Sıçanlarda Derin Hipotermik Dolaşım Tutuklamasının Kurulması

Derin hipotermik dolaşım durması (DHCA) 1953 yılından beri kalp cerrahisinde kullanılmaktadır¹_. DHCA, vücuda kan akışını küresel olarak kesmeden önce hastanın çekirdek sıcaklığını derin hipotermik seviyelere (15-22 ° C) düşürmeyi içerir². Dolaşım durması nispeten kansız bir çalışma alanı sağlayabilir. Derin hipotermi, özellikle beyinde ve miyokardda metabolizmayı azaltır, bu da iskemiye karşı etkili bir koruma yöntemidir³. DHCA, kompleks konjenital kalp hastalığı, aort ark hastalığı ve hatta vena kava trombüsü ^4,5 olan böbrek veya adrenal tümörler için yapılan ameliyatlar sırasında yaygın olarak uygulanır. Bu nedenle, DHCA hayvan modellerinin oluşturulması, prosedürün iyileştirilmesi ve klinik ortamlarda komplikasyonların önlenmesi için önemli bir referans sağlar.

Modeller köpekler⁶, tavşanlar⁷ ve diğer hayvanlarla kurulabilse de, çalışabilirlikleri ve düşük maliyetleri nedeniyle sıçanların kullanılması tercih edilir. DHCA sıçan modeli ilk kez 2006 yılında Jungwirth ve ^ark.8 tarafından tanımlanmıştır. Dolaşım durması süresinin nörolojik sonuçlar üzerinde etkili olduğu bulundu. O zamandan beri, DHCA sıçan modelleri geniş çapta araştırılmıştır. DHCA'nın sistemik inflamatuar yanıt sendromunu (SIRS)⁹ tetikleyebileceği açıklığa kavuşturulmuştur. Daha sonraki çalışmalarda, farmakologlar, SIRS tarafından indüklenen DHCA ile ilişkili nöroinflamasyonun resveratrol¹⁰ ve triptolid¹¹ ile zayıflatılabileceğini bulmuşlardır. Ekibimiz ayrıca, DHCA ile ilişkili nöroinflamasyonun, soğuk indüklenebilir RNA bağlayıcı protein^12'yi inhibe ederek zayıflatılabileceğini bulmuştur. Kardiyovasküler sistemde, süperoksit dismutaz, DHCA¹³ sırasında iskemi / reperfüzyon (I / R) yaralanmaları üzerinde kardiyoprotektif bir etkiye sahiptir. Bu sonuçlar, DHCA ile ilişkili patofizyolojik süreçlerin anlaşılmasını genişletti ve DHCA'nın sonuçlarını iyileştirmek için yeni yönler sundu. Bununla birlikte, DHCA sonrası endotoksemi, oksidatif stres ve otofaji ile ilgili sonuçlar yetersizdir. DHCA, kardiyopulmoner bypass (CPB)¹⁴ ile aynı operasyonel teknolojiyi kullanır, ancak yönetim stratejisi farklıdır ve DHCA'yı üretme adımları çeşitli ekipler arasında farklılık gösterir 8,9,10,11. Bu çalışma, sıçanlarda DHCA prosedürünün oluşturulması için bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.

Protokoller kurumsal bir incelemeden geçti ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, Fuwai Hastanesi, Çin Tıp Bilimleri Akademisi'nden (FW-2021-0005) onay aldı. Tüm deneysel prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: Erkek Sprague-Dawley sıçanları (ağırlık: 500-600 g, yaş: 12-14 hafta) standart laboratuvar koşullarında yiyecek ve suya serbest erişimle tutulmuştur. Sıçanlar rastgele iki gruba ayrıldı (n = 6, her grup): DHCA grubu ve normal sıcaklık CPB grubu (NtCPB grubu).

1. Hazırlık çalışmaları

1. Deneyden önce cerrahi aletleri (forseps, makas, mikro forseps, elektrokoagülatör, tıraş makinesi vb.) sterilize edin (Şekil 1).
2. 2-0 ipek, 16 G kanül (endotrakeal kateter), 22 G kanül, ev yapımı 16 G kanül (multi-delikli intravenöz kateter), enjeksiyon şırıngaları, gazlı bez ve bant içeren sarf malzemelerinin kullanılabilirliğini sağlayın.
   NOT: Ev yapımı 16 G kanül için, kanülün ucunda 2 mm çapında iki veya üç deliği kesmek için bir neşter kullanın, bu da venöz drenajın daha pürüzsüz hale getirilmesine yardımcı olacaktır.
3. Sevofolran,% 2 lidokain, salin, heparin (5 IU / mL, 250 IU / mL), epinefrin (40 μg / mL), norepinefrin (20 μg / mL), hidroksietil nişasta ve bikarbonat mevcudiyetini sağlayın.
4. DHCA devrelerinin bir rezervuar (Murphy'nin damlalığından modifiye edilmiş), bir makaralı pompa, bir ısı eşanjörü, bir membran oksijenatör, bağlantı tüpleri ve bir su deposu içerdiğinden emin olun (Şekil 2). Devreyi bağlayın ve 12 mL hidroksietil nişastayı 1 mL heparin sodyum (250 IU) ve 1 mL salin ile karıştırın. Devreyi 14 mL astarlama çözeltisi ile makaralı pompa hafifçe dönerken (10-40 mL/dak) astarlayın.
   NOT: Rezervuar, Murphy'nin damlalığı ile bir kan transfüzyon cihazından yeniden kalıplanır. Damlalığın venöz giriş kısmı 10-15 cm'de kalır ve venöz çıkış kısmı 10 cm'de kalır.

2. Anestezi ve kanülasyon

1. Sıçanları% 2-3% sevofluran ile anestezi altına alın ve daha sonra sıçan bilincini kaybettikten sonra konjonktival refleks ve kas gevşemesinin eksikliğini test edin.
   NOT: Konjonktival refleks, korneaya her dokunulduğunda göz kapağının anında kapanmasını ifade eder. Korneaya hafifçe dokunmak için pamuklu çubuk kullanın. Anestezi derinliği yeterli olduğunda göz kapakları kapanmayacaktır.
2. Konjonktival refleks kaybolduktan ve kas direnci gözlenmedikten sonra 16 G kanül ile endotrakeal entübasyon yapın. Tüpü bir vantilatöre bağlayın ve ventilatör üzerindeki düğmelere tıklayarak parametreleri ayarlayın (gelgit hacmi: 1.0-1.2 mL / 100g, kalp atış hızı: dakikada 80 atım [bpm], I: E = 1: 1, ilham veren oksijen fraksiyonu: % 60).
3. Sıçanın altına elektrikli bir ısıtma battaniyesi koyun ve sıçanı bantla sabitleyin. Kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın. Sol kasık bölgesindeki, sağ servikal bölgedeki ve kuyruktaki saçları tıraş makinesi ile tıraş edin. Ardından, cildi iyot ve alkolle üç kez dezenfekte edin.
4. Sonraki adımlara geçmeden önce anestezi derinliğini kontrol edin. Solunum hızı ventilatör tarafından ayarlanandan daha yüksekse (80 bpm) veya kas sertliği varsa, sevofluran çıkış konsantrasyonunu arttırın.
   NOT: Anestezi derinliği yeterli olduğunda, solunum ritmi ventilatör ile senkronize edilmeli ve kaslar gerginlik olmadan tamamen gevşetilmelidir. Sıçanın prosedür boyunca herhangi bir bilinç dönüşü yaşamadığından emin olmak için her 30 dakikada bir anestezi derinliğini kontrol edin.
5. Sol kasık bölgesinde (yaklaşık 1 cm) cildi kesmek için bir neşter kullanın ve sol femoral ven ve arteri açığa çıkarmak için kas ve dokuyu yumuşak bir şekilde disseke edin. Arteri dikkatlice ayırın.
6. Sol femoral artere 22 G intravenöz kateteri kanüle edin. Arteri ve kateteri 2-0 ipek ile (kanülasyon bölgesinde) bağlayın. Pıhtılaşmayı önlemek amacıyla kanülü yıkamak için salin içeren heparin (5 UI / mL) kullanın. Kan basıncını izlemek için kateteri basınç sensörüne bağlayın.
7. Kuyruğun derisini (yaklaşık 1,5 cm) kesin ve daha sonra cerrahi alanın ortasında bulunan kuyruk arterini ortaya çıkarmak için kuyruk arterinin yüzeysel fasyasını kesmek için bir neşter kullanın.
8. Kuyruk arterini 22 G intravenöz kateter ile kanüle edin. Arteri ve kateteri 2-0 ipek ile (kanülasyon bölgesinde) bağlayın. Pıhtılaşmayı önlemek için kateteri yıkamak için salin içeren heparin (5 UI / mL) kullanın.
   NOT: İntravenöz kateteri kanüle ederken, sol el forseps ile arteri / veni tutar ve sağ el kateterin içindeki iğne ile arteri / damarı delir ve daha sonra kanülü artere koyar.
9. Sağ juguler vendeki cildi kesin (yaklaşık 2 cm) ve ardından damarı açığa çıkarmak için kas ve dokuyu ayırın. Sağ dış juguler ven içine 16 G ev yapımı çok delikli bir intravenöz kateter yerleştirin ve sağ inferior vena kavaya veya sağ atriyuma dikkatlice yerleştirin.
   NOT: Sol femoral ven ve arter sol kasık bölgesinin yüzeyinin altındadır. Damar arterden daha kalındır ve arterlerin kan rengi parlak kırmızıdır. Sağ juguler ven sağ servikal bölgenin ortasındadır; cilt kesildiğinde ve kaslar ayrıldığında, damar görülebilir (yaklaşık 0.3-0.4 cm genişliğinde). Kateterin ucu sağ atriyuma dokunduğunda, kan basıncı dalgası dalgalanacaktır. Daha sonra kateteri biraz geriye çektikten sonra kateterin ucu superior vena kavada olacaktır.
10. Heparin sodyumu (500 IU / kg) sağ dış damardan uygulayın. Kirlenmeyi önlemek için her bir kanül bölgesini nemli gazlı bezle örtün.
    NOT: Yaklaşık 40 cm yükseltmek için ameliyat masasının altına bir kutu koyun.

3. DHCA başlatma

1. DHCA devresini önce kuyruk arterindeki kateterle bağlayın ve pompa akış hızını 1-2 mL / dak'da tutun. Ardından, rezervuarı sağ dış juguler vendeki kateter ile bağlayın. Rezervuarda her zaman yaklaşık 1 cm'lik bir kan seviyesi olduğundan emin olun.
2. Su deposunu açın ve önce su sıcaklığını 37 ° C'ye ayarlayın.
3. Kan basıncı stabil hale geldikten sonra, kanı pompalamak için pompa akışını yavaşça 80-100 mL / kg / dak'ya kadar artırın.

4. Soğutma

1. Oda sıcaklığını yaklaşık 20 °C olarak ayarlayın. Buz küplerini tek kullanımlık eldivenlere koyun ve ardından sıçanın kafasına ve yanlarına yerleştirin. Tankın sıcaklığını, sıçanların rektal sıcaklığına göre gerçek zamanlı olarak ayarlayın.
2. Sol femoral arterden 0.1 mL kan toplayın ve kan gazı analizi için kan gazı makinesine yerleştirin. Ventilatörün ilgili parametrelerini kan gazı analizi sonuçlarına göre uygun şekilde değiştirin (örneğin, PaCO₂).
   NOT: Kalp atış hızı ve kan basıncı değişebilir ve pompa akış hızı buna göre ayarlanmalıdır. Su deposu ile sıçan arasındaki sıcaklık gradyanı 10 ° C'den az olmalıdır. Sıcaklığın 30 dakika içinde 15-20 ° C'ye düşürülebildiğinden emin olun. PaCO_2'nin normal aralığı 35-45 mmHg'dir. Kan gazı sonuçları daha düşük bir PaCO₂ gösteriyorsa, gelgit hacmini azaltabilir ve bunun tersi de geçerlidir.

5. Derin hipotermik dolaşım durması

1. Rektal sıcaklık 15-20 ° C'ye düştüğünde, dolaşım durması sırasında derin hipoterminin korunmasını sağlamak için tek kullanımlık eldivenleri (buz içeren) değiştirin.
2. Makaralı pompayı durdurun, rezervuarı çevre ile temas halinde tutun ve kanı yavaşça dış juguler damardan rezervuara boşaltın.
3. Kan basıncı dalga formuna dikkat edin. Kan basıncı ve kalp atış hızı 0 olduğunda, drenajı durdurun ve rezervuarı kapalı tutun. Vantilatörünü kapatın.
   NOT: Dolaşım durmasının süresi, deneyin amacına göre değişir.

6. Isınma ve reperfüzyon

1. Tüm tek kullanımlık eldivenleri çıkarın ve oda sıcaklığını 25 ° C'ye yükseltin. Venöz drenaj tüpünün kesilmesini sürdürürken membran oksijenatör ventilasyonunu geri yükleyin. Rezervuardaki kanın yavaşça sıçanın vücuduna geri döndüğünden emin olmak için makaralı pompayı açın.
2. Vantilatörünü açın. Rezervuardaki kan seviyesi 1 cm'de kaldığında, drenaj tüpünü gevşetin ve kanı sağ atriyumdan rezervuara yavaşça boşaltın.
3. Isıtma lambasını, ısıtma yastığını ve su deposunu açın. Öncelikle su tankının sıcaklığını 25 ° C'ye ayarlayın ve ardından çıkış sıcaklığını sıçanın rektal sıcaklığına göre zamanında ayarlayın.
   NOT: Isıtma lambası, sıçan göğüs boşluğundaki büyük kan damarlarına yönlendirilmeli ve dokuların yanmasını önlemek için belirli bir mesafede tutulmalıdır. Çıkış sıcaklığı ile sıçanın rektal sıcaklığı (<10 ° C) arasındaki sıcaklık farkına dikkat edin. Gerekirse, kan gazını test edin ve ardından ventilatör parametrelerini buna göre ayarlayın ve bikarbonat, elektrolitler vb. Uygulayın.
4. Rektal sıcaklık 34 °C'ye döndükten sonra ısıtma lambasını çıkarın.
   NOT: Bu adım, hızlı yeniden ısınma sürecinin bir devamı olarak, yavaş olmalıdır. Bu aşamada, sevofluran buharlaştırıcının, mekanik vantilatörün ve makaralı pompanın ekipman parametreleri, CPB'nin başlangıcındaki seviyelere geri yüklenebilir.

7. CPB'den vazgeçmek

1. Makaralı pompa akış hızını yavaşça ve kademeli olarak azaltın ve akış hızı 1 mL / dak'ya düşene kadar venöz drenaj hızını ayarlayın.
   NOT: Her akış hızı ayarı 3-5 dakika boyunca gözlemlenmelidir.
2. Rezervuarı çevre ile temas halinde tutun (rezervuar kapağını çıkararak). Devrede kalan kanı 1 mL/dak akış hızıyla aşılayın.
3. Membran oksijenasyonunu ve makaralı pompayı durdurun.
4. Derin anestezi altında bir süre mekanik ventilasyondan sonra sıçanı ötenazileştirin.
   NOT: Bu bir terminal yordamıdır. CPB'den ayrılma ve ötenazi arasındaki süre, farklı çalışma protokollerine göre değişir. Yaraları iyot ve alkolle dezenfekte etmeyi ve ardından ötenaziden önce kontaminasyonu önlemek için her kanüllenmiş bölgeyi nemli gazlı bezle örtmeyi unutmayın. Anestezi derinliğini arttırmak için sevoflurane çıkış konsantrasyonunu arttırın.

Kontrol grubu olarak, dolaşım durması olmayan normal sıcaklıktaki CPB (NtCPB) sıçanları, tüm prosedür boyunca stabil bir ortalama arteriyel kan basıncı (MAP) ve vücut ısısı gösterirken, DHCA sıçanlarının MAP'si kalp durması sırasında azalmıştır (p < 0.01, Şekil 3A). DHCA sıçanlarının sıcaklığı soğutma aşamasında hızla düştü ve yeniden ısınma aşamasında kademeli olarak iyileşti. Sıçanları DHCA devrelerinden ayırırken, DHCA sıçanlarının sıcaklığı normale döndü (Şekil 3B).

DHCA sürecinin sıçanlar üzerindeki etkisi kan gazı analizi ile araştırılmıştır. Astarlama çözeltisi ile tam kan temasından sonra, hemoglobin (Hb) konsantrasyonu her iki grupta da 6 g / dL'den yüksekti (Şekil 4A). Sıçanları DHCA devresinden keserken, CPB devresinde kalan kanın sıçana infüzyonu nedeniyle konsantrasyon 9 g / dL'ye yükselmiştir. Hematokrit (HCT) Hb'ye benzer bir eğilim gösterdi (Şekil 4B). CPB prosedürünün başlangıcında, Hb ve HCT'deki farklılıklar sıçanların farklı ağırlıklarından kaynaklanmış olabilir. DHCA sıçanlarının ortalama ağırlığı 7.254 g'± 571.1 g iken, NtCPB grubundaki sıçanların ortalama ağırlığı 535.0 g ± 8.317g idi (p = 0.075). Hb konsantrasyonundaki farklılıklar, kanın oksijen taşıma kabiliyetinde farklılıklara yol açsa da, iki grubun değişim eğilimleri aynıydı ve DHCA'nın Hb konsantrasyonunu ek olarak etkilemediğini gösteriyordu. DHCA ve reperfüzyondan sonra, laktik asit seviyesi hızla artmıştır ve bu DHCA grubunda daha belirgindi (Şekil 4C). DHCA prosedüründen sonra pH azaldı, bu da büyük olasılıkla laktik asit birikiminin bir sonucuydu (Şekil 4D). Tüm deney boyunca, Na +, Cl −, K + ve glikoz konsantrasyonları herhangi bir zaman noktasında önemli farklılıklar göstermedi (Şekil 5). Bu sonuçlar, DHCA'nın sadece laktik asit artışına neden olduğunu, ancak kan pH'ını ve hemoglobin, hematokrit, Na +, Cl-, K + ve glikoz konsantrasyonunu etkilemediğini göstermektedir.

Otofaji, ökaryotik hücrelerin sitoplazmik proteinlerini ve hasarlı organellerini bozmak için lizozomları kullandıkları bir süreçtir15. Fizyolojik ve bazı patolojik durumlarda, hücresel homeostazın sürdürülmesi için hafif bir otofaji seviyesi gereklidir. Bununla birlikte, aşırı otofaji metabolik strese, hücre bileşenlerinin bozulmasına ve hatta hücre ölümüne neden olabilir16. DHCA'nın nöral otofaji üzerindeki etkisini değerlendirmek için, transmisyon elektron mikroskobu kullandık ve şaşırtıcı bir şekilde, DHCA sıçanlarının hipokampusunda artan sayıda otofagozom bulduk (Şekil 6). Otofagozomların çift yönlü fonksiyonlarına dayanarak, artan otofagozomların DHCA sırasında nöroprotektif ve telafi edici veya patolojik bir rol oynayıp oynamadığı hala daha fazla araştırmaya ihtiyaç duymaktadır.

Şekil 1: DHCA modelinde kullanılan cerrahi aletler . (a) İyot, (b) enjeksiyon şırıngaları, (c) yapışkan bant, (d) nemli gazlı bez, (e) forseps, (f) makas, (g,h) mikro forseps, (i) bir elektrokoagülatör, (j) tıraş makinesi ve (k) ipek. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: DHCA sıçan modelinin kardiyopulmoner bypass devresi. (A) a: Membran oksijenatörü; b: Isı eşanjörü; c: Rezervuar; d1: Makaralı pompayı bağlayan tüp (dış çap [OD), 6 mm; iç çap [ID], 4 mm; uzunluk, 15 cm); d2: Isı eşanjörü ve membran oksijenatörünü birbirine bağlayan tüp (OD, 6 mm; İç Çap 4 mm; uzunluk, 8 cm); d3: Arter çıkış hattı (OD, 2,5 mm; ID, 1.5mm; uzunluk, 20 cm). (B) a: Rezervuar; b: Membran oksijenatör; c: Isı eşanjörü; d: Makaralı pompa. Sarı ok kan akışının yönünü gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: DHCA sıçanlarının ve normal sıcaklık CPB sıçanlarının vital bulguları. (A) Ortalama arter basıncı ve (B) rektal sıcaklık prosedür boyunca sürekli olarak izlendi. Veriler ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM), grup başına n = 6 olarak sunulmaktadır. DHCA = 30 dk. Her zaman noktasında iki grup arasındaki farklar, eşleştirilmemiş bir Öğrencinin t-testi kullanılarak karşılaştırıldı. Kısaltmalar: DHCA = derin hipotermik dolaşım durması; NtCPB = normal sıcaklık kardiyopulmoner bypass; MAP = ortalama arteriyel kan basıncı. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; p > 0,05 gösterilmez. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Sıçanlarda pH ve hemoglobin, hematokrit ve laktik asit konsantrasyonları. (A) hemoglobin, (B) hematokrit, (C) laktik asit, (D) ve pH analizi için arter kan örnekleri femoral arter yoluyla üç zaman noktasında toplandı: DHCA'dan önce CPB'nin başlatılması ve CPB'nin sütten kesilmesi. DHCA = 30 dk. Veriler ortalama SEM ±, grup başına n = 6 olarak sunulmaktadır. Her zaman noktasında iki grup arasındaki fark, eşleştirilmemiş bir Öğrencinin t-testi kullanılarak karşılaştırıldı. Kısaltmalar: DHCA = derin hipotermik dolaşım durması; NtCPB = normal sıcaklık kardiyopulmoner bypass; Hb = hemoglobin; Hct = hematokrit; Lac = laktik asit. * p 0.05 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Sıçanlarda Na+, Cl−, K+, ve glikoz konsantrasyonu. (A) Na+, (B) Cl−, (C) K+ ve (D) glukoz analizi için arter kan örnekleri femoral arter yoluyla üç zaman noktasında toplandı: DHCA'dan önce CPB'nin başlatılması ve CPB'nin sütten kesilmesi. DHCA = 30 dk. Veriler ortalama SEM ±, grup başına n = 6 olarak sunulmaktadır. Her zaman noktasında iki grup arasındaki farklar, eşleştirilmemiş bir Öğrencinin t-testi kullanılarak karşılaştırıldı. Kısaltmalar: DHCA = derin hipotermik dolaşım durması; NtCPB = normal sıcaklık kardiyopulmoner bypass; Glu = glikoz. p > 0,05 gösterilmez. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Sıçanların hipokampusunda otofagozomlar. Sıçanlar, CPB devresinden kesildikten 30 dakika sonra ötenazi yapıldı ve hipokampi hemen hasat edildi. Daha sonra, hipokampiler, (A) NtCPB sıçanlarının ve (B) DHCA sıçanlarının hipokampuslarındaki otofagozomların ekspresyonunu araştırmak için daha fazla iletim elektron mikroskobu için glutaraldehit içinde sabitlendi. DHCA = 30 dk. Ölçek çubukları: 1 μm ve 250 nm. Oklar otofagozomlara işaret ediyor. Kısaltmalar: DHCA = derin hipotermik dolaşım durması; NtCPB = normal sıcaklık kardiyopulmoner bypass. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.