Yöntem makalesi

Gelişmekte Olan (Kurbağa) Embriyoda Hücre-Soy Kılavuzlu Kütle Spektrometrisi Proteomikleri

DOI:

10.3791/63586

⸱

21 Nisan 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, 2Department of Anatomy & Cell Biology, The George Washington University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, omurgalı Xenopus laevis embriyosunda bilinen doku kaderlerine sahip hücre soylarının kütle spektrometrisine dayalı proteomik karakterizasyonu açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküler olayların hücreler doku ve organlara yol açtıkça karakterizasyonu, normal gelişimi daha iyi anlama ve hastalıklar için etkili ilaçlar tasarlama potansiyelini artırmaktadır. Çeşitli tiplerin ve çok sayıda proteinin doğru bir şekilde tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlayan teknolojiler, uzay ve zamanda doku ve organizma gelişimini düzenleyen moleküler mekanizmalar hakkında hala eksik bilgi sağlayacaktır. Burada, Xenopus laevis (kurbağa) embriyolarında tanımlanmış hücre soylarındaki binlerce proteinin ölçülmesini sağlayan kütle spektrometrisine dayalı bir protokol sunuyoruz. Yaklaşım, tekrarlanabilir hücre-kader haritalarına ve bu omurgalı gelişim modelinden hücreleri ve soylarını (klonlarını) tanımlamak, floresan olarak etiketlemek, izlemek ve örneklemek için yöntemler üzerine kuruludur. Diseksiyon veya floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile mikro örnekleme veya izole hücreler kullanılarak hücresel içerik toplandıktan sonra, proteinler aşağıdan yukarıya proteomik analiz için ekstrakte edilir ve işlenir. Sıvı kromatografisi ve kılcal elektroforez, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRMS) ile protein tespiti ve nicelleştirilmesi için ölçeklenebilir ayırma sağlamak için kullanılır. Nöral-doku kaderi olan hücrelerin proteomik karakterizasyonu için temsili örnekler verilmiştir. Hücre soy rehberliğinde HRMS proteomik, farklı doku ve organizmalara uyarlanabilir. Omurgalı gelişimi sırasında proteomun uzaysal-zamansal dinamiklerine bakmak için yeterince hassas, spesifik ve nicelikseldir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre farklılaşması ve doku ve organların oluşumu hakkındaki anlayışımız, genlerin ve ürünlerinin onlarca yıllık ayrıntılı hedeflenmiş ekranlarının sonucudur. Önemli hücresel olaylar sırasında tüm biyomoleküller ve miktarları hakkındaki bilgimizi arttırmak, omurgalı vücut planının mekansal ve zamansal modellemesini kontrol eden moleküler mekanizmaların çözülmesine yardımcı olacaktır. Moleküler amplifikasyon ve dizilemeyi mümkün kılan teknolojiler artık çok sayıda gen ve transkript hakkında rutin olarak rapor verebilmekte ve temel biyolojik ve translasyonel araştırmalarda hipotez odaklı çalışmaları desteklemektedir. Gelişmekte olan sistemleri anlamak için, transkripsiy....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus laevis yetişkin kurbağalarının insancıl bakımını ve kullanımını sağlayan tüm protokoller, Maryland Üniversitesi, College Park'taki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (Onay numaraları R-DEC-17-57 ve R-FEB-21-07).

1. Çözümleri hazırlayın

  1. Embriyoloji için
    1. 1x, 0.5x ve 0.2x Steinberg çözeltisini (SS) hazırlayın, ardından standart protokoller12'yi izleyerek steriliteye kadar otoklavlayın (20 dakika boyunca 120 ° C).
    2. Standart protokoller12'yi izleyerek sterilize edilmiş 1x SS'de %3 (w/v) Ficoll hazırlayın....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, X. laevis embriyolarında doku oluştururken tek hücrelerdeki proteinlerin ve soylarının incelenmesini sağlamıştır. Şekil 1, nöral-doku-kader hücrelerindeki proteinleri ve embriyodaki yeni indüklenen nöral ektodermi incelemek için yaklaşımın böyle bir uygulamasını göstermektedir. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, biyoanalitik iş akışı, hücreleri tanımlamak, enjekte etmek / aspire etmek ve örnekleri toplamak için geleneksel hücre ve gelişim biyol.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Xenopus türlerinin embriyolarında tanımlanmış hücre soylarında protein ekspresyonunun karakterizasyonunu sağlar. HRMS'den kaynaklanan metodoloji, moleküler tanımlamada mükemmel özgüllüğü, moleküler problar (genellikle yüzlerce ila binlerce farklı protein) olmadan çoklu protein tespiti yeteneğini ve niceleme yeteneğini birleştirir. Hücre ve gelişimsel (nöro) biyolojideki klasik araçlara ve iş akışlarına uyarlanabilirlik, HRMS proteomiklerini, omurgalı X. laevis embriyosunda kök hücre farklıl.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jie Li'ye (Maryland Üniversitesi, College Park) embriyonik ayrışma ve FACS hakkındaki değerli tartışmalar için minnettarız. Vi M. Quach ve Camille Lombard-Banek'e, bu protokolde vurgulanan proteomik uygulamaları örnekleyen önceki çalışmalarda numune hazırlama ve veri toplama konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışmanın bazı bölümleri IOS-1832968 KARİYER (P.N.'ye) ödül numarası altında Ulusal Bilim Vakfı, R35GM124755 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri (P.N.'ye), Maryland Üniversitesi-Ulusal Kanser Enstitüsü Ortaklık Programı (P.N.'ye) ve COSMOS Club Vakfı araştırma ödülleri (A.B.B. ve L.R.P.'ye) tarafından desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetonitril (LC-MS sınıfı)Fisher ScientificA955
AgarozThermoFisher ScientificR0492
Amonyum bikarbonatFisher ScientificA643-500
Analitik KolonThermo Scientific164941
Analitik mikro teraziMettler-ToledoXSE105DU
Otomatik peptit fraksiyonlama platformuAgilent1260 Infinity II
Borosilikat Kılcal DamarlarSutter Instruments Co.B100-50-10
Borosilikat Kılcal Damarlar (Emmitter yapmak için)Sutter InstrumentsB100-75-10
C18 döndürme kolonları (tuzdan arındırma için)ThermoFisher Scientific89870
Kamera ro monitör elektrospreyEdmund Optics Inc.EO-2018C
Combretastatin A4Millipore SigmaC7744
Ticari CESI sistemiAB SCIEXCESI
(Sikloheksilamino) -1-propansülfonik asit (CAPS)VWR97061-492
Sitokalasin DMillipore SigmaC8273
Dekstran, Alexa Fluor 488; 10.000 MW, Anyonik, SabitlenebilirThermoFisher BilimselD22910
DiothiothreitolFisher BilimselFERR0861
Dumont #5 ForsepsGüzel Bilim Araçları11252-30
EDTAFisher ScientificAAJ62786AP
Epifloresan ışık kaynağıLumencoreAURA III
Eppendorf LoBing mikrosantrifüj ve nbsp; tüpler: proteinFisher Scientific13-698-793
Formik asit (LC-MS-grade)Fisher ScientificA117-50
Dondurucu (-20 &°C; C)Fisher Scientific97-926-1 
Dondurucu (-80 &° C; C)Termo BilimselTSX40086A
Sigortalı silika kılcalMolex1088150596
IsıBloğu BenchmarkBSH300
Yüksek basınçlı sıvı Kromatografi SistemiThermoFisher ScientificDionex Ultimate 3000 RSLC nanosistem
Yüksek voltajlı güç kaynağıSpellmanCZE1000R
Yüksek Çözünürlüklü Kütle SpektrometresiThermoFisher ScientificOrbitrap Fusion Lumos Tribrid Kütle Spektrometresi
HPLC kapaklarıThermo ScientificC4013-40A
HPLC ŞişeleriThermo ScientificC4013-11
Aydınlatıcı, örneğin DeveboynuNikonC-FLED2
Yaratıcılık Yolu AnaliziQiagen
İyodoasetamidFisher ScientificAC122275000
Metanol (LC-MS sınıfı)Fisher ScientificA456
Metanol (LC-MS sınıfı)Fisher ScientificA456-4
Mikrokılcal çektirmeSuttor InstrumentsP-2000
MikroenjektörWarner Instrument, Handem, CTPLI-100A
Micropippette çektirmeSutter Instruments Co.P-1000
MS veri analiz yazılımı, ticariProteomeDiscoverer
MS veri analiz yazılımı, açık kaynaklıMaxQuant
idet olmayan 40 ikameMillipore Sigma11754599001
Petri kabı 60 mm ve 80 mmFisher ScientificS08184
Pierce 10 & mikro; L yatak Fermuarlı uçlar (tuzdan arındırmak için)ThermoFisher Scientific87782
Pierce bikinkoninik asit protein tahlil kitiThermoFisher Scientific23225
Pierce kantitatif kolorimetrik peptit testiThermoFisher Scientific23275
Pierce Tripsin Proteaz (MS Sınıfı)Fisher ScientificPI90058
Protein LoBind şişeleriEppendorf0030108434
, 0030108442
Soğutmalı SantrifüjEppendorf5430R
Soğutmalı İnkübatörThermo ScientificPR505755R/3721
sodyum izetiyonatMillipore Sigma 220078
sodyum pirofosfatSigma Aldrich221368-100G
Paslanmaz çelik BGE şişesiÖzel Yapım
Paslanmaz çelik numune şişeleriÖzel Yapım
Stereomikroskop (objektif 10x)NikonSMZ 1270, SZX18
SükrozVWR97063-790
Şırınga pompaları (2)Harvard Aparatı704506
Şırıngalar (gaz geçirmez): 500 ve ndash; 1000 ve mikro; LHamilton1750TTL
Transfer pipetleri (Plastik, tek kullanımlık)Fisher Scientific13-711-7M
Tuzak KolonuThermo Scientific164750
Tris-HCl (1 M çözelti)Fisher ScientificAAJ22638AP
4&ndash'ta çalışabilen vakum yoğunlaştırıcı; 10 & derece; CLabconco7310022
Vorteks karıştırıcıBenchmarkBS-VM-1000
Su (LC-MS sınıfı)Fisher ScientificW6
Su (LC-MS sınıfı)Fisher ScientificW6
XYZ çeviri aşamasıThorlabsPT3
XYZ çeviri aşamasıÖzel Yapım

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
  2. Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cell Lineage ProteomicsMass SpectrometryXenopus EmbryoProtein QuantificationFluorescence LabelingCell DissectionCapillary ElectrophoresisLiquid ChromatographyHigh Resolution Mass SpectrometryNeural Tissue Proteomics

İlgili makaleler