Lakrimal Bez Kök Hücreleri için Üç Boyutlu, Serumsuz Kültür Sistemi

Lakrimal bez kök hücreleri (LGSC'ler) lakrimal bez (LG) hücre yenilenmesini sürdürür ve asinar ve duktal hücrelerin kaynağıdır. Bu nedenle, LGSC transplantasyonu ciddi inflamatuar hasarın ve sulu eksikliği olan kuru göz hastalığının (ADDED) tedavisinde alternatif bir yaklaşım olarak kabul ^edilir1,2,3. Tiwari ve ark. çeşitli büyüme faktörleri ile desteklenmiş kollajen I ve matris jeli kullanarak birincil LG hücrelerini ayırmış ve kültüre almış; ancak LG hücreleri sürekli kültürlenemedi⁴. İki boyutlu (2D) kültür kullanılarak, fare LG'sinden türetilmiş kök hücreler You ve ^ark.5 ve Ackermann ve ark. tarafından izole edilmiştir. ⁶, kök / progenitör hücre belirteci genlerini, Oct4, Sox2, Nanog ve nestini eksprese ettiği bulundu ve alt kültürlenebilir. Bununla birlikte, bu hücrelerin asinar veya duktal hücrelere farklılaşabileceğine dair net bir gösterge yoktur ve in vivo farklılaşma potansiyelini doğrulamak için bir transplantasyon deneyi yoktur.

Son zamanlarda, c-kit + dim / EpCAM ⁺ / Sca1 - / CD34 ^- / CD45^- hücreleri, akış sitometrisi ile fare LG'lerinden izole edildi, Pax6 ve Runx1 ^gibi LG progenitör hücre belirteçlerini eksprese ettiği bulundu ve in vitro olarak kanallara ve acini'ye farklılaştı. ADDED'li farelerde, bu hücrelerle ortotopik enjeksiyon, hasarlı LG'leri onarabilir ve LG'lerin^salgı fonksiyonunu geri yükleyebilir 2. Bununla birlikte, bu yöntemle izole edilen kök hücrelerin sayısı azdı ve izole LGSC'leri genişletmek için uygun kültür koşulları yoktu. Özetle, yetişkin LGSC'leri etkin bir şekilde izole etmek ve kültürlemek için uygun bir kültür sisteminin kurulması ve ADD'lerin tedavisinde LGSC'lerin incelenmesi için istikrarlı ve sürekli genişleme sağlanmalıdır.

Kök hücrelerden veya pluripotent kök hücrelerden türetilen organoidler, histolojik olarak ilgili organlara benzeyen ve kendi yenilenmelerini sürdürebilen bir hücre grubudur. Fare bağırsağı organoidi 2009 yılında Sato ve ark. tarafından başarıyla kültürlendikten sonra, safra kesesi⁸, karaciğer⁹, pankreas 10^{, mide 11}, meme¹², akciğer^{13, prostat 14} ve tükürük bezi¹⁵ gibi Sato'nun kültür sistemine dayanarak, diğer organlardan gelen organoidler art arda kültürlendi. . Organoid kültürde hücre farklılaşmasından önce yetişkin kök hücrelerin yüksek oranda olması nedeniyle, üç boyutlu (3D) organoid kültür yöntemi, LG'nin yetişkin kök hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için en uygun olarak kabul edilir.

Bu çalışmada 3D, serumsuz kültür yöntemi optimize edilerek yetişkin fare LGSC kültür sistemi kurulmuştur. Hem normal hem de ADDED farelerden kültürlenen LGSC'lerin istikrarlı bir kendini yenileme ve çoğalma kapasitesi gösterdiği kanıtlanmıştır. ADDED fare LG'lerine transplantasyondan sonra, LGSC'ler bozulmuş LG'leri kolonize etti ve gözyaşı üretimini geliştirdi. Ek olarak, kırmızı floresan LGSC'ler ROSA26^{mT / mG} farelerden izole edildi ve kültürlendi. Bu çalışma, ADDED tedavisi için klinik uygulamada in vitro LGSC zenginleştirmesi ve LGSC otogreft için güvenilir bir referans sağlamaktadır.

Bu protokoldeki tüm deneyler, Sun Yat-sen Üniversitesi Hayvan Denemesi Etik Komitesi'nin hayvan bakımı yönergelerini takip etti. Hücre ile ilgili tüm işlemler hücre ameliyathanesindeki ultra temiz tezgahta gerçekleştirilmelidir. Ksilen kullanan tüm işlemler duman davlumbazlarında gerçekleştirilmelidir.

1. LGSC birincil kültürü

1. LG izolasyonu
   1. 6-8 haftalık bir BALB / c erkek fare alın ve LG'yi ve etrafındaki bağ dokusunu ortaya çıkarmak için kulağın arkasındaki cildi kesin. Cımbız yardımıyla künt diseksiyon ile bağ dokusunu soyun ve LG'yi çıkarın.
   2. 6 cm'lik bir tabaktaki kanı çıkarmak için LG'leri 4 mL steril 10 mM PBS çözeltisi ile iki kez durulayın. LG'leri 10 s için 4 mL% 75 etanol içeren 6 cm'lik bir kaba daldırın ve hemen iki kez 10 mM PBS ile durulayın.
2. LG'nin tek hücrelerini elde edin
   1. 25 U/mL dispaz hazırlamak için HEPES tampon çözeltisini (50 mM HEPES/KOH, pH 7.4; ultra saf suda 150 mM NaCl) kullanın. % 0.1 kollajenaz I çözeltisini ultra saf su ile hazırlayın.
   2. LG'leri küçük parçalar halinde (yaklaşık 1^mm3) kesin, steril bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve dokuları 37 ° C'de 1 saat boyunca 500 μL 25 U / mL dispase ve 500 μL % 0.1 kollajenaz I ile tedavi edin.
   3. Tripsin-EDTA çözeltisi hazırlamak için 10 mM PBS kullanın (0,05 g / L tripsin, 0,04 g / L EDTA). LG parçalarını adım 1.2.2'den itibaren 1 mL% 0.05 tripsin-EDTA ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca tedavi edin ve parçaları tekrar tekrar pipetleyerek tek hücrelere ayırın.
   4. Süspansiyonu 70 μm'lik bir filtreden süzün, filtratı steril 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüj yapın.
   5. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın, hücre peletini yıkamak için 10 mL'lik 10 mM PBS ekleyin ve süspansiyonu santrifüj edin.
   6. Adım 1.2.5'i tekrarlayın, süpernatanı çıkarın ve hücre peletlerini yeniden askıya almak için 1 mL DMEM / F12 (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın ortamı ve Ham'ın F-12'sinin 1: 1 karışımı) ekleyin.
3. LGSC birincil kültürü
   1. DMEM / F12, 1x N2 takviyesi, 1x B27 takviyesi, 2 mM glutamin ikamesi, 0.1 mM NEAA'lar (esansiyel olmayan amino asitler), 50 ng / mL murin epidermal büyüme faktörü (EGF), 100 ng / mL fibroblast büyüme faktörü 10 (FGF10), 10 ng / mL Wnt3A ve 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitörü) içeren lakrimal bez kök hücre ortamını (LGSCM) hazırlayın.
   2. 24 delikli bir plakanın kuyusunun ortasına 20 μL matris jel-LGSCM matrisi (matris jeli: LGSCM = 1:1) ekleyin. Bir daireye (6-8 mm çaplı) genişletmek için bir pipet ucu kullanın ve kuyuyu ön kaplamak için karışımı 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
   3. Hücre sayısını belirlemek için bir hücre sayacı kullanın ve matris jelinin 40 μL'sine toplam 1 × 10⁴ hücreli 40 μL LGSCM ekleyin. Bir matris jel-LGSCM karışımı elde etmek için bunları bir pipetle nazikçe karıştırın (matris jeli: LGSCM = 1: 1).
   4. 1.3.2 adımında 24 delikli plakanın her bir kuyucuğundaki önceden kaplanmış alanın üzerine karışımın 80 μL'sini dikkatlice düşürmek için bir pipet kullanın.
   5. Karışımı 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin ve 600 μL LGSCM ekleyin.
   6. Her kuyucuktaki kültür ortamını iki günde bir değiştirin. 7 günlük kültürden sonra, ters mikroskop altında 100-300 μm çapında LGSC küreleri arayın (göz merceği: 10x, hedef: 4x).
      NOT: LGSC'ler toplamda 14 günden fazla kültürlenebilir.
4. Yukarıda açıklanan adımları izleyerek ROSA26^{mT / mG} farelerin ve DED farelerinin (NOD / ShiLtJ) birincil LGSC'lerini izole edin ve kültürleyin.

2. LGSC bakımı ve geçişi

1. Kültür ortamını küre kültüründen iyi çıkarın.
2. 7 gün boyunca kültürlenmiş LGSC kürelerini, 37 ° C'de 30 dakika boyunca 20 μL 10 U / mL dispase ve 100 μL 10 mM PBS'de inkübasyon yoluyla ayrıştırın.
3. Süspansiyonu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 dakika boyunca 150 × g'da santrifüj yapın. Süper natantı çıkarın.
4. Küreleri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 1 mL% 0.05 tripsin-EDTA ile tedavi edin. Tripsini nötralize etmek ve küreleri tek hücrelere ayırmak için tekrar tekrar 1 mL% 0.05 tripsin inhibitörü (TI) ve pipet ekleyin.
5. 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüj yapın ve pelette LGSC'ler elde etmek için süpernatantı çıkarın. LGSC peletini yeniden askıya almak için 1 mL LGSCM ekleyin.
6. Tek hücreleri 1.3.1 ila 1.3.6 arasındaki adımlarda açıklandığı gibi plakalayın.

3. LGSC farklılaşması

1. Prosedür 1: Rastgele farklılaşma için LGSC kültür sistemi ile LGSC'lerin kültür süresini 7 günden 14 güne uzatın.
2. Prosedür 2: Duktal hücrelerin farklılaşması için LGSC kültürünün başlangıcında matris jel-LGSCM karışımının oranını 1: 1'den 1: 2'ye değiştirin. LGSC'leri 14 gün boyunca indüksiyon için matrise tohumlayın (adım 1.3'e bakın).
3. Prosedür 3: Geçişten sonra, asinar hücrelerin farklılaşması için LGSCM'yi LGSCM-10% fetal sığır serumu (FBS) karışımı ile değiştirin. 14 gün boyunca farklılaşmayı indükleyin.

4. LG doku dehidrasyonu

1. LG dokuları elde edin (adım 1.1.1) ve LG'leri 4 mL steril 10 mM PBS çözeltisi ile 6 cm'lik bir kapta 2 dakika boyunca durulayın. Dokuları 24 saat boyunca sabitlemek için% 10 formalin çözeltisine taşıyın.
2. Formalini çıkarmak için sabit dokuları 10 mM PBS ile 2 dakika durulayın ve dokuyu bir doku gömme kutusuna aktarın. Gömme kutusunu otomatik kurutucuya koyun.
3. Dokuları aşağıdaki gibi dehidrate etmek için otomatik dehidratörü kullanın:% 70 etanol, 2 saat; % 80 etanol, 2 saat; % 90 etanol, 30 dakika; % 95 etanol, 30 dakika; mutlak etanol, 30 dakika; mutlak etanol, 2 saat; mutlak etanol:% 100 ksilen (1: 1) karışımı, 30 dakika; %100 ksilelen, 30 dk; % 100 ksilen, 2 saat; % 100 ksilen: parafin (1: 1) karışımı, 30 dakika; parafin, 2 saat; parafin,3 saat.

5. LG organoid/küre dehidrasyonu

1. LG organoidlerini/kürelerini (adım 2.1-2.3) 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde elde edin ve LG organoidlerini/kürelerini 1 mL steril 10 mM PBS solüsyonuyla 2 dakika boyunca durulayın.
2. 1 dakika boyunca 100 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
3. % 4'lük paraformaldehit (PFA) çözeltisini aşağıdaki gibi hazırlayın: 400 mL'lik 10 mM PBS ve 40 μL 1 M NaOH karışımına 20 g PFA ekleyin, çözeltiyi iyice çalkalayın ve PFA tamamen çözünene kadar 65 ° C'lik bir su banyosunda 2 saat ısıtın. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, hacmi 500 mL'ye çıkarmak için 10 mM PBS kullanın ve 4 °C'de saklayın.
4. Organoid/küre pelet ile mikrosantrifüj tüpüne 1 mL% 4 PFA ekleyin ve tüpü sabitleme için en az 24 saat boyunca 4 ° C'lik bir buzdolabına koyun.
5. Fiksasyondan sonra, 1 dakika boyunca 100 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Organoid/küre pelet ile mikrosantrifüj tüpüne 1 mL'lik 10 mM PBS ekleyin ve PFA'yı durulamak için 2 dakika pipetle pipetle hafifçe karıştırın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
6. 100 × g'da 1 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
7. Hidrojeli eritmek için ısıya gömme hidrojeli çözündürün ve organoid/küre peletine 50-60 μL gömme hidrojeli ekleyin ve karıştırın. Karışımı bir damlacık şeklinde parafilm üzerine pipetleyin ve oda sıcaklığında katılaşması için 5 dakika bekleyin.
8. Jeli organoidler / kürelerle yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde aşağıdaki gibi kurutun.
   1. Tüpe 1 mL% 50 etanol ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika bekleyin ve pipetleme ile sıvıyı tüpten çıkarın. Etanol konsantrasyonunu art arda %70, %80, %90, %95 olarak değiştirerek bu adımı tekrarlayın.
   2. Tüpe 1 mL mutlak etanol ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika bekleyin ve pipetleme yaparak sıvıyı tüpten çıkarın. Bu adımı tekrarlayın.
   3. Tüpe 1 mL 0,5 mL mutlak etanol ve 0,5 mL% 100 ksilen karışımı ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika bekleyin ve pipetleme ile sıvıyı tüpten çıkarın.
   4. Tüpe 1 mL% 100 ksilen ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika bekleyin ve pipetleme ile sıvıyı tüpten çıkarın. Bu adımı tekrarlayın.
      NOT: Adım 5.8.5-5.8.6, 65 °C'de metal bir banyoda gerçekleştirilmelidir.
   5. Tüpe 1 mL 0,5 mL parafin ve 0,5 mL% 100 ksilen karışımı ekleyin, 65 ° C'de 30 dakika bekleyin ve pipetleme ile sıvıyı tüpten çıkarın.
   6. Tüpe 1 mL parafin ekleyin, 65 °C'de 30 dakika bekleyin ve pipetle indirerek sıvıyı tüpten çıkarın. Bu adımı tekrarlayın ve işlem süresini 1 saate kadar uzatın.

6. Parafin gömme ve bölümleme

1. Parafin gömme
   1. Gömmeden önce, gömme makinesini açın ve parafin balmumunu parafin tankında eritmek için önceden ısıtın.
   2. Susuz kalmış dokuyu veya organoid/küre jelini gömme demir kutusunun oluğuna yerleştirin ve demir kutuyu gömme makinesinin parafinine yerleştirin.
   3. Plastik kapağı çıkarın ve plastik gömme kutusunu örtmek için demir kutunun üzerine yerleştirin. Gömme demir kutusunu bir soğutma masasına taşıyın.
   4. Parafin gömme kutusundaki bloklar halinde yoğunlaştıktan sonra, demir kutudan çıkarın ve doğrudan dilimleyin veya geçici olarak 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.
2. Parafin bölümleme
   1. Parafin dilimlemeden önce, parafin dilimleyiciyi önceden monte edin ve ön ısıtma için dilimleyicinin lavabosuna damıtılmış su ekleyin. Su sıcaklığı 42 °C'ye yükseldiğinde dilimlemeye başlayın.
   2. Numuneyi parafin dilimleyicinin numune yuvasına sabitleyin. Dilimleme sırasında kesit kalınlığını 5 μm'ye ayarlayın.
   3. Örneği sürekli olarak bölümlendirin. Tamamen döşenmiş bölümü, dilimleyici tankındaki kaymaz kızağın üzerine sabitleyin.
   4. Bölümlemeden sonra, numune dokusu ile yapıştırılmış slaytları, 24 saat kurutmak üzere 37 ° C'de bir biyokimyasal inkübatöre yerleştirin. Slaytları geçici olarak 4 ° C'de bir buzdolabında saklayın.

7. Hematoksilin ve eozin boyama

1. Parafin kesitlerini 30 dakika boyunca 60 ° C'de eritin, bölümleri 15 dakika boyunca% 100 ksilene batırın ve tekrarlayın.
2. Bölümleri 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde mutlak etanol ile tedavi edin.
3. Bölümleri, her biri 3 dakika boyunca bir çalkalayıcıda% 90 etanol,% 80 etanol ve% 70 etanol ile tedavi edin.
4. Bölümleri bir çalkalayıcı üzerinde deiyonize suyla art arda 5 dakika ve 2 dakika boyunca tedavi edin.
5. Islak bir kutu üzerindeki bölümleri 4 mg / mL hematoksilin çözeltisi ile 5 dakika boyunca sabitleyin. Bölümleri akan suda 10 dakika durulayın.
6. Bir çalkalayıcı üzerindeki bölümleri önce 2 dakika boyunca deiyonize su ile ve daha sonra 1 dakika boyunca% 0.5 -% 1 eozin ile çalkalayın.
7. Kesitleri %70 etanol, %80 etanol ve %90 etanol ile çalkalayıcı üzerinde 3 dakika (her biri) art arda çalkalayın. Bölümleri 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde mutlak etanol ile çalkalayın.
8. Bölümleri 15 dakika boyunca% 100 ksilene batırın ve ıslatmayı tekrarlayın.
9. Slayta 3-4 damla nötr balsam eklemek için bir pipet veya damlalık kullanın ve yavaşça bir kapak sürgüsü ile örtün. Kızakları oda sıcaklığında hava ile kurulayın.

8. İmmünohistokimyasal (IHC) boyama

1. Parafin kesitlerini 30 dakika boyunca 60 °C'de eritin, bölümleri 10 dakika boyunca% 100 ksilen içine batırın ve bu adımı iki kez tekrarlayın.
2. Bir çalkalayıcı üzerindeki bölümleri önce mutlak etanol,% 90 etanol ve% 80 etanol ile 2 dakika (her biri), art arda ve daha sonra 3 dakika boyunca deiyonize su ile çalkalayın. Ajitasyonu deiyonize suyla iki kez tekrarlayın.
3. Bir çalkalayıcı üzerindeki bölümleri önce 10 dakika boyunca 20 mL% 30 H₂O₂ ve 180 mL metanol karışımı ile çalkalayın ve daha sonra 5 dakika boyunca deiyonize su ile çalkalayın. Bu adımı üç kez yineleyin.
4. Bölümleri önceden kaynatılmış sitrik asit tamponuna (3 g Na₃C 6 H₅O 7.2H₂O ve 0.4 g C 6 H₈O₇, pH_6.0ile 1 L deiyonize su), mikrodalgayı 10 dakika mikrodalgaya aktararak kritik altı kaynama noktasında tutun ve 30 dakika oda sıcaklığında soğutun. Bölümleri 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde deiyonize su ile çalkalayın. Bu adımı üç kez yineleyin.
5. Bölümleri çalkalayıcı üzerinde 10 mM PBS ile 5 dakika çalkalayın ve bu adımı üç kez tekrarlayın. Islak kutu üzerindeki doku alanını su itici bir işaretleyici ile kapatın, numuneleri örtmek için bir damla kullanıma hazır bağışıklık dışı keçi serumu ekleyin ve 1 saat boyunca oda sıcaklığına yerleştirin.
6. Serumu çıkarın, numunelere birincil antikor ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Birincil antikoru çıkarın, bölümleri 5 dakika boyunca çalkalayıcı üzerinde 10 mM PBS ile çalkalayın ve bu karıştırma adımını 10 mM PBS ile üç kez tekrarlayın.
7. Numuneleri örtmek için ikincil antikor ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ıslak bir kutuda inkübe edin. Bölümleri çalkalayıcı üzerinde 10 mM PBS ile 5 dakika çalkalayın ve karıştırma adımını üç kez tekrarlayın.
8. Islak kutudaki numuneleri örtmek için taze hazırlanmış %0,03-0,05 3,3'-diaminobenzidin (DAB) çözeltisi ekleyin ve 30-90 sn lekeleyin. Bölümleri akan suyla 10 dakika durulayın.
   NOT: Sarı renk görünene kadar ışık mikroskobu altında gözlemleyerek boyama süresini kontrol edin.
9. Numuneleri örtmek için 4 mg/mL hematoksilin çözeltisi ekleyin, ıslak bir kutuda 5 dakika lekeleyin ve bölümleri 10 dakika boyunca akan suyla durulayın.
10. Bir çalkalayıcıdaki bölümleri her biri 2 dakika boyunca% 80 etanol,% 90 etanol ve mutlak etanol ile art arda çalkalayın ve bölümleri 30 dakika boyunca% 100 ksilene batırın.
11. Slayta 3-4 damla nötr balsam eklemek için bir pipet veya damlalık kullanın ve yavaşça bir kapak sürgüsü ile örtün. Kızakları oda sıcaklığında hava ile kurulayın.

9. Organoidlerin/kürelerin global immünofloresan boyanması

NOT: %4 PFA çözeltisi ile sabitlenmiş organoidleri/küreleri 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın (bkz. adım 5,1 ila 5,4). Floresan etiketlemeyi aşağıdaki gibi gerçekleştirin.

1. Tüpe 1 mL% 30 sakkaroz çözeltisi ekleyerek organoidleri / küreleri kurutun ve gece boyunca 4 ° C'de bir buzdolabında inkübe edin.
2. Organoidleri/küreleri 5 dakika durulamak için tüpe 100 μL PBST çözeltisi (%0,1 Triton X-100 ile 10 mM PBS çözeltisi) ekleyin, tüpü 1 dakika boyunca 100 × g'de santrifüj edin ve peleti toplayın. Bu adımı üç kez yineleyin.
3. Tüpe 0.5-1 mL kullanıma hazır immün olmayan keçi serumu ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kapatın. Tüpü 1 dakika boyunca 100 × g'da santrifüj yapın ve peleti toplayın.
4. Sadece peleti örtmek için birkaç damla seyreltilmiş birincil antikor ekleyin ve 48 saat boyunca 4 ° C'de bir buzdolabında inkübe edin. Tüpü 1 dakika boyunca 100 × g'da santrifüj yapın ve peleti toplayın.
5. 9.2 adımını yineleyin.
6. Sadece peleti örtmek ve 24 saat boyunca 4 ° C'de bir buzdolabında inkübe etmek için tüpe birkaç damla floresan sekonder antikor ve 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi ekleyin.
7. Işıktan kaçınarak adım 9.2'yi tekrarlayın.
8. Tüpe 100 μL PBST çözeltisi ekleyin ve geçici olarak ışıktan uzak, 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın. Işık tabakası tarama mikroskobunu kullanarak organoidleri / küreleri gözlemleyin ve fotoğraflayın.

10. LGSC pLX-mCherry transfeksiyonu

NOT: Lentiviral partiküllerin üretimi, bir biyogüvenlik kabininde ve BSL2 biyogüvenlik seviyesinde temiz bir tezgahta yapılmalıdır.

1. Lentivirüs paketleme hücresi 293T'yi 6 delikli bir plakada DMEM + 37 ° C'de% 10 FBS,% 80 hücre akıcılığına ulaşmak için% 5 CO₂ ile 3-5 gün boyunca kültürleyin.
2. Lentivirüs vektörü pLX-mCherry'yi LGSC'lere aktarın.
   NOT: Reaktif hazırlığı, 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğu için endikedir.
   1. İki steril 1,5 mL santrifüj tüpü hazırlayın ve her tüpe 250 μL DMEM/F12 ekleyin.
   2. Bir tüpe 7,5 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin ve pipetleme ile reaktifi iyice karıştırın.
   3. Endotoksin içermeyen 2 μg pLX-mCherry plazmidini ve eşleşen lentivirüs ambalaj plazmidini başka bir tüpe ekleyin ve transfeksiyon reaktifini (2 μL / μg plazmid) ekleyin.
   4. Sıvıyı her iki santrifüj tüpünde karıştırın ve karışımların oda sıcaklığında 5 dakika beklemesine izin verin.
   5. 293T hücrelerinin kültür ortamını çıkarın ve karışımı adım 10.2.4'ten 293T hücrelerine ekleyin. Kültür ortamını 8 saat sonra taze DMEM +% 10 FBS olarak değiştirin.
   6. 48 saat sonra, virüs süpernatantını ilk kez toplayın ve 0,45 μm'lik bir filtreden süzün. 72 saat sonra, virüs süpernatantını ikinci kez toplayın ve tekrar 0,45 μm'lik bir filtreden süzün.
      NOT: Her iki filtrelenmiş süpernatantı da lentivirüs transdüksiyonuna kadar buz üzerinde saklayın.
3. LGSC'leri DED farelerinden (NOD/ShiLtJ) edinin (bkz. adım 1).
4. Hücreleri yeniden askıya almak için önceden toplanan pLX-mCherry lentivirus süpernatantının 1 mL'sini ekleyin.
5. Santrifüj tüpünü CO₂ inkübatördeki bir çalkalayıcıya 37 ° C'ye ayarlayın. Lentivirüs ve hücreler arasındaki teması en üst düzeye çıkarmak için 100 rpm'de çalkalayın. 8 saat sonra, karışımı 4 dakika boyunca 250 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.
6. Hücre peletini yeniden askıya almak için 1 mL DMEM / F12 ekleyin. Hücre sayısını belirlemek için bir hücre sayacı kullanın ve toplam 1 × 10 4 hücreyi, 20 μL matris jeli-LGSCM matrisi ile önceden kaplanmış²⁴ delikli bir plakanın her bir kuyucuğunda 100 μL matris-LGSCM matrisine (matris jeli: LGSCM = 1: 1) tohumlayın (bkz. adım 1.3.2).
7. 7 günlük kültürden sonra (bkz. adım 1), kültürü genişletmek için floresan mikroskobu altında kırmızı floresan sergileyen küreleri seçin.

11. LGSC ortotopik transplantasyon

NOT: Tüm cerrahi operasyonlar SPF ameliyathanesinde yapılır ve tüm cerrahi aletler sterilize edilir.

1. LGSC kürelerini, kırmızı floresan (td-Domates) veya 7 gün boyunca kültürlenmiş mCherry transfeksiyonu olan ROSA26 mT^{/ mG} farelerden elde edin (bkz. adım 1).
2. Kullanmadan önce 1:1 matris jeli ve DMEM/F12 karışımı içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünü buz üzerinde soğutun. LGSC kürelerini tek hücrelere sindirin ve hücreleri tüpte 2 × 10⁶ hücre / mL yoğunlukta yeniden askıya alın.
3. NOD / ShiLtJ farelerini intraperitoneal pentobarbital sodyum (50 mg / kg) enjeksiyonu ile anestezikleştirin.
   NOT: NOD / ShiLtJ fare, azalmış gözyaşı sekresyonu, enflamatuar infiltrasyon ve orbital ülserasyon dahil olmak üzere idiyopatik ADDED semptomları olan ideal bir modeldir.
4. Anesteziden sonra, kuruluğu önlemek için gözlerde salin veya veteriner merhem kullanın ve daha sonra LG'leri açığa çıkarmak için anestezik farelerin kulağının arkasındaki deride (gözün yakınında) 5-8 mm'lik bir kesim yapmak için oftalmik makas kullanın.
   NOT: İyodofor, insizyonun etrafındaki dezenfeksiyon için kesinlikle kullanılmalıdır.
5. Sol taraftaki LG'ye 2 × 10⁴ hücre enjekte edin ve karışımı hücresiz olarak sağ taraftaki LG'ye kontrol olarak enjekte edin (bkz. adım 11.2).
6. Enjeksiyondan sonra, LG'leri oftalmik forseps ile orijinal pozisyonlarına geri getirin ve yarayı dikin. Fareleri 2 ay boyunca besleyin ve tedavinin etkisini gözlemleyin.
   NOT: Kafes yastığı malzemesi de operasyondan sonra kesinlikle sterilize edilmeli ve yastık malzemesi günde bir kez değiştirilmelidir. Yarayı diktikten sonra, tramadol analjezi elde etmek için standart dozda 2.5 mg / kg'lık standart dozda farelerin kuyruk damarına seçici olarak enjekte edilebilir.
7. Bu fareleri deneyden 2 ay sonra anestezi altına alın (bkz. adım 11.3). Oküler bölgenin semptomlarını filme alın.
   1. Anestezi sırasında, aşağıdaki semptomları arayın: boyun ve uzuv kas gevşemesi; derin, yavaş ve sabit solunum; öğrenci daralması; kornea refleksinin kaybolması.
   2. Anestezi ve operasyon sırasında, farelerin vücut ısısını 37 ° C'de tutun. Ameliyattan sonra, yara enfeksiyonu riskini azaltmak için fareler için içme suyuna uygun antibiyotikler ekleyin. Göğüs yatışmasını korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareleri gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar ameliyat olan fareleri diğer farelerin şirketine iade etmeyin.
   3. Oküler bölgenin semptomlarını filme aldıktan sonra, ImageJ yazılımını açın, Dosya | Açık | Serbest el seçimleri, farenin sol düğmesini basılı tutun ve görüntüdeki orbital ülserasyon alanını seçin. | Analiz Et'e tıklayın Ülserasyonun göreceli alanını elde etmek için ölçün.
8. Fenol kırmızı pamuk ipliğini 10 s boyunca anestezik farelerin lateral kantusuna koyun; pamuk ipliğinin renksiz kısmının uzunluğunu ölçün ve kaydedin. Gözyaşı ölçümünden sonra servikal vertebra çıkığı ile fareleri ötenazileştirin.
9. Fareleri disseke edin ve IHC analizi için LG'leri elde edin.

12. RNA izolasyonu

NOT: Deneyden önce, santrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutun ve tüm reaktiflerin ve sarf malzemelerinin RNAse kontaminasyonundan arındırılmış olmasını sağlayın.

1. LGSC'leri veya LG parçalarını bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. 1 mL hücre lizis tamponu ekleyin ve vorteks salınımı ile hücreleri veya dokuları tamamen lize edin.
2. 0,2 mL kloroform ekleyin ve 1 dakika boyunca vorteks salınımından sonra 10 dakika oda sıcaklığında bekletin. 4 °C'de 15 dakika santrifüj, 12.000 × g.
   NOT: Santrifüjlemeden sonra, sıvı üç katmana bölünür ve RNA en üstteki şeffaf sulu fazdadır.
3. En üstteki şeffaf sulu fazı dikkatlice pipetleyin ve yeni bir 1,5 mL RNAse içermeyen santrifüj tüpüne aktarın.
4. Eşit miktarda izopropil alkol ekleyin ve yavaşça karıştırın. Karışımın oda sıcaklığında 10 dakika bekletildikten sonra 4 °C, 12.000 × g'da 15 dakika santrifüj yapmasına izin verin.
5. Süpernatanı çıkarın ve 1 mL% 75 etanol ekleyin. Pelet ve santrifüjü yıkamak için tüpü 4 ° C'de 5 dakika, 7.500 × g yıkayın. Bu adımı tekrarlayın.
6. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve santrifüj tüpünü yaklaşık 20 dakika kurutmak için ultra temiz tezgaha koyun.
   NOT: Beyaz pelet yarı saydam hale geldiğinde bir sonraki adıma geçin. Tüm işlemleri buz üzerinde gerçekleştirin.
7. Peletin tamamen çözülmesi için 20 μL RNAse içermeyen su ekleyin. RNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve RNA çözeltisini -80 ° C'de saklayın.

13. PCR

1. Ters transkripsiyon reaksiyonu
   1. PCR reaksiyon tüpüne 1 μg toplam RNA ekleyin (RNA çözeltisinin konsantrasyonuna göre eklenen RNA çözeltisinin hacmini hesaplayın) ve denatürasyon için 5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
   2. 1 dakika boyunca buz üzerine koyun ve ardından toplam hacim 12 μL'ye ulaşana kadar enzimsiz su ekleyin. 4 μL 4x DNA Master Mix ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   3. Tüpü buz üzerine koyun, 4 μL 5x RT Master Mix ekleyin ve yavaşça karıştırın. Aşağıdaki PCR ayarlarını yapın: 15 dakika için 37 °C, 5 dakika için 50 °C, 5 dakika için 98 °C, 1 dakika için 4 °C.
   4. -20 ° C'de saklayın veya ters transkripsiyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra bir sonraki adıma geçin.
2. PCR reaksiyonu
   1. PCR tüpündeki PCR reaksiyonunu aşağıdaki gibi hazırlayın: 14.1 μL enzimsiz su, 2 μL dNTP, 2 μL 10x Tampon, 0.8 μL Astar (10 μM, 0.4 μL İleri Astar ve 0.4 μL Ters Astar, Malzeme Tablosuna bakınız), 1 μL ters transkripsiyon cDNA (adım 13.1'e bakınız) ve 0.1 μL Taq enzimi.
   2. Hazırlanan PCR reaksiyonunu PCR için PCR aparatına yerleştirin. PCR prosedürü için Taq enzim kitinin talimatlarına bakın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Agarose jel elektroforezi
   1. 242 g Tris ve 37,2 g Na 2 EDTA·_{2H 2O}tartmak için analitik terazi kullanın ve bunları 1 L beherine ekleyin. Beher'e ~ 800 mL deiyonize su ve 57.1 mL buzul asetik asit ekleyin, iyice karıştırın, 50x TAE tamponu elde etmek için 1 L'ye deiyonize su ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Kullanmadan önce 50x TAE tamponunu deiyonize su ile seyreltin.
   2. 1,2 g agaroz tartmak için analitik bir terazi kullanın ve 80 mL 1x TAE tamponu içeren konik bir şişeye ekleyin. Tamamen çözünene kadar mikrodalga fırında tekrar tekrar ısıtın.
   3. Şişeyi, çözelti sıcaklığı 60 ° C'ye düşene kadar akan musluk suyu altında soğutun. 8 μL nükleik asit lekesi ekleyin, iyice karıştırdıktan sonra çözeltiyi jelatinleştirici tanka dökün, tarağı yerleştirin ve 30 dakika oda sıcaklığında bekletin.
   4. Tarağı dışarı çekin ve PCR ürünlerini hazırlanan agaroz jeline yükleyin. 30 dakika boyunca 120 V'ta elektroforez yapın.
   5. Jeli ECL Jel görüntüleme sistemine yerleştirin ve fotoğraflayın.

3D, serumsuz kültür sistemi kurmak
Bu çalışmada, fare LGSC'leri için EGF, Wnt3A, FGF10 ve Y-27632 içeren LGSCM geliştirilmiş ve LGSC'ler 3D kültür yöntemi ile başarılı bir şekilde izole edilmiş ve kültürlenmiştir (Şekil 1A). C57BL / 6 farelerden, NOD / ShiLtJ farelerden, BALB / c farelerden ve ROSA26mT / mG farelerinden LGSC'lerin başarılı bir 3D, serumsuz kültür sistemi bu yöntemkullanılarak kurulmuştur 16. Bir erkek fare için, ayrışma yoluyla iki LG'den 1.5-2 × 106 hücre elde edildi. Bir haftalık kültürden sonra, kültürün başlangıcında 1 × 104 LG hücresi tohumlanırken 30-60 küre oluşturuldu. Ayrıca bu yöntemle kültürlenen hücreler Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestin ve diğer kök hücre belirteçlerini16 ifade ederek elde edilen hücrelerin LGSC'lerin özelliklerine sahip olduğunu göstermektedir. Krt14 ve Ki67, 7 gün boyunca kültürlenen LGSC'lerin oluşturduğu tüm alanlarda eksprese edilmiştir (Şekil 1B), LGSC'lerin kendini yenileme kapasitesine sahip olduğunu göstermektedir.

7 günlük bir kültür sırasında, LGSC'lerin küreleri 100 μm çapa ulaştı. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyaması 7. günde hücresellik gösterdi (Şekil 1C ve Şekil 1F). LGSC'lerin 7 günlük birincil kültür ve alt kültürden sonra elde edilen zenginleştirme faktörleri, bu yöntemle zenginleştirilen LGSC'lerin güçlü proliferatif yeteneğe sahip olduklarını göstermiştir (Şekil 1D). Bu sistemde, LGSC'ler 40 kattan fazla geçiş yapabildi ve hala kök hücre özelliklerini korudular (Şekil 1E ve Şekil 1G). Sonuç olarak, bu yazıda LGSC'ler için in vitro olarak 3D, serumsuz bir kültür sistemi kurmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol tarafından kültürlenen hücreler sürekli ve kararlı proliferatif yeteneğe sahiptir.

İn vitro farklılaşmayı tetikler
LGSC'lerin in vitro farklılaşma kapasiteleri analiz edildi. 7 günden fazla kültürlendiğinde, LGSC'ler yavaş yavaş büyüme yeteneğini kaybetti ve AQP5, Ltf, Krt19 ve farklılaşma ile ilişkili diğer belirteçlerin ekspresyonu artarken, Krt14'ün ekspresyonu kademeli olarakazaldı 16. LGSC'ler FBS tarafından daha fazla tomurcuk ve düşük oranda matris jeli oluşturmaya teşvik edildi (Şekil 2A, B). Ayrıca, H&E boyaması, FBS'nin küreleri daha fazla kavitasyon yapısı üretmeye teşvik edebileceğini göstermiştir (Şekil 2C).

Önceki çalışma, azalan matris sertliğinin LGSC'lerin duktal benzeri organoidlere farklılaşmasını teşvik ettiğini öne sürdü. Bazal tabaka hücreleri, Krt14'ü eksprese eden kök hücrelerin özelliklerini korurken, bazal üst tabaka hücreleri boşlukları olan kanal benzeri yapılara farklılaştı ve Krt19'u eksprese etti. Ek olarak, FBS'nin eklenmesi, LGSC'lerin yüksek nükleer / sitoplazmik orana sahip kök hücrelerin özelliklerini koruyan asinar benzeri organoidlere farklılaşmasını tetikleyebilir. Bazı farklılaşmış asinar benzeri hücreler, düşük nükleer / sitoplazmik oranla yüksek AQP5 seviyelerini eksprese etti16.

 LGSC'leri  in vivo olarak onarın
Yukarıdaki deneylere dayanarak, LGSC'lerin hasarlı LG'leri onarma yetenekleri ortotopik enjeksiyonla araştırıldı. NOD / ShiLtJ farelerde ROSA-LGSC'lerin ortotopik enjeksiyonundan sonra, LG'lere bitişik yeni lakrimal lobüller oluşmuştur (Şekil 3A-C). Lobüllerin çoğu yüksek AQP5 ekspresyonuna sahip olgun asinar hücrelerden oluşuyordu ve düşük AQP5 ekspresyonuna sahip intralobüler kanal oluşumu vardı (Şekil 3D-F). ROSA-LGSC'lerin 8 hafta boyunca enjekte edilmesinden sonra, alıcıların yörüngesindeki çürüme ölçüldü. Ölçümler, LGSC'lerin enjeksiyonunun bozunma alanını ~% 60 oranında azalttığını göstermiştir (Şekil 3G, H). Diseksiyon, LG hacminin enjeksiyondan sonra 10 hafta boyunca arttığını gösterdi (Şekil 3I). ROSA-LGSCs enjeksiyon tarafındaki gözyaşı sekresyon miktarı kontrol tarafına göre daha yüksek, ancak vahşi tip farelerden daha düşüktü (Şekil 3J). Bu sonuçlar, bu kültür sistemi tarafından toplanan hücrelerin LGSC'lerin özelliklerine sahip olduğunu ve ADDED ve kseroftalmi olan farelerde kök hücre tedavisi için kullanılabileceğini göstermektedir.

Şekil 1: LGSC'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu . (A) LGSC birincil ve sürekli geçiş kültürünün stratejisi. (B) 7. günde LGSC'lerin immünofloresan boyaması. LGSC'ler epitel hücre belirteci E-kadherin (kırmızı), kök hücre belirteci Krt14 (kırmızı), proliferatif hücre belirteci Ki67 (kırmızı) eksprese eder. Karşı leke, DAPI (mavi). (C) LGSC'lerin kültürde 1, 3, 5 ve 7 gün boyunca morfolojisi. (D) LGSC kültürünün birincil kültür ve alt kültürde göreceli zenginleşme faktörü. Bağıl zenginleştirme faktörü, 7 günlük kültürden sonra elde edilen toplam hücre sayısının kültürde tohumlanan hücre sayısına oranıdır. P < 0.01. (E) Fare LG'sinin yetişkin kök / progenitör hücre belirteçlerinin ve farklı pasaj LGSC'lerinin (P1, P10, P20 ve P40) transkripsiyonu. (F) 7. günde birincil kültürde LGSC'lerin morfolojisi (solda) ve H&E boyaması (sağda). (G) Farklı pasajlarda (P1, P10, P20 ve P40) kültürlenmiş LGSC'ler. Ölçek çubukları = 50 μm (B, F, G), 100 μm (C). Kısaltmalar: LG = lakrimal bez; LGSC'ler = LG kök hücreleri; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol;; NC = negatif kontrol; TE = tripsin-EDTA; H & E = hematoksilin ve eozin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: LGSC'lerin in vitro farklılaşması. (A,B) Normal ortamda veya farklılaşma ortamında kültürlenen LGSC'lerin morfolojisi. (A) P10'da 10 gün boyunca kültürlenen LGSC'ler (solda: normal ortam, sağda: FBS içeren ortam). (B) P31'de 14 gün boyunca kültürlenen LGSC'ler (solda: normal ortam, sağda: 1/3inci matris jelli ortam). (C) 14 gün boyunca kültürlenen LGSC'lerin H&E boyaması (üst: normal orta, alt: FBS içeren ortam). Ölçek çubukları = 100 μm (A), 200 μm (B), 50 μm (C). Kısaltmalar: LG = lakrimal bez; LGSC'ler = LG kök hücreleri; H&E = hematoksilin ve eozin; FBS = fetal sığır serumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: LGSC'lerin allotransplantasyonunun engraftasyonu ve ADDED semptomlarının giderilmesi. (A-F) NOD / ShiLtJ LG'nin IHC boyaması, 8 hafta sonra 7 günlük ROSA-LGSC kültürleri ile nakledildi. Deney grubu ve kontrol grubuyla aynı farenin sol ve sağ taraflarını kullanın. (A-C) Anti-td-Domates antikoru ile IHC boyama; (D-F) Anti-AQP5 antikoru ile IHC boyama; (A, D) LG, araç enjekte edildi (1: 1 matris jeli ve DMEM / F12 karışımı), (B, E) LS, ROSAA-LGSC'lerle enjekte edildi, (C, F) B, E (kırmızı ok, loblobüler kanal) içindeki siyah karelerin büyütülmüş görüntüleri. (G, H) NOD / ShiLtJ fare göz yörüngesinin durumu, 8 haftada ROSA-LGSC'lerin enjeksiyonundan sonra. LGSC'lerin enjeksiyonu, göz yörüngesindeki çürümeyi önemli ölçüde hafifletir. (I) 10 haftada NOD / ShiLtJ farenin LG'leri (solda: Hücre enjekte edilen taraftan LG, sağ: kontrol tarafından LG). (J) 8 hafta sonra 7 günlük ROSA-LGSC kültürleri ile nakledilen vahşi tip ve NOD / ShiLtJ farelerin gözyaşı hacmi. ROSA-LGSC enjekte edilen LG'lerin gözyaşı hacmi, kontrol LG'lerininkinden daha yüksektir, ancak WT LG'lerinkinden önemli ölçüde daha düşüktür. n = 3; NOD/ShiLtJ fareleri, n = 4; P < 0.01; *P 0,05 <. Ölçek çubukları = 50 μm (A-F). Kısaltmalar: LG = lakrimal bez; LGSC'ler = LG kök hücreleri; IHC = immünohistokimyasal; WT = vahşi tip; ADDED = sulu eksik kuru göz hastalığı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.