Yöntem makalesi

Periferik Nöromühendislik için Grafen Bazlı 3D Biyohibrid Hidrojel Biyomürekkebin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/63622

⸱

16 Mayıs 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, periferik doku mühendisliğinde kullanılmak üzere grafen içeren biyohibrid hidrojel biyomürekkebin hazırlanması gösterilmektedir. Bu 3D biyohibrid materyal kullanılarak, kök hücrelerin nöral farklılaşma protokolü gerçekleştirilir. Bu, benzer biyomateryallerin kliniğe getirilmesinde önemli bir adım olabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Periferik nöropatiler aksonal hasarın bir sonucu olarak ve bazen de demiyelinizan hastalıklara bağlı olarak ortaya çıkabilir. Periferik sinir hasarı acil hastaların %1,5-5'inde görülen ve önemli iş kayıplarına yol açabilen küresel bir sorundur. Günümüzde iskeleler, uygun hücre hatları ve biyosinyallerden oluşan doku mühendisliği temelli yaklaşımlar, üç boyutlu (3D) biyobaskı teknolojilerinin gelişmesiyle daha uygulanabilir hale gelmiştir. Çeşitli hidrojel biyomateryallerinin kök hücreler, eksozomlar veya biyo-sinyal molekülleri ile kombinasyonu, periferik sinir rejenerasyonundaki mevcut sorunların üstesinden gelmek için sıklıkla çalışılmaktadır. Bu doğrultuda periferik nöro-mühendislikte hidrojeller gibi enjekte edilebilir sistemlerin veya çeşitli biyobaskı yöntemleriyle oluşturulan implante edilebilir kanal yapılarının üretimi önem kazanmıştır. Normal şartlar altında, kök hücreler vücudun rejeneratif hücreleridir ve popülasyonlarını korumak için sayıları ve işlevleri zamanla azalmaz; Bunlar uzmanlaşmış hücreler değildir, ancak yaralanmaya yanıt olarak uygun stimülasyon üzerine farklılaşabilirler. Kök hücre sistemi, kök hücre nişi olarak adlandırılan mikro çevresinin etkisi altındadır. Periferik sinir yaralanmalarında, özellikle nevrozezde, bu mikro çevre, kopmuş sinir uçlarını cerrahi olarak birbirine bağladıktan sonra bile tam olarak kurtarılamaz. Kompozit biyomalzemeler ve kombine hücresel tedaviler yaklaşımı, biyobozunurluk, biyouyumluluk ve işlenebilirlik gibi çeşitli özellikler açısından malzemelerin işlevselliğini ve uygulanabilirliğini arttırır. Bu doğrultuda bu çalışma, grafen bazlı biyohibrid hidrojel modellemesinin hazırlanması ve kullanımını göstermeyi ve kök hücrelerin sinir rejenerasyonunda etkili bir çözüm olabilecek sinir hücrelerine farklılaşma etkinliğini incelemeyi amaçlamaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organizmanın iç yapısını ve çevreyi birbirine bağlayan mekanizma olan sinir sistemi iki kısma ayrılır: merkezi ve periferik sinir sistemleri. Periferik sinir hasarı, acil servise başvuran hastaların %1,5-5'ini oluşturan ve çeşitli travmalara bağlı olarak gelişen, önemli iş kayıplarına yol açan küresel bir sorundur1,2,3.

