Bir Sıçan Sakküler Yan Duvar Modelinde Neointima Oluşturan Hücrelerin Kökenini Araştırmak için Bir Hücre İzleyici Enjeksiyonu Kullanma

İntrakraniyal anevrizmanın (İA) rüptürü sonucu gelişen subaraknoid kanama, yüksek morbidite ve mortalite^ile ilişkili yıkıcı bir nöroşirürjik durumdur 1,2,3,4. Endotelden endotele doğrudan temas sağlayan mikrocerrahi kırpmaya ek olarak, endovasküler cihazlar son yıllarda rüptüre olmuş ve tesadüfen keşfedilen İA'ların tedavisinde giderek artan bir önem kazanmıştır. Endovasküler olarak tedavi edilen İA'larda iyileşme yanıtı esas olarak neointima oluşumuna ve trombüs organizasyonuna bağlıdır. Her ikisi de bitişik damardan ve anevrizma duvarından hücre göçüne bağlı olarak sinerjik süreçlerdir. ⁵ Endovasküler tedavi edilen anevrizmaların neointima oluşumunda endotel hücrelerinin kökeni bugüne kadar belirsizliğini korumaktadır. Literatürde, neointima oluşturan hücrelerin işe alındığı kaynak hakkında devam eden bir tartışma vardır.

Sıçanların abdominal aortunda CM-Dil boyasının hücre izleyici enjeksiyonunu kullanarak ( Materyal Tablosuna bakınız), iki farklı FU zaman noktasında (gün 7 ve gün 21) neointima oluşumunda ana arterden kaynaklanan endotel hücrelerinin rolünü analiz etmeyi amaçladık (Şekil 1). Modelin bir avantajı, anevrizma sütüründen önce bir ebeveyn arterinde in vivo olarak doğrudan lokal hücre izleyici inkübasyonudur ve daha sonraki zaman noktalarında FU'ya izin verir. Hücre izleyici inkübasyonu gibi in vivo enjeksiyon teknikleri literatürde tanımlanmamıştır. Bu tekniğin bir avantajı, modeli sağlam ve tekrarlanabilir kılan doğrudan, tek noktalı, intraoperatif, in vivo enjeksiyondur.

Veteriner desteği kurumsal kılavuzlara göre yapıldı. Deneyler İsviçre Yerel Etik Komitesi (BE 60/19) tarafından onaylanmıştır. ARRIVE yönergeleri ve 3R ilkeleri sıkı bir şekilde takip edilmiştir ^6,7. 12 haftalık ve 492 ± 8 g ağırlığında otuz bir erkek Lewis sıçanı dahil edildi. Tüm sıçanları 23 ° C'lik bir oda sıcaklığında ve 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde barındırın. Suya ve peletlere ücretsiz erişim sağlayın. İstatistiksel analizler parametrik olmayan Wilcoxon-Mann-Whitney U testi kullanılarak yapılmıştır. 0.05 ve/veya 0.01 ≤ ≤ olasılık değerleri (p) anlamlı kabul edildi.

1. Preoperatif faz-genel hazırlık ve anesteziyolojik yönler

1. Web tabanlı randomizasyon sistemi aracılığıyla sıçanları bobin veya stent tedavi gruplarına randomize edin (Şekil 2). Şimdi, 23 ± 3 ° C'lik bir oda sıcaklığını koruyan sessiz, aseptik bir ameliyathanenin yanında ameliyat için planlanan tüm hayvanların ameliyat öncesi klinik muayenesini yapın. Hayvanların davranışlarını analiz edin ve ameliyat öncesi klinik muayenenin bir parçası olarak mukoza zarlarını ve turgoru inceleyin.
2. Her hayvanın ağırlığını kaydedin.
3. Ameliyattan önce, desellülarize anevrizmalar elde etmek için donör sıçanlardan arteriyel poşetleri 37 ° C'de 10 saat boyunca% 0.1 sodyum dodesil sülfat içinde inkübe edin⁸. Bu keseleri ameliyattan birkaç gün önce donör hayvanlardan toplayın.
   1. Abdominal aortun tam uzunluğunu mikromakas ve forseps ile hazırlayın ve 3-4 mm aralıklarla 6-0 emilemeyen ligatür uygulayın.
   2. Bir donör hayvanın torasik kısmından daha önce bağlanmış bir arteriyel damar kesesi tarafından intraoperatif olarak doğrudan hayati anevrizmalar üretir⁹. Belirtilen FU zaman noktasında makas ve cerrahi forseps ile torakotomi yapın ve damar kesesini istenen uzunlukta yaslanın.
4. Poşeti doğrudan alıcıya implante edin ve daha fazla makroskopik analiz ve histolojik işlem için anevrizmayı donör hayvandan toplayın.
5. Anestezi indüksiyonu için, tüm sıçanları 5-10 dakika sonra bilinç kaybına kadar oksijen (_O2) ile donatılmış temiz bir kutuya yerleştirin. Sıçanları, 0.005 mg / kg, medetomidin 0.15 mg / kg ve midazolam 2 mg / kg karışımının deri altı (SC) enjeksiyonu ile anestezi altına alın.
   NOT: Bu, en az 45 dakikalık bir cerrahi düzlem sağlar.
6. Pedal çekilme refleksinin yokluğunda anestezi derinliğini kontrol edin.
7. Sıçanları sırtüstü pozisyona yerleştirin ve torakoabdominal kısmı elektrikli tıraş makinesi ile tıraş edin.
8. Sıçanların 4 pençesini, otomatik düzenleyici bir rektal proba bağlı bir ısıtma yastığı ile kaplanmış bir tahta üzerine bantla sabitleyin. Isıtma yastığı yardımıyla istenen sıcaklığı 37 ° C'de tutmak için rektal probu sıçanın anüsüne yerleştirin.
9. Şimdi, intraoperatif olarak hayati belirtileri kontrol etmek için bilgisayarlı bir sisteme bağlı sağ arka bacağa bir sensör takın.
10. Sıçanın burnunu ve ağzını bir yüz maskesi ile örtün. Uzun süreli anestezi gerekiyorsa, izofluranı başlatın (% 1.0-2.0,_O2'de etkili olmak için% 1.0-2.0 titre edilmiştir).
11. Cerrahi alanı povidon-iyot veya alternatif dezenfektanlarla dezenfekte edin ve cerrahi alanı steril bir şekilde örtün.
12. Perianestezik bakım için, gözlere steril bir oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın ve cerrahi lambanın kurumasını ve zarar görmesini önlemek için opak bir folyo maskesi ile örtün.
13. Ameliyat boyunca, yüz maskesi aracılığıyla sürekli oksijen sağlayın, vücut ısısını izleyin ve normotermiyi koruyarak bir ısıtma yastığı kullanarak ısı sağlayın.
14. Diğer hayati belirtileri sürekli izleyin (nabız ve nefes darlığı, kalp ve nefes hızı ve oksijen doygunluğu).

2. Operatif faz - hücre izleyici enjeksiyonu

NOT: Helsinki sıçan mikrocerrahi yanak anevrizması model^9'daki ayrıntılı cerrahi yaklaşım ve bobin ve stent implantasyonu teknikleri başka bir yerde açıklanmıştır 8,10,11.

1. Floresan lipofilik hücre izleyiciyi her zaman ≤ -20 ° C'de ışıktan korunarak saklayın.
2. Sıçan aortunu ve kaval venini hazırlayarak, ardından her ikisinin ayrılmasının yanı sıra aortun proksimal ve distal geçici kelepçelenmesiyle ameliyatı gerçekleştirin.
   NOT: Bu teknik daha önce⁹ olarak tanımlanmıştır.
   1. Aortun proksimal ve distal kısımlarını iki geçici titan klipsle kelepçeleyin.
3. Arterin daha iyi görselleştirilmesi için aortun proksimal ve distal kısımlarının altına her biri mor dolgulu bir mikrosürüntü koyun.
4. Şimdi, karnı ıslak gazlı bezle koruyun.
5. Operasyon gününde, hücre izleyicinin 2 μL'sini, 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde pipetleme yaparak çözün.
6. Karışımı 27-1/2 G (0,4 x 13 mm) steril kanül ile donatılmış 1 mL'lik bir şırıngaya aktarın.
   NOT: Adım 2.5 ve 2.6'yı uygularken ışığa maruz kalmaktan kaçınmaya dikkat edin.
7. Ameliyathanedeki ışığı kapatın. Mikroskop altında bakarken, mikro forseps kullanarak aortun orta ventral kısmına tek noktalı enjeksiyonu gerçekleştirin ve 1 mL heparinize % 0.9 salin çözeltisini dikkatlice enjekte edin.
8. Hücre izleyiciyi dikkatlice enjekte edin (Video 1) ve hemen çalışma mikroskobunu da kapatın. Yine, karnı ıslak gazlı bezle koruyun.
9. Boyanın en az 15 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Kuluçka döneminden sonra mikroskop ve ameliyathane ışıklarını açın.
10. Başka bir yerde tarif edildiği gibi uzunlamasına arteriyotomi ve anevrizmanın dikişini gerçekleştirin¹¹.
    1. Arteriyotomi yapmak için mikroforseps ve mikromakas kullanın, böylece uzunluğu hasat edilen anevrizmanın çapının ortalamasını alır (adım 1.3). Doğru uzunluğu sağlamak için, arteriyotomi yapmadan önce anevrizmayı aortun yanına yerleştirin. Anevrizmayı emilemeyen 10-0 dikiş kullanarak 8-10 tek dikişle dikişin ve heparinize salin ile sürekli sulama altında distal olarak başlayan geçici kelepçeleri dikkatlice çıkarın. Yarayı katmanlı bir şekilde kapatın. Not olarak, 1 cm'lik bir bobin ambalaj yoğunluğu kullanın.
       NOT: Bobin veya stent implantasyonu tekniği başka bir yerde^{tanımlanmıştır 8,10}.

3. Postoperatif faz izleme ve analjik bakım

1. Ameliyatın sonunda, buprenorfin 0.05 mg / kg, atipamezol 0.75 mg / kg ve flumazenil 0.2 mg / kg'lık bir SC enjeksiyon karışımı ile anesteziyi tersine çevirin. Çalıştırılan her hayvanın, bir ısıtma lambası ile tamamen uyanık ve gerektiğinde ısınana kadar temiz bir kafeste iyileşmesine izin verin.
2. 3 gün boyunca, 1 mg / kg meloksikam (günde bir enjeksiyon veya oral uygulama) ve buprenorfin (günde dört kez 0.05 mg / kg) SC. Gece boyunca, içme suyunda sürekli olarak aynı dozda buprenorfin sağlayın: 6 mL buprenorfin 0.3 mg / mL, 360 mL içme suyu, 10 mL% 5 glikoz.
3. Ameliyat sonrası hemen sonrasında, her hayvanı korunmak için tek bir kafeste barındırın. Hayvanları 24 saat sonra yeniden gruplandırın.
4. SC enjeksiyonundan sonra herhangi bir sıçan sıkıntılı veya agresif davranış gösterirse, gün boyunca içme suyunda buprenorfin uygulayın.
5. Ameliyat sonrası beslenmeyi ve iyileşmeyi desteklemek için kafes tabanında yumuşak besleme sağlayın.
6. Tüm hayvanları refah ve ağrı puan tablosuna göre gözlemleyin ve bakımını yapın.
7. Gerektiğinde kurtarma analjezi SC'yi (meloksikam 1 mg / kg ve 0.05 mg / kg buprenorfin) uygulayın.

Laboratuvar ortamına toplam 31 hayvan dahil edildi: Son istatistiksel analize 27 sıçan dahil edildi; 4 sıçan erken öldü (.9 mortalite oranı). İntraoperatif olarak, solunum distansiyonu stent- (12.9 μm ± 0.7) stent- (12.9 μm ± 0.7) ile tedavi edilen sıçanlarda anlamlı olarak azaldı (p = 0.03). Son FU'nun sonunda her sıçan için floresan anjiyografi yapıldı. Reperfüzyon, bobinle tedavi edilen 6 hayvanın hepsinde endikeyken, stentle tedavi edilen 8 hayvanın sadece% 12.5'inde reperfüzyon gözlendi.

7. gün ve 21. gün için havuzlanmış başlangıç anevrizması hacimleri, bobin veya stent tedavisi grupları arasında anlamlı olarak farklılık göstermedi (ne desellülarize (p = 0.9) ne de vital (p = 0.1) anevrizmalar için) (Şekil 3). Desellülarize anevrizmalar için havuzlanmış FU hacimleri, stentlenmiş anevrizmalara kıyasla bobinlerde anlamlı olmayan bir anevrizma büyümesi gösterdi (p = 0.28), vital sarmallı grupta stentli gruba göre anlamlı derecede daha fazla (60.1 mm 3 ± 31.1 mm3'e karşı 20.5 mm 3 ± 20.6 mm 3; p = 0,002).

Desellülarize anevrizmaların neointimasındaki hücre izleyici-pozitif hücre miktarları, 7. FU gününde stent veya bobin ile tedavi edilen gruplar arasında anlamlı farklılık göstermedi (p = 0.8), ancak 21. gün FU'da stent sıçanlarda anlamlı derecede yüksekti (Şekil 4; p = 0.04). Vital anevrizma dikişli sıçanlarda, 7 gün (p = 1.0) veya 21 gün (Şekil 5) FU'da (p = 0.66) anlamlı bir fark görülmedi. 7 günlük FU'da desellülarize anevrizmalarda, bobin ile tedavi edilen gruba kıyasla stent ile tedavi edilen trombüste anlamlı derecede daha fazla hücre izleyici-pozitif hücre kalmıştır (p = 0.01). Bu fark 7 günlük FU'da vital anevrizmalarda gözlenmedi. Desellülarize için hücre izleyici-pozitif hücrelerin yanı sıra 7. gün ve 21. gün FU için hayati sarmal ve stentli anevrizmaların oranı için Tablo 1'e bakınız. Von Willebrand faktörü (F8) için karşı boyama her sıçanın neointimasının endotel hücrelerinde yapıldı (Şekil 6).

Cerrahi işlemin ortalama süresi bobin grubu için 119.1 ± 21.3 dakika iken, stent grubu için 154.1 ± 30.2 dakika idi (p = 0.001). Anevrizma sütürleri için dikiş sayısı da bobin (15.6 ± 2.9 dikiş) ve stent grupları (11.3 ± 1.1) için anlamlı olarak farklılık gösterdi (p = 0.000002).

Şekil 1: Deney ortamının akış şeması. Toplam 35 hayvan ameliyat edildi ve sarma veya stent gruplarına randomize edildi. Stent grubundaki iki hayvan hemen postoperatif seyirde öldü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bobin ve stent embolizasyonu sırasındaki anevrizmaların intraoperatif fotoğrafları. (A), abdominal sıçan aortuna dikilmiş bir yanak anevrizmasını (#) göstermektedir (*). Anevrizma sütürünü tamamlamak için son tek dikişi yapmadan önce anevrizmaya verilen bobin cihazına dikkat edin. Arteriyotominin sol tarafındaki pembemsi boyamaya (ok) dikkat edin, bu da hücre izleyicisinin doğru dağılımını gösterir. (B) A'dakiyle aynı ayar, stent cihazını zaten in situ olarak gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 3: 31 hayvanda makroskopik postmortem ölçümler. Anevrizma hacimleri (mm3) implantasyondan önce ve takipte y ekseni boyunca temsil edilen belgelenmiştir. (A) Taban çizgisi (desellülarize), (B) takip (desellülarize), (C) bazal (vital), (D) takip (vital). 7. gün ve 21. güne ait veriler bir araya getirilir. ** p < 0,01. Değerler, çeyrekler arası aralıklara sahip medyanlar olarak ifade edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: 21. günde stent ile tedavi edilen desellülarize anevrizmanın örnek görüntüsü. Sağda, monoklonal antia-SMA, hücre tükenmiş anevrizmanın (2 kat büyütme) görüntüsüne genel bakış gösterilmiştir; ölçek çubuğu = 150 μm. Solda, DAPI ile karşı lekeli; kırmızı hücreler anevrizma duvarında hücre izleyici-pozitif (A), trombüste (B), (C) neointimada rezidüel boyalı ancak solmuş hücre izleyici-pozitif hücreler ve (D) komşu damar kompleksinde bulunur. Ölçek çubukları = 100 μm (A-D). Tek ok anevrizma duvarını işaretler, çift ok ana arteri işaretler. Kısaltmalar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; α-SMA = α-düz kas aktini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: 21. günde bobin ile tedavi edilen hayati anevrizmanın örnek görüntüsü. Sağ tarafta, monoklonal antia-SMA, hücre bakımından zengin anevrizmanın (2 kat büyütme) görüntüsüne genel bakış gösterilmiştir; ölçek çubuğu = 150 μm. Sol taraf, DAPI ile karşı lekeli; kırmızı hücreler anevrizma duvarında hücre izleyici-pozitif (A), trombüste (B), neointimada (C) çoklu pozitif hücreler ve (D) bitişik damar kompleksinde bulunur. Ölçek çubukları = 100 μm (A-D). Tek ok anevrizma duvarını işaretler, çift ok ana arteri işaretler. Kısaltmalar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; α-SMA = α-düz kas aktini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: F8 boyamasından 40 kat büyütme . # trombüs oluşumunu, * neointimayı ve § anevrizma deliğinin altındaki endoluminal tarafı gösterir. Neointimanın endoluminal tabakasında mor boyama olarak gösterilen endotel tabakasına dikkat edin. Ölçek çubuğu = 175 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Neointima, ebeveyn arter, trombüs ve anevrizma duvarındaki hücre izleyici pozitif hücrelerin oranı. Değerler, 7. gün ve 21. gün için bobin ve stent tedavisi için desellülarize ve hayati poşetler için yüzdeler olarak gösterilmektedir. Kısaltma: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol.

Video 1: Sıçan aortunun karın kısmına hücre izleyici enjeksiyonu. Bu teknik, kelepçelenmiş sıçan aortuna tek noktalı bir enjeksiyon kullanılarak gerçekleştirilir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarlar, sunulan çalışmanın tasarımından ve yürütülmesinden yalnızca kendileri sorumludur ve rakip çıkarlar beyan etmezler.