Yetişkin lakrimal bez (LG) kök hücreleri için üç boyutlu, serumsuz kültür yöntemi, LG organoid oluşumunun indüksiyonu ve asinar veya duktal benzeri hücrelere farklılaşması için iyi bir şekilde kurulmuştur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Lakrimal Bez Kök Hücreleri için Üç Boyutlu, Serumsuz Kültür Sistemi
Bu makalede
Özet
Özet
Lakrimal bez (LG) kök hücre bazlı tedavi, lakrimal bez hastalıkları için umut verici bir stratejidir. Bununla birlikte, yeterli sayıda LG kök hücresi (LGSC) elde etmek için güvenilir, serumsuz bir kültür yönteminin bulunmaması, daha fazla araştırma ve uygulama için bir engeldir. Yetişkin fare LGSC'leri için üç boyutlu (3D), serumsuz kültür yöntemi iyi kurulmuş ve burada gösterilmiştir. LGSC'ler sürekli olarak geçirilebilir ve asinar veya duktal benzeri hücrelere farklılaşmak için indüklenebilir.
LGSC birincil kültürü için, 6-8 haftalık farelerden gelen LG'ler dispaz, kollajenaz I ve tripsin-EDTA ile sindirildi. Toplam 1 × 10 4 tek hücre,20 μL matris jel-LGSCM matrisi ile önceden kaplanmış, 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğunda 80 μL matris jel-lakrimal bez kök hücre ortamı (LGSCM) matrisine tohumlandı. Karışım, 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübasyondan sonra katılaştı ve 600 μL LGSCM eklendi.
LGSC bakımı için, 7 gün boyunca kültürlenen LGSC'ler, dispase ve tripsin-EDTA ile tek hücrelere ayrıştırıldı. Tek hücreler LGSC primer kültüründe kullanılan yönteme göre implante edildi ve kültürlendi. LGSC'ler 40 defadan fazla geçiş yapabilir ve kök / progenitör hücre belirteçleri Krt14, Krt5, P63 ve nestini sürekli olarak eksprese edebilir. LGSCM'de kültürlenen LGSC'ler kendini yenileme kapasitesine sahiptir ve in vitro ve in vivo olarak asinar veya duktal benzeri hücrelere farklılaşabilir.
Giriş
Lakrimal bez kök hücreleri (LGSC'ler) lakrimal bez (LG) hücre yenilenmesini sürdürür ve asinar ve duktal hücrelerin kaynağıdır. Bu nedenle, LGSC transplantasyonu ciddi inflamatuar hasarın ve sulu eksikliği olan kuru göz hastalığının (ADDED) tedavisinde alternatif bir yaklaşım olarak kabul edilir1,2,3. Tiwari ve ark. çeşitli büyüme faktörleri ile desteklenmiş kollajen I ve matris jeli kullanarak birincil LG hücrelerini ayırmış ve kültüre almış; ancak LG hücreleri sürekli kültürlenemedi4. İki boyutlu (2D) kültür kullanılarak, fare LG'sinden türe....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokoldeki tüm deneyler, Sun Yat-sen Üniversitesi Hayvan Denemesi Etik Komitesi'nin hayvan bakımı yönergelerini takip etti. Hücre ile ilgili tüm işlemler hücre ameliyathanesindeki ultra temiz tezgahta gerçekleştirilmelidir. Ksilen kullanan tüm işlemler duman davlumbazlarında gerçekleştirilmelidir.
1. LGSC birincil kültürü
- LG izolasyonu
- 6-8 haftalık bir BALB / c erkek fare alın ve LG'yi ve etrafındaki bağ dokusunu ortaya çıkarmak için kulağın arkasındaki cildi kesin. Cımbız yardımıyla künt diseksiyon ile bağ dokusunu soyun ve LG'yi çıkarın.
- 6 cm'lik bir tabaktaki kanı çıkarmak için LG'leri 4....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
3D, serumsuz kültür sistemi kurmak
Bu çalışmada, fare LGSC'leri için EGF, Wnt3A, FGF10 ve Y-27632 içeren LGSCM geliştirilmiş ve LGSC'ler 3D kültür yöntemi ile başarılı bir şekilde izole edilmiş ve kültürlenmiştir (Şekil 1A). C57BL / 6 farelerden, NOD / ShiLtJ farelerden, BALB / c farelerden ve ROSA26mT / mG farelerinden LGSC'lerin başarılı bir 3D, serumsuz kültür sistemi bu yöntemkullanılarak kurulmuştur 16. Bir erkek fare için, ayrışma .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Lakrimal kök hücre kültürü ve LG yaralanma onarımı için lakrimal kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro kültürü için iyi kurulmuş yöntemler vardır. Shatos ve ark.17 ve Ackermannve ark. Sıçan ve farelerin sırasıyla 2D kültür yöntemleriyle başarılı bir şekilde kültürlenmiş ve alt kültürlenmiş lakrimal kök hücreleri, ADD tedavisi için lakrimal kök hücrelerin naklini mümkün kılmaktadır. 2D olarak kültürlenmiş LG'lerin 18 kök hücreleri
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (No. 31871413) ve iki Guangdong Bilim ve Teknoloji Programından (2017B020230002 ve 2016B030231001) bir hibe ile desteklenmiştir. Çalışma sırasında bize yardımcı olan araştırmacılara ve hayvan merkezinde çalışan personele hayvan bakımına verdikleri destek için gerçekten minnettarız.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hayvan (Fare)< / em>< / u> | |||
| Bal B/C | Nanjing Üniversitesi | ||
| C57 BL/6J | Sun Yat-sen Üniversitesi | ||
| NOD/ShiLtJ | Nanjing Üniversitesi | ||
| ROSA26mT/mG | Nanjing Üniversitesi | ||
| Equipment | |||
| Analitik denge | Sartorius | ||
| Otomatik kurutucu | Termo | ||
| Kan sayma odası | BLAU | ||
| Hücre Sayacı | CountStar | ||
| CO2 sabit sıcaklık inkübatörü | Thermo | ||
| ECL Jel görüntüleme sistemi | GE sağlık hizmetleri | ||
| Su banyosu için elektrikli banyo | Yiheng Teknolojisi | ||
| Elektroforez cihazı | BioRad | ||
| Floresan kantitatif PCR cihazı | Roche | ||
| Dondurulmuş doku dilimleyici | Lecia | ||
| Yatay santrifüj | CENCE | ||
| Ters floresan mikroskobu | Nikon | ||
| Ters | Olympus | ||
| Lazer katmanlı tarama mikrografı | Carl Zeiss | ||
| Sıvı nitrojen kabı | Termo | ||
| Düşük sıcaklık yüksek hız santrifüjü | Eppendorf | ||
| Mikropipetleyici | Gilson | ||
| Mikrodalga fırın | Panasonic | ||
| Nanodrop ultraviyole spektrofotometre | Termo | ölçüm RNA konsantrasyonu | |
| Parafin dilimleme makinesi | Termo | ||
| PCR Amplifikatör | Eppendorf | ||
| pH değeri test cihazı | Sartorius | ||
| 4 & derece; C Buzdolabı | Haier | ||
| Termostatik kültür osilatörü | ZHICHENG | ||
| Doku parafin gömme aleti | Termo | ||
| -80° C Ultra düşük sıcaklıklı buzdolabı | Termo | ||
| -20&�; C Ultra düşük sıcaklıklı buzdolabı | Thermo | ||
| Ultra saf su arıtma sistemi | ELGA | ||
| u>Reagent | |||
| Hayvan Deneyi | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sodyum | Sigma | 57-33-0 | |
| < güçlü > Hücre Kültürü< / güçlü > | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Kollajenaz I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM / F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Fetal Sığır Serumu | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| İnsan FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Matris jel) | BD | 356231 | |
| Murin Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Murin Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Tripsin İnhibitörü (TI) | Sigma | T6522 | Glisin max'den türetilmiştir; tripsin, kimotripsin ve plazminazı daha az ölçüde inhibe edebilir. Bir mg 1.0-3.0 mg tripsin inhibe edecektir. |
| Tripsin | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE boyama ve İmmün boyama< / güçlü > | |||
| Alexa Fluor 488 eşek anti-Fare IgG Thermo | A-21202 | Kullanılan seyreltme: IHC) 2 & mu; g/mL, (IF) 0.2 μ g/mL | |
| Alexa Fluor 488 eşek anti-Tavşan IgG Thermo | A-21206 | Kullanılan seyreltme: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 & mu; g/mL | |
| Alexa Fluor 568 eşek anti-Fare IgG Thermo | A-10037 | Kullanılan seyreltme: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 & mu; g/mL | |
| Alexa Fluor 568 eşek anti-Tavşan IgG Thermo | A-10042 | Kullanılan seyreltme: (IHC) 2 & mu; g/mL, (IF) 4 μ g/mL | |
| Anti-AQP5 tavşan antikoru | Abcam | ab104751 | Kullanılan seyreltme: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 0.1 μ g/mL |
| Anti-E-kaderin Sıçan antikoru | Abcam | ab11512 | Kullanılan seyreltme: (IF) 5 μ g/mL |
| Anti-Keratin14 tavşan antikoru | Abcam | ab181595 | Kullanılan seyreltme: (IHC) 1 & mu; g/mL, (IF) 2 & mu; g/mL |
| Anti-Ki67 tavşan antikoru | Abcam | ab15580 | Kullanılan seyreltme: (IHC) 1 & mu; g/mL, (IF) 1 μ g/mL |
| Anti-mCherry fare antikoru | Abcam | ab125096 | Kullanılan seyreltme: (IHC) 2 & mu; g/mL, (IF) 2 & mu; g/mL |
| Anti-mCherry tavşan antikoru | Abcam | ab167453 | Kullanılan seyreltme: (IF) 2 μ g/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Sitrik Asit | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kiti (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Termo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Floresan Montaj Orta | Dako | S3023 | |
| Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Keçi anti-Fare IgG antikoru (HRP) | Abcam | ab6789 | Kullanılan seyreltme: 2 & mu; g / mL |
| Keçi anti-Tavşan IgG antikoru (HRP) | Abcam | ab6721 | Kullanılan seyreltme: 2 & mu; g / mL |
| Hematoksilen | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Gömme hidrojel) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30 H < alt > 2 < / alt > O < > 2 < / alt > | Guangzhou Kimya | KD10 | |
| 30 Hidrojen Peroksit Çözeltisi | Guangzhou Kimya | 7722-84-1 | |
| Metanol | Guangzhou Kimya | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Nötr balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Nötr balsam | |
| Aşılanmamış Keçi Serumu | BOSTER | AR0009 | |
| Parafin | Sangon Biyoteknoloji | A601891-0500 | |
| Paraformaldehit | DAMAO | 200-001-8 | |
| Sakkaroz | Guangzhou Kimya | 57-50-1 | |
| Sodyum sitrat tribazik dihidrat | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Sükroz | Guangzhou Kimya | IB11-AR-500G | |
| Doku-Tek OTC Bileşik | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Ksilen | Guangzhou Kimya | 128686-03-3 | |
| RT-PCR ve qRT-PCR< / güçlü > | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alkol | Guangzhou Kimya | 64-17-5 | |
| Kloroform | Guangzhou Kimya | 865-49-6 | |
| Etidyum Bromür | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| İzopropil Alkol | Guangzhou Kimya | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Yeşil I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO-Taq | ||
| DNA Polimeraz | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (nükleik asit leke) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vektör Yapısı ve Hücre Transfeksiyonu< / güçlü > | |||
| Agar | OXID-Ampisilin | ||
| Sigma | 69-52-3 | ||
| Kloramfenikol | Sigma | 56-75-7 | |
| Endotoksin İçermeyen Plazmit Ekstraksiyon Kiti | Thermo | A36227 | |
| Kanamisin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plazmid Transfeksiyon Kiti | Termo | L3000015 | |
| LR Reaksiyon Kiti | Termo | 11791019 | |
| Plazmid Ekstraksiyon Kiti | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5 & alfa; Kimyasal Olarak Yetkin Hücre | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID-Maya | ||
| Özü | OXID- | ||
| Primerler ve Sıra< / strong> | Company< / strong>< | ||
| strong>Primer< / strong>: AQP5 < br / > Sequence< / strong>: < br / > F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC | Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT | Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT | Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA | Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT | Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC | Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus yüksüz vektör | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratuvarı, Sun Yat-sen Üniversitesi |
Kaynaklar
- Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
- Gromova, A., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