Günümüzde periferik nöro-mühendisliğe hücresel yaklaşımlar büyük ilgi görmektedir. Bu yaklaşımlarda kullanılan hücreler arasında kök hücreler ilk sırada gelmektedir. Normal şartlar altında, kök hücreler vücudun rejeneratif hücreleridir ve popülasyonlarını korumak için sayıları ve işlevleri zamanla azalmaz; Bu hücreler uzmanlaşmıştır, ancak yaralanmaya yanıt olarak uygun stimülasyon ile farklılaşabilirler 4,5. Kök hücre hipotezine göre, kök hücre sistemi, kök hücre nişi olarak adlandırılan mikro çevresinin etkisi altındadır. Kök hücrelerin korunması ve farklılaşması, hücreler ve iskeleler kullanılarak doku mühendisliği yoluyla yeniden oluşturulabilen mikro çevrelerinin varlığı olmadan imkansızdır6 7. Doku mühendisliği hem mühendislik hem de biyoloji ilkelerini içeren multidisipliner bir alandır. Doku mühendisliği, canlı dokuların yerini alabilecek ve hasarlı dokuların çıkarılması ve fonksiyonel dokuların sağlanması yoluyla bu dokuların yenilenmesinde kullanılabilecek yapay dokuların oluşturulması için araçlar sağlar8. Doku mühendisliğinin üç temel taşından biri olan doku iskeleleri, doğal ve sentetik malzemelerden farklı yöntemler kullanılarak üretilmektedir9. Üç boyutlu (3D) baskı, çeşitli yöntemler kullanarak karmaşık şekillerin basit ama çok yönlü üretimi yoluyla kusurlu dokuları değiştirmek veya restore etmek için yaygın olarak kullanılan, gelişmekte olan bir katmanlı üretim teknolojisidir. Biyobaskı, biyomürekkepler10 olarak adlandırılan hücrelerin ve biyomalzemelerin bir arada bulunmasını sağlayan katkısal bir üretim yöntemidir. Sinir hücrelerinin birbirleriyle etkileşimi göz önüne alındığında, çalışmalar grafen gibi iletken biyomateryal adaylarına kaymıştır. Esnek elektronik, süper kapasitörler, piller, optikler, elektrokimyasal sensörler ve enerji depolama gibi özelliklere sahip olan grafen nanoplakalar, doku mühendisliği alanında tercih edilen bir biyomalzemedir11. Grafen, hasarlı doku ve organların çoğalması ve yenilenmesinin yapıldığı çalışmalarda kullanılmıştır12,13.

Doku mühendisliği üç temel yapı taşından oluşur: iskele, hücreler ve biyosinyal molekülleri. Periferik sinir hasarı ile ilgili çalışmalarda bu üç yapının tam olarak sağlanması açısından eksiklikler bulunmaktadır. Çalışmalarda üretilen ve kullanılan biyomateryallerde sadece kök hücre veya biyosinyal molekülleri içermeleri, kök hücre farklılaşmasını sağlayacak biyoaktif molekülün olmaması, kullanılan biyomateryalin biyouyumluluğunun olmaması, doku nişindeki hücrelerin çoğalması üzerindeki etkisinin düşük olması gibi çeşitli sorunlarla karşılaşıldığı, ve böylece sinir iletiminin tam olarak gerçekleşmemesi 2,13,14,15,16. Bu, sinir rejenerasyonunun optimizasyonunu, kas atrofisinin 17,18'in azaltılmasını ve bu tür sorunlara karşı büyüme faktörleri ile gerekli homing 19'un oluşturulmasını gerektirir. Bu noktada, kliniğe aktarılacak bir cerrahi biyomateryal prototipinin nöroaktivitesinin karakterizasyonu ve analizi çok önemlidir.

Buna göre, bu yöntem çalışması, bir 3D biyoyazıcı tarafından oluşturulan grafen nanoplakaları ile biyomürekkep hidrojel desenlemesini ve içerdiği kök hücrelerin nörojenik farklılaşması üzerindeki etkinliğini araştırmaktadır. Ayrıca, grafenin nörosfer oluşumu ve farklılaşması üzerindeki etkileri araştırılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinin kültürlenmesi

  1. Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerini (WJ-MSC'ler, ATCC'den) -80 ° C'lik bir dondurucudan çıkarın. DMEM-F12 ortamındaki kültür WJ-MSC'leri, Yurie ve ark.20'de tanımlandığı gibi, oda sıcaklığında steril bir laminer akışta% 10 fetal buzağı serumu (FBS),% 1 Pen-Strep ve% 1 L-glutamin içerir.
  2. Bazı hücreleri 1 x 106 hücre / mL'de% 35 FBS,% 55 DMEMF-12 ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren dondurma ortamı ile kriyoproteksiyona uğratın. Bunun için, bir Thoma hücre sayma slaytında 1 x 106 hücre sayın ve dondurma solüsyonunu damla damla ekleyin. Slaytı hızlı bir şekilde sıvı azot kabına aktarın.
  3. Kültürlenmiş hücreler şişede% 80 oranında birleştiğinde, ortamı dökün ve 5 mL PBS ile yıkayın. 5 mL% 0.25 tripsin ve 2.21 mM EDTA-4Na ekleyin. Bir inkübatörde 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
  4. İnkübatörden çıkarılan hücrelere% 10 FBS ile 10 mL DMEM-F12 ortamı ekleyin. İyice askıya alın, ortamı toplayın ve ortamı bir santrifüj tüpüne aktarın.
  5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 101 x g dönüş hızında santrifüj. Süpernatantı atın ve hücreleri% 10 FBS içeren taze besin ortamı ile yeni şişelerde yeniden tohumlayın.
    NOT: Transdüksiyon yöntemiyle GFP geni ile etiketlenmiş ticari WJ-MSC'ler, üretilecek biyomateryal-hücre etkileşimlerini daha iyi görselleştirmek için kullanılabilir21. Bu yöntemde kullanılacak gruplar Tablo 1'de gösterildiği gibi oluşturulabilir.

Oluşturulan GruplarOluşturma nedenleriTekrar sayısı
2B WJ-MSC'ler (2D-C)2D Kontrolx 5
2D WJ-MSC'ler ve Grafen (2D-G)2D'de grafen toksik doz tayiniFarklı konsantrasyonların her birine x 5 tekrar
WJ-MSC'ler biyomürekkeplere dahildir (3D-B)3D Kontrolx 3
WJ-MSC'ler ve% 0.1 Grafen, biyomürekkeplere (3D-G) dahil edilmiştir3D Grafen-Bioink Biyohibrid Grubux 3
WJ-MSC'ler biyomürekkepler üzerinde küresel formdadır (3D-BS)Küresel Formun 3D Kontrolüx 3
WJ-MSC'ler ve% 0.1 Grafen, biyomürekkepler üzerinde küresel formdadır (3D-GS grubu)3D Grafen-Bioink Biyohibrid Sferoid Form Grubu3 kat
3D Bioink damlasıSEM ve FTIR karakterizasyon analizleri için üretilmiştir.5 kat
3D Grafen damlasıSEM ve FTIR karakterizasyon analizleri için üretilmiştir.5 kat
GFP etiketli WJ-MSC'li 3D Bioink ve% 0.1WJ-MsC'lerin uygun grafen dozunu içeren biyomürekkep içindeki hareketlerinin gözlemlenmesi.3 kat

Tablo 1. Yöntemdeki gruplar. Yöntemdeki tüm 2B ve 3B gruplar dahil edilir.

2. Grafen toksisitesi ve 2D görüntüleme

  1. Grafen konsantrasyonlarının hazırlanması ve hücrelere uygulanması
    NOT: Ham grafen nanopartikülleri ticari olarak satın alındı (endüstriyel grafen nanoplakaları tipi) ve ayrıca bağışlandı. Parçacıkların boyutları 5-8 nm kalınlıkta, 5 μm çapında ve yüzey alanında 120-150 m2/g idi.
    1. %1'lik bir çözelti (mg/mL) oluşturmak için grafeni tartın. Tartılmış 100 μg grafen nanopartiküllerine% 10 FBS ile 10 mL DMEMF-12 ortamı ekleyerek bir stok çözeltisi yapın ve bu çözeltiyi stok çözeltisi olarak etiketleyin. 121 °C'de 1,5 atm basınç altında 20 dakika boyunca otoklavda sterilize edin.
      NOT: Steril grafen karışımı buzdolabında 4 °C'de kullanıma kadar saklanır. Uzun süreli kullanım için uygun olmayabilir (en fazla 1 ay). Bu durumlarda, karışım yeniden oluşturulmalı ve sterilize edilmelidir.
    2. Toksik olmayan dozları belirlemek için farklı konsantrasyonlarda bir orta grafen karışımı hazırlayın. İlk seyreltmeleri %1, %0,1, %0,01, %0,001 ve %0,0001 grafen/ortam olarak ayarlayın.
    3. % 1 stok çözeltisinden başlayarak, her konsantrasyondan art arda 1 mL alın ve yeni bir tüpe aktarın. Her tüpe% 10 FBS ile 9 mL DMEMF-12 ortamı ekleyin, kademeli olarak seyreltilmiş beş numune yapın ve eşit dağılım elde etmek için çözeltileri sallayın ve vorteks edin. Kontrol olarak FBS ile sadece 10 mL DMEMF-12 ortamı kullanın.
      NOT: Grafenin ağır pulları çökelir ve bu nedenle yeniden dağıtılması gerekir.
    4. WJ-MSC'leri, kuyu başına 5 x 105 hücrede% 10 FBS içeren 2 mL taze ortam içeren 6 delikli plakalara tohumlayın. 37 ° C'de 1 gün boyunca inkübe edin. Ardından, plakaları eşit ve tekrarlanan kuyucuk gruplarına bölün. Her konsantrasyon için beş tekrar yapın.
    5. Ortamı atın ve ardından ortamı, kuyucuk başına 2 mL'de grafen ortam konsantrasyonlarıyla değiştirin. Kontrol grubu için yalnızca ortamı kullanın. Plakaları 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. MTT ile toksik olmayan grafen konsantrasyonlarının belirlenmesi
    1. 24 saat sonra grafen içeren ortamları atın. Her bir kuyucuğu PBS ile yıkayın. Kuyu başına 10 mL'de% 10 FBS ile taze DMEMF-12 ortamı ekleyin.
      NOT: Grafen konsantrasyonlarının hücre üzerine uygulanmasından sonra PBS ile yıkanması önemlidir, çünkü endositoz tarafından hücreye alınmayan grafen nanopartikülleri ortamdan uzaklaştırılır. Bu, MTT testini daha verimli hale getirir.
    2. Kose ve ark.22'de ve 2.2.3.-2.2.6 adımlarında açıklandığı gibi,% 50 hücre canlılığını gösteren IC50 değerini belirlemek için MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil-tetrazolyum bromür) protokolünü kullanın.
    3. İlk olarak, 5 mg / mL MTT tuzunu tartın ve PBS'de çözün. 0,45 μm filtre kullanarak sterilize edin. 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde yapılan MTT çözeltisini alüminyum folyo ile sarın ve 4 ° C'de saklayın.
    4. Tüm kuyucuklara 10 μL MTT ekleyin ve plakayı 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra mikroskop altında 10x büyütmede formazan kristallerinin oluşumunu gözlemleyin.
    5. Hücrelerde oluşan kristalleri çözmek için, her bir oyuğa 100 μL DMSO ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika saklayın. Plakayı ELISA plaka okuyucuya takın. Absorbans ölçümü için programdan 570 nm'lik bir dalga boyu ayarlayın veplaka 22'yi okumasını sağlayın.
      NOT: Ek olarak, grafen parçacıkları tek başına 270 nm23'te okunurken, buradaki 570 nm24 okuma aralığı yalnızca hücre canlılığını okumak için olacaktır.
    6. İstatistiksel analiz programında Tukey'in testi ile tek yönlü ANOVA kullanarak elde edilen sonuçlar üzerinde istatistiksel analiz yapmak.
  3. Dikiş görüntüleme
    1. Farklı grafen konsantrasyonlarının hücrelerle etkileşimini incelemek için, dikiş görüntüleme adı verilen yöntemle hücrelerin hızlandırılmış bir çalışmasını gerçekleştirin. Bu yöntem, mikroskop altında düzenli aralıklarla alınan görüntü örneklerini kullanarak hızlandırılmış bir görüntü oluşturur.
    2. Bunu yapmak için önce bilgisayarı açın. Hızlandırılmış görüntüleme inkübatörünü açın ve 37 °C'ye ayarlayın. MTT plakasını hızlandırılmış inkübatör yuvasına yerleştirin.
    3. Bilgisayarda Stitch programını açın. Sistemde okunacak kuyucukları belirtin. Okuyucuyu ilk kuyucuğa getirin ve alanı beyaz ışıkta 10x büyütmede bulun ve odaklayın. Programı başlatın.
      NOT: Yüksek kaliteli 4 satır x 5 sütun çoklu fotoğraf kolajları oluşturmak için bir programdır. Program, birbiri ardına çekilen fotoğrafları HD kalitesinde birleştirir. Sistem başlat düğmesine bastığınızda, kuyular otomatik olarak okunur ve 4 satır x 5 sütun birden fazla fotoğraf çeker ve diker.

3. Grafen - Bioink biyohibrid hidrojel üretimi ve WJ-MSC'lerin farklılaşması

  1. Biyomürekkep üretimi
    NOT: Liyofilize ticari olarak temin edilebilen Aljinat-Jelatin (3:5) tozları, biyomürekkeplerin temeli olarak kullanılır. Grafen biyomürekkep grubu (3D-G; 3D-GS) ve grafen içermeyen kontrol biyomürekkep grubu (3D-B; 3D-BS) aynı yöntemle hazırlanır (Tablo 1).
    1. Hazırlık için 50 mL konik tüpler kullanın. İlk olarak, 4.5 mg aljinat ve 1.5 mg jelatin tartın ve bir santrifüj tüpüne aktarın. Karışıma% 10 FBS içeren DMEMF-12 ortamını toplam 50 mL hacme ekleyin. Bu, grafen içermeyen kontrol (C) grubudur.
    2. 4.5 mg aljinat ve 1.5 mg jelatin tartımını tekrarlayın ve bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, adım 2.1.3'ten hazırlanan% 0.1 grafenden 50 μL alın. ve tüpe ekleyin. DMEMF-12'yi FBS ile toplam 50 mL hacme ekleyin.
    3. Biyomürekkepleri önce pipetleme ve ardından vorteks ile karıştırın. 121 °C'de 1,5 atm basınç altında 20 dakika boyunca otoklavda sterilize edin. Alternatif olarak, kaynama noktasına kadar mikrodalga fırınlayarak sterilizasyon gerçekleştirin.
    4. Karışımlar otoklavlandıktan sonra, oluşan kabarcıkları gidermek için oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 280 x g'de santrifüj. Hücreler hazırlanana kadar biyomürekkepleri 37 ° C'de tutun.
  2. WJ-MSC'lerin ve 3D biyobaskının eklenmesi
    1. Sayım için, yaklaşık 5 mL PBS ile% 80 birleşme olduğunda hücreleri yıkayın ve 5 mL% 0.25 tripsin ve 2.21 mM EDTA 4Na ekleyin. 37 °C'de 5 dakika bekletin.
    2. İnkübatörden çıkarıldıktan sonra hücrelere% 10 FBS ile 10 mL DMEM-F12 ortamı ekleyin. İyice askıya alın, ortamı toplayın ve bir santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklıklarında 5 dakika boyunca 101 x g'de santrifüj yapın ve ardından süpernatanı atın.
    3. Pelet ile yaklaşık 250 μL orta bırakın. Peletleri 1 mL taze ortamda tekrar çözün. 48 μL ortama, 4 saymak için konik bir tüpe (1,5 mL) 2 μL hücre süspansiyonu ve 50 μL tripan mavisi (0,4 g tripan mavisi / 100 mL) ekleyin. İyi pipet yapın.
    4. Hazırlanan boyalı hücre süspansiyonunun yaklaşık 10 mL'sini bir Thoma hücre sayım odasına ekleyin. Işık mikroskobunun her iki tarafındaki karelere düşen ortalama hücre sayısını hesaplayın.
      Canlılık yüzdesini hesaplayın (%) = (sayılan canlı hücreler/sayılan toplam hücre) x 100
      NOT: Hücre-biyomürekkep etkileşimi iki şekilde incelenir: (1) Biyomürekkeplere eklenerek basılabilir (3D-B; 3D-G); (2) Hücreler preslendikten sonra biyomürekkepler üzerine ekilir ve hücreler bir küre oluşturur (3D-BS; 3D-GS).
    5. Hücre-biyomürekkep etkileşimi için, önce biyomürekkep gruplarını oluşturun (Tablo 1). Grup 1, biyobaskı için biyomürekkeple basılmış 3D-B ve 3D-G'yi içerir. Grup 2, biyobaskıdan sonra sferoidlerin oluştuğu 3D-BS ve 3D-GS biyomürekkeplerini içerir.
    6. Grup 1 için hücreleri sayın, böylece 0,5 mL ortamda yaklaşık 1 x 107 hücre olur. Toplam hacmi 5 mL'ye çıkarmak için 4,5 mL biyomürekkep ekleyin. Bunu şırıngalar yardımıyla steril kabindeki kartuşlara aktarın. Kartuşları biyoyazıcının ilgili ekstrüder bölümüne takın.
    7. İkinci grup için, biyomürekkep gruplarının her birinden 5 mL alın ve bunları bir enjektör yardımıyla steril kartuşlara aktarın.
    8. İki koaksiyel yazıcı kafasına ve pnömatik tahrikli ekstrüzyon teknolojisine sahip biyoyazıcıyı kullanın. Mikro adım başına X/Y/Z çözünürlüğünü 1,25 μm, ekstrüzyon genişliğini 400 μm ve ekstrüzyon yüksekliğini 200 μm olarak ayarlayın. 20 mm x 20 mm x 5 mm ızgara, 3D biyobaskı çalışmaları için en çok kullanılan 3D modellerden biridir.
    9. Açık kaynaklı, web tabanlı CAD programlarını kullanarak 3B modeller oluşturun. Biyobaskıdan önce, açık kaynaklı platformlardan biriyle (örneğin, dolgu) basit 3B modeller oluşturun. Model doğrusal (burada kullanılan model gibi), petek veya ızgara şeklinde olabilir. 5 mm x 20 mm x 20 mm kare oluşturduktan sonra .stl formatında dışa aktarın ve indirin.
    10. Bioprinter yazılımı .stl dosyalarını kullanır ve dilimleyici modülleri kullanarak bunları yazdırılabilir .gcode biçimine dönüştürür. Yazdırılabilir bir ızgara şekli elde etmek için, dilimleyici modülündeki dış kabuğu devre dışı bırakın. İşlemden önce cihazı p etanol ile silin ve ardından UV sterilizasyonu ile sterilize edin.
    11. Biyobaskı işlemi için, biyomürekkep gruplarını bir enjektör yardımıyla kartuşlara aktarın. Kartuşları biyoyazıcının ilgili ekstrüder bölümüne takın.
    12. 3D yazıcının ortalama basıncını 7,5 psi'ye, kartuş ve yatak sıcaklığını ise 37 °C'ye ayarlayın. Hızı% 60'a ayarlayın ve standart bir 3D baskı işlemi gerçekleştirin.
      NOT: Hazırlanan modellerin mekanlarla (lineer bir model gibi) planlanması, biyobaskı sonrası mekanlarda hücre kültürünün yapılmasına olanak sağlar.
    13. Yazma aşamasında sistemi ev konumuna getirin. Eksenleri (X, Y, Z) otomatik olarak konumlandırın, ekstrüderi seçin ve ayarlayın. Yazdırma işlemini başlatın. Biyobaskı işleminden sonra, numuneyi alın ve laminer akış dolabının altına yerleştirin.
    14. Biyomürekkepleri baskıdan sonra 0,1 N CaCl2 çözeltisi ile püskürtün veya oda sıcaklığında bir pipetle 1 mL çözelti ekleyin. Yaklaşık 10-20 saniye bekleyin ve basılı desenleri Ca 2+ ve Mg2+ içeren PBS ile 2 kat yıkayın.
    15. Hücre içeren biyomürekkep gruplarının her birinin üzerine% 10 FBS ortamı ile 2 mL DMEMF-12 ekleyin. Plakaları 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin. Daha sonra, sferoid oluşum için her gruba 1 x 106 hücre içeren 2 mL süspansiyon ortamı ekleyin.
    16. Plakaları 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin. 24 saat inkübasyondan sonra, ters çevrilmiş bir mikroskop altında küresel oluşumu gözlemleyin.
  3. WJ-MSC'lerin nöron benzeri hücrelere farklılaşması
    1. 24 saatlik inkübasyondan sonra tüm biyomürekkep partilerini gözlemleyin ve fotoğraflayın. Kuyu başına 2 mL nörojenik farklılaşma ortamı ekleyin (kontrol grubu hariç) ve her 2 günde bir yenileyin. Nöral farklılaşmayı gözlemlemek için 7 gün boyunca takip edin.

4. Grafen-Bioink biyohibrid hidrojel karakterizasyonu

NOT: Grafen-biyomürekkep biyohibrid hidrojelin karakterizasyonu için hızlandırılmış görüntüleme, Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi (FT/IR) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizleri yapılmaktadır. Numuneler, FT/IR ve SEM analizi için damlama yöntemi ile 3D-B ve 3D-G biyomürekkep gruplarından oluşturulur.

  1. FT/IR analizi
    NOT: FT/IR, malzeme karakterizasyonu için vazgeçilmez olan matematiksel Fourier dönüşümüne dayanan kimyasal bir analitik yöntemdir. Halojen lambalı, su soğutmalı cıva ışık kaynağı, 4 cm−1 sinyal en boy oranına sahip, 2.200 cm−1'de 1 dakika boyunca ölçülen, 28 °C Michelson interferometre prensiplerine dayanan bir FT/IR cihazı kullanın.
    1. FT / IR mikroskobunu hazırlayın ve cihazın optiklerinin hizalandığından emin olun. Cihazı kalibre edin.
    2. Numune bir damla halinde olduğundan, 1-2 mm kalınlığında bir hidrojel parçası alın ve numune kısmına forseps ile yerleştirin. Numuneye odaklanın ve yakın temas kurulana kadar yükseltin. İşlemi sistemden başlatarak numune spektrumunu toplayın.
  2. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizi
    NOT: Yüzey morfolojisi, iç yapısı, hücre dağılımı ve biyomürekkep-hücre etkileşimleri farklı boyutlarda SEM analizi ile incelenebilir.
    1. Pipet ucu damlacık yöntemini kullanarak hidrojeli 1 mL CaCl2 çapraz bağlayıcı içeren 6 delikli plakalara bırakın (bkz. Şekil 1).
    2. Tuz çözeltisini serbest bırakmak için plakaları yaklaşık 1 mL PBS ile 2 kat yıkayın. Daha sonra, bu damlaları forseps yardımıyla 5 mL% 5 paraformaldehit içeren bir şahin tüpüne koyun.
    3. Bir neşter yardımıyla damla biyomürekkeplerinden ince kesitler yapın. Numuneleri metal plakanın yapışkan tarafına yapıştırın. Havayı argon gazı ile değiştirerek plazma fazına geçen altın paladyumun numuneyi kapladığı kaplama cihazına yerleştirin.
    4. Elektron mikroskobuna (SEM) koyun. SEM'in bağlı olduğu mikroskop programını açın. Ölçeklendirmeyi gerçekleştirin ve örneğin farklı bölümlerinin görüntülerini çekin. Bu protokol için 5 μm, 10 μm ve 200 μm ölçekler kullanıldı. 3D-B ve 3D-G grupları için toplam 40 görüntü çekildi.
  3. Hızlandırılmış görüntüleme
    NOT: Hızlandırılmış görüntüleme sırasında, sadece GFP gen dönüştürülmüş hücreleri içeren biyomürekkep örnekleri kullanılmadı, aynı zamanda sferoidli biyomürekkepler de 16 saat boyunca görüntülendi. Grafenin kök hücreler üzerindeki etkilerini incelemek ve biyomürekkep içindeki hücre etkileşimlerini izlemek için hızlandırılmış görüntüleme yapılır.
    1. Piyasada satılan 1 x 107 GFP etiketli MSC'leri adım 3.2.11'deki gibi 5 mL biyomürekkep ve biyobaskıya ekleyin. 1 mL çapraz bağlayıcı ekleyin, 20-30 s bekleyin ve PBS ile 2 kat yıkayın.
    2. Hızlandırılmış monitörü açın ve programı bilgisayarda açın. Hızlandırılmış modda yaklaşık 16 saat ayarlayın ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın. Başlat düğmesine basın. 40 s hızlandırılmış video örnekleri şeklindeki videolar sistem tarafından kaydedilir.
    3. Mikroskobu her 2 saatte bir 10x büyütmeye odaklayın. Ayrıca, aynı adımları izleyerek oluşturulan sferoidleri görselleştirin.

figure-protocol-1
Resim 1: Karakterizasyonda kullanılmak üzere damla olarak üretilen 3D-B ve 3D-G biyomürekkep grupları. (A) Çapraz bağlayıcılı bir plaka üzerindeki biyomürekkep örnekleri (ön karakterizasyon görüntüsü). (B) Biyomürekkebin 3D-B damla görüntüsü. (C) 3D-G bioink damla görