/Fm' - 1

Daha yüksek tesislerde, NPQ, qE, qT, qZ, qI ve qH dahil olmak üzere en az beş farklı bileşenden oluşan olarak tanımlanmıştır. NPQ'da yer alan kesin mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır; Bununla birlikte, qE, çoğu bitkide NPQ'nun ana bileşeni olarak kabul edilir. qE'nin tam katılımı için kritik faktörlerin, tilakoid membran boyunca bir proton gradyanının birikmesini, fotosistem II alt birimi S11,12'nin aktivitesini ve de-epoksitlenmiş ksantofillerin, antheraksantinin, lutein ve özellikle zeaksantin13'ün aktivitesini içerdiği bulunmuştur. qE, herhangi bir NPQ bileşeninin en hızlısını gevşetir (< 2 dakika)14 ve qE'nin geri dönüşümlü aktivasyonu, değişen ışık yoğunluklarına uyum sağlamak için özellikle önemlidir. NPQ gevşemesinin ikinci bir yavaş aşaması (~ 2-30 dakika), hem durum geçişleriyle ilgili qT'yi hem de zeaksantinin violaksantin15'e dönüşümünü içeren qZ'yi kapsar. NPQ'nun yavaş gevşemesi (> 30 dakika), hem fotoinhibitör söndürme (qI)16 hem de bir plastid lipokalin proteini 19,20 tarafından aracılık edilen PSII'nin periferik antenlerinde sürekli söndürme olan qH gibi fotohasar17,18'den bağımsız süreçleri içerebilir.

NPQ, yüksek ışığa maruz kalma sırasında artar. Daha sonra düşük ışığa geçiş, NPQ'nun aşağı regülasyonuna neden olabilir. Hızlı, orta ve yavaş gevşeme fazlarının bozunumu, iki üstel fonksiyonun parametrelerinde yakalanabilir 15,21,22,23

NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3

Bi-üstel fonksiyonun teorik temeli, qE (Aq1), qZ ve qT'nin (Aq2) birleşik gevşemesi, karşılık gelen zaman sabitleri τq1 ve τq2 ve qI ve fotohasardan bağımsız süreçleri (Aq3) içeren uzun vadeli NPQ dahil olmak üzere varsayımsal söndürücülerin birinci dereceden kullanımı varsayımına dayanmaktadır. Bu nedenle, bi-üstel fonksiyon, klorofil floresansının söndürülmesinde yer alan çoklu bağlantılı biyolojik süreçlerin, teorik bir temelden yoksun olan daha basit bir Hill denklemine kıyasla daha gerçekçi bir temsilini sağlar24.

NPQ, basit el tipi cihazlardan27'den daha gelişmiş kapalı sistemlere28'e kadar piyasada bulunan çeşitli PAM florometreleri25,26 kullanılarak ölçülebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımların birçoğunun bir sınırlaması, birden fazla cihaz ve bir araştırmacı ekibi olmadan büyük bitki koleksiyonlarının taranmasını zorlaştıran nispeten düşük bir verimdir. Bu sorunu ele almak için, McAusland ve ark. eksize edilmiş yaprak dokusuna dayanan bir prosedür geliştirdi ve iki buğday çeşidi arasındaki klorofil floresansındaki farklılıkları tanımlamak için kullandı29. Bu yaklaşımın cazibesi, tek bir cihazla birden fazla bitkiden alınan görüntüleme yaprak disklerinin bir gün içinde yüzlerce genotipin taranmasını kolaylaştırabilmesidir. Bu, genom çapında ilişkilendirme çalışmalarının bir parçası olarak NPQ gevşemesindeki varyasyonun değerlendirilmesini veya mahsul fotosentetik verimliliğini ve nihayetinde verimi artırma potansiyeline sahip üreme popülasyonlarının taranmasını mümkün kılar.

McAusland ve ark.29'un bulgularına dayanarak, Glisin maksimumunda NPQ gevşeme oranlarının yüksek verimli bir şekilde taranması için yaprak disklerinin PAM klorofil floresan analizini kullanıyoruz (G.max; soya fasulyesi). Bu protokol, popüler FluorCam26 gibi ticari olarak temin edilebilen diğer kapalı PAM sistemleriyle karşılaştırılabilir olan CF Imager25'i kullanır. Örneklerin uyarlanması için karanlık bir oda ile kullanıcılar 96 kuyucuklu tabakları, Petri tabaklarını ve küçük bitkileri görüntüleyebilirler. Bu yaklaşımın en önemli avantajı, tek tek bitkilerin sıralı analizine kıyasla yaprak disklerin kullanılmasıyla sağlanan verimdeki artıştır. Burada temsili sonuçlar ve tarlada yetiştirilen bitkilerde NPQ'nun örneklenmesi, ölçülmesi ve analizi için bir yöntem sunulmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tohum ekimi

  1. Verimli, iyi drene edilmiş, ancak kumlu olmayan ve pH'ı yaklaşık 6.5 olan bir tarla alanı seçin. 1,2 m sıralı arazileri 0,75 m aralıkla zemini çapa ile puanlayarak işaretleyin.
  2. Toprak sıcaklıklarının 25 ila 30 °C arasında olduğu büyüme mevsiminin başlangıcında her bir arsa boyunca 3 cm derinlikte 50 tohum/m G.max cv. IA3023 ekin.
    NOT: Genetik çeşitliliğin taranması amacıyla, birden fazla farklı genotipin yetiştirilmesi ve karşılaştırılması beklenmektedir. Genotip başına 2-5 sıra rastgele blok şeklinde düzenlenmiş bitki. İklim koşullarının toprak tipi, sıcaklık ve gün uzunluğu dahil olmak üzere soya fasulyesinin büyümesine uygun olup olmadığı dikkate alınmalıdır.

2. Tarladan yaprak örneklerinin toplanması

  1. Çimlenmeden 30 gün sonra tarla sahasındaki bitkileri örnekleyin.
    NOT: 30 gün sonra soya fasulyesi bitkileri vejetatif fazda olacaktır. Örneklemeden önce çimlenmeden sonraki gün sayısı, ele alınan biyolojik soruya bağlıdır.
  2. 24 delikli bir plakanın kuyularını damıtılmış suyla 1/3'e kadar doldurun. Kapağı ve plakanın yan tarafını örneklenecek replikalarla etiketleyin.
  3. Örneklenecek bitkinin tepesindeki en genç tamamen genişletilmiş yaprağı seçin. Yaprağı lastik bir tıpaya karşı tutun.
  4. Bir #2 Humboldt mantar delicisine yapraktan bastırın ve midribden kaçınırken bir diski kesmek için bükün. Teknik çoğaltmalar için aynı yapraktan art arda 5 disk toplayın. Yaprak dokusunun taşıma sırasında veya örneklemeden zarar görmesi durumunda her bir arsa için gerekenden yaklaşık% 30 daha fazla yaprak diski alın.
    NOT: Biyolojik replikasyonların sayısı (araziler veya bitkiler) ve teknik replikaların sayısı (aynı bitki veya arsadan yaprak diskleri) deneysel tasarıma bağlı olarak değişebilir.
  5. Yaprak disklerini mantar deliciden dışarı pamuklu çubukla 24 delikli bir plakanın tek bir kuyucuğuna itin. Tüm yaprak disklerinin suda yüzdüğünü kontrol edin. Değilse, bir kuyunun kenarına yapışan yaprak disklerini pamuklu çubukla yüzer bir konuma yavaşça hareket ettirin.
  6. Sonraki çizime geçin ve 2,3 ile 2,5 arasındaki adımları yineleyin. Yaprak disklerini mantar deliciden çıkarıp pamuklu çubukla 24 delikli bir plakada ayrı bir kuyuya itin. Üçüncü bir biyolojik çoğaltma toplamak için bu adımı yineleyin.
  7. Tam bir 24 delikli plaka örneklenene kadar adım 2.6'yı tekrarlayın. Bir kapak yerleştirin ve yarı şeffaf, esnek bir filmle kapatın. Plakayı doğrudan güneş ışığından uzak, bir torbada, kutuda veya boş soğutucuda (buz yok) saklayın.

3. Numunelerin analiz için hazırlanması

  1. Örneklemeden sonra temiz bir laboratuvar alanına dönün. Taşıma sırasında kapağa yapışmış yaprak diskleri yerinden çıkarmak için kapalı plakanın kapağına dokunun. Filmi açın ve kapağı çıkarın.
  2. Bir yaprak diskini 24 delikli plakanın ilk konumundan taze bir 96 delikli plakaya aktarın, yaprak disk kuyunun dibinde düz bir şekilde bakacak şekilde.
  3. Bir burun aspiratörü filtresini ikiye bölün. Elde edilen filtreyi yarıya kadar suya batırın ve fazla sıvıyı gidermek için bir kağıt havluya batırın. Nemi korumak için filtreyi yaprak diskiyle kuyuya yerleştirin.
  4. 24 delikli plakanın ilk konumundan ikinci bir yaprak disk alın ve 96 delikli plakanın bir sonraki mevcut konumuna yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Adım 3.3'te üretilen burun filtresinin kalan yarısını suya batırın ve ikinci yaprak diskiyle kuyuya yerleştirmeden önce bir kağıt havluya batırın.
  5. 24 delikli plakanın ilk konumundan üçüncü bir yaprak disk için 3,3 ile 3,4 arasındaki adımları yineleyin.
  6. 24 delikli plakanın ikinci konumuna geçin ve 3,3 ila 3,5 arasındaki adımları tekrarlayın.
  7. Tüm kuyucuklarda yaprak diskleri ve burun aspiratörü filtreleri takılı olduğunda kapağı plakaya yerleştirin. Görüntüleme için plakayı karanlıkta yönlendirmeye yardımcı olması için sağ üst köşeyi bantlayın.
  8. Plakaları yarı şeffaf, esnek bir filmle kapatın ve plakayı alüminyum folyoya sarın. Arsa kimliklerini ve plaka kimliğini alüminyum folyo üzerine yazın.
  9. NPQ'nun ilk iki aşamasının (qE, qT, qZ) gevşemesine izin vermek için plakaları karanlık bir kutuya veya dolaba en az 30 dakika yerleştirin. NPQ'nun uzun vadeli fazları ilgi çekiciyse, görüntülemeden önce 1 saatlik daha uzun, karanlık bir kuluçka süresi kullanın.
  10. Analiz sırasında odaklanmak için ek bir kukla plaka hazırlayın. Bunu yapmak için, taze bir 96 delikli plakanın köşelerinin her birine ve ortasına bir yaprak disk yerleştirin. Yaprak disklerini önceki plakalarda olduğu gibi burun filtreleriyle sabitleyin. Plakayı kapatın ve karanlıkta oda sıcaklığında (24 ° C), ~% 50 bağıl nemde inkübe edin.

4. Klorofil floresan görüntüleyici kullanılarak fotokimyasal olmayan söndürmenin ölçülmesi

  1. Görüntüleyiciyi açın ve görüntüleme yazılımını açın. PAM deneysel protokolündeki adımların girilmesi için bir pencere açmak üzere Ayarlar > Protokolü'nü tıklatın. Makinenin teknik özellikleri Ek Tablo 3'te verilmiştir.
  2. Karanlık uyarlanmış fotosentezin maksimum kuantum verimliliğini ölçmek için doygun bir darbe ile programı başlatacak şekilde ayarlayın kutuya 20 s girerek: Bir gecikmeden sonra. Darbe Uygula kutusunu tıklayın ve kutuya 1 girin: Bu sayı.
  3. Darbe PPFD'sini 6152'ye, darbe uzunluğunu 800 ms'ye ayarlayın ve Tüm darbelerle F '& Fm' görüntüleri al kutusunu işaretleyin. Protokole ikinci bir adım eklemek için Sonra Ekle'yi tıklatın.
  4. Kutuya 30 s girin: Bir gecikmeden sonra. Aktiniği değiştir seçeneğini seçin ve kutuya 50 girin: Aktinik PPFD, odadaki ışık yoğunluğunu 50 PPFD'ye ayarlamak için.
  5. Protokole yeni bir adım eklemek için Sonra Ekle'yi tıklatın. Kutuya 150 s girin: Bir gecikmeden sonra, Darbe Uygula'yı seçin ve kutuya 4 girin: Bu sayı, her 150 saniyede bir ölçüm darbeleri uygulamak için, aktinik ışık 50 PPFD'de tutulurken üst üste 4x.
  6. Protokolün tam bilgileri Tablo 1'de verilmiştir, ışık yoğunluğunu değiştirmek için adım 4.2 ve 4.3'ü kullanın ve doygun darbelerin döngülerini girmek için adım 4.4 ve 4.5'i kullanın. Her adım için gecikmeyi ve ışık yoğunluğunu Tablo 1'de verilen değerlere göre ayarlayın. Protokolünüzü bilinen bir konuma .pcl dosyası olarak kaydedin.
  7. Işığı kapatın, kukla plakayı numune aşamasına yerleştirin ve numune sahne yüksekliğini, yaprak diskler cihazın tabanından 140 mm yukarıda olacak şekilde ayarlayın. Netleme sırasında plakaya tekrar tekrar ışık yanıp söneceği için kukla bir plaka kullanılır; bu, ölçülecek herhangi bir numunenin yeniden karanlık adaptasyonunu gerektirir ve fotohasara neden olabilir.
  8. Fotoğraf makinesini başlatmak için Görüntüleyici Kamera ve Donanım kamerasına Bağlan/Bağlantıyı Kes simgesini tıklatın. Tabanında iki yeşil çizgi bulunan kırmızı renkli iki taraflı ok simgesiyle temsil edilen Odak (Floresan) sembolünü tıklatın. Plakayı netlemeye getirmek için lensi ve pozlamayı ayarlayın.
  9. Yanıp sönen ışığı kapatmak için Netleme (floresan) simgesini tekrar tıklatın. Karanlıkta çalışırken, sahte plakayı analiz edilecek plaka ile değiştirin.
  10. Map Image kamera simgesini tıklatın. Açılır penceredeki çubuk yeşil bölgeye yerleştirilene kadar diyafram açıklığını açarak veya kapatarak görüntü pozlamasını ayarlayın.
  11. Diyafram açıklığının her ayarlanmasından sonra, pozlama doğru şekilde ayarlanana ve cihaz bir görüntü çekene kadar Yeniden Dene düğmesini tıklatın. Resme sağ tıklayın ve arka plan sinyallerini engellemek için Görüntü Yalıtımı Uygula'yı seçin. Odaklanmış yaprak alanı gri, arka plan mavi renkte görüntülenir.
  12. Görüntüyü değiştir açılır menüsünden histogram ve gama düzeyini ayarlayarak yalnızca yaprak diskleri içerecek alanı/pikselleri seçin.
  13. Resme sağ tıklayın ve açık mavi vurgulanan alanı silmek için Yüksek ve Düşük Kesimleri Sil'i (Renk Haritası) seçin. Resme sağ tıklayın ve en az üç diğer piksele dokunmayan pikselleri kaldırmak için Strays Sil'i (Ağır) seçin.
    NOT: Görüntüde yalıtılmış adalar olarak görünen tüm alanlar ayrı ayrı analiz edilecek ve nihai veri çıktısına dahil edilecektir. Görüntü yalıtımı ve başıboş piksellerin kaldırılması temiz ve anlaşılır verilerle sonuçlanır.
  14. Programı başlatmak için Protokolü Çalıştır simgesine tıklayın, ekranın altında protokolün ne kadar süre kaldığını bildiren bir zamanlayıcı görünecektir.
  15. Protokol bitene kadar bekleyin, Dosya > Farklı Kaydet'i tıklatın ve verileri .igr dosyası olarak kaydedin. Başka bir örnek plaka çalıştırmaya başlamadan önce pencerenin sağ üst köşesindeki kırmızı çarpı işaretine tıklayarak pencereyi kapatın.
  16. Dosya > Yeni'yi seçerek bir sonraki örnek için yeni bir dosya açın ve tüm plakalar ölçülene kadar 4.10 ile 4.15 arasındaki adımları yineleyin.
    NOT: Sirkadiyen düzenlemenin sonuçlar üzerindeki potansiyel etkisini en aza indirmek için plakaların 4 saat veya daha kısa bir süre içinde ölçülmesi önerilir.

5. Klorofil floresan verilerinin işlenmesi

  1. Görüntüleme yazılımında .igr dosyasını açın. Gerekli tüm dosyaları içeren yeni bir klasör oluşturmak için Dosya > Klasöre Aktar'ı tıklatarak verileri dışa aktarın.
  2. Aşağıdaki üç MATLAB dosyasını elde edilen klasöre kopyalayın: MapAndLabelDiscs.m (Ek Dosya 1), ProcessFoFm.m (Ek Dosya 2) ve ProcessNPQdata.m (Ek Dosya 3) ve R dosyası: create_file_to_process. R (Ek Dosya 4).
  3. MapAndLabelDiscs.m (Ek Dosya 1) dosyasını MATLAB'da açın ve çalıştırın. Açılır pencerede oluşturulan numaralı yaprak disklerin eşlemesini, daha sonra yaprak disk numaralandırmasını denetlemek için .png dosyası olarak kaydedin.
  4. MATLAB'da ProcessFoFm.m (Ek Dosya 2) dosyasını açın ve her yaprak disk için F o ve Fm değerlerini hesaplamak üzere çalıştırın. Her zaman noktasında NPQ değerlerini hesaplamak için ProcessNPQdata.m (Ek Dosya 3) dosyasını çalıştırın.
  5. Dosya create_file_to_process açın. Rstudio'da R (Ek Dosya 4) ve tarihi 5. satırdaki koda ekleyin. Plaka numarasını create_file_to_process'deki 8. satıra ekleyin.
  6. create_file_to_process çalıştırın. F v/F m değerlerini ve NPQ verilerini, -cf-summary.csv sonekiyle verilerden sonra adlandırılan tek bir dosyada birleştirmek için R. Adım 5.3'teki .png dosyasını kullanarak adım 5.5'teki cf-summary dosyasındaki yaprak disk numaralandırmasını denetleyin. Arsa numarası ve katılım ile ilgili eklenti bilgileri.
  7. CF-data-processing_2.R (Ek Dosya 5) R komut dosyasını açın ve 13. satırı çalışma dizini yoluna değiştirin. CF-data-processing_2.R'deki 16. satırı adım 5.5'ten dosyanın adıyla değiştirin.
  8. CF-data-processing_2.R'deki 48. satırı çıktı dosyasının adıyla değiştirin. Verileri eğri sığdırma için yeniden biçimlendirmek üzere CF-data-processing_2.R komut dosyasını çalıştırın.
  9. MATLAB'da MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (Ek Dosya 6) komut dosyasını açın ve satır 5'i adım 5.8'den çıktı dosyasının adıyla değiştirin. MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m'deki 85. satırı yeni bir çıktı dosyası adıyla değiştirin. NPQ gevşeme parametrelerini hesaplamak için komut dosyası MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m komutunu çalıştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1A, tarlada yetiştirilen soya fasulyesinde NPQ'nun tipik bir ölçümünü göstermektedir. Bitkiler 2021 yazında Urbana, IL'de (enlem 40.084604°, boylam -88.227952°) yetiştirildi ve tohumlar 5 Haziran'da ekildi. 2021. Yaprak diskler tohum ekiminden 30 gün sonra örneklenmiş ve sağlanan protokol ile ölçümler yapılmıştır (Tablo 1). Her yaprak disk için Fv/Fm ve NPQ değerleri hesaplandı (Ek Tablo 4) ve NPQ gevşeme parametreleri bi-üstel fonksi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaprak disklerin dikkatli seçimi ve kullanımı, NPQ'nun güvenilir ölçümlerini elde etmek için kritik öneme sahiptir. İlk olarak, cımbızla kaba kullanım gibi dokuya verilen hasar, strese neden olacak ve fotosentezin maksimum kuantum verimliliği için düşük değerlerle sonuçlanacaktır. Gerilmemiş bitkiler tipik olarak Fv / Fm değerlerine yaklaşık 0.8318'dir ve önemli düşüşler fotosentetik performansta bir azalmaya işaret eder9. Bununla bir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını bildirmektedir

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Bill & Melinda Gates Vakfı, Gıda ve Tarım Araştırmaları Vakfı ve İngiltere Dış, Milletler Topluluğu ve Kalkınma Ofisi tarafından OPP1172157 hibe numarası altında finanse edilen Artan Fotosentetik Verimliliği Gerçekleştirme (RIPE) araştırma projesi tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 kuyulu doku kültürü plakasıFisher ScientificFB012929Menşe Ülke: Amerika Birleşik Devletleri
96 kuyulu doku kültürü plakasıFisher ScientificFB012931Menşe Ülke: Amerika Birleşik Devletleri
Alüminyum folyoAntylia Scientific  61018-56Menşe Ülke: Amerika Birleşik Devletleri
Siyah işaretleyici kalemSharpieSAN30001Menşe Ülke: Amerika Birleşik Devletleri
CF görüntüleyiciTechnologica Ltd.N/Aklorofil floresan görüntüleyici
Menşe Ülke: Birleşik Krallık
Mantar delici, 7mmHumboldt Mfg CoH9665Menşe Ülke: Amerika Birleşik Devletleri
FluorImager V2.305 SoftwareTechnologica Ltd.N/Agörüntüleme yazılımı
Menşe Ülke: Birleşik Krallık
iHank-Nose 100'lü Paket Premium Burun Aspiratörü Hijyen FiltreleriAmazon  B07P6XCTGVMenşe Ülke: Amerika Birleşik Devletleri
Marker kazıklarıJohn Henry CompanyKN0151Menşe Ülke: Amerika Birleşik Devletleri
Kağıt makasVWR82027-596Menşe Ülke: Amerika Birleşik Devletleri
ParafilmBemis Company Inc.  S3-594-6Yarı saydam esnek film
Menşe Ülke: Amerika Birleşik Devletleri
Katı kauçuk tıpalarFisher Scientific14-130MMenşe Ülke: Amerika Birleşik Devletleri

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blankenship, R. E. Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2021).
  2. Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
  3. Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
  4. Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
  5. Zhu, X. -G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
  6. Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
  7. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
  8. Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
  9. Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
  10. Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
  11. Li, X. -P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
  12. Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
  13. Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
  14. Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
  15. Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
  16. Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
  17. Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
  18. Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
  19. Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
  20. Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
  21. Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221(2014).
  22. Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
  23. Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
  24. Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
  25. Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
  26. Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
  27. Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592(2016).
  28. Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
  29. McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109(2019).
  30. Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27(2008).
  31. Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
  32. Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
  33. Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
  34. Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
  35. Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Y ksek Kapasiteli TaramaNPQ Gev emesiSoya Fasulyesi FotosenteziYaprak Diski rneklemesiGenetik Varyasyon AnaliziTarlada Yeti tirilen MahsullerFotosentetik Performans

İlgili makaleler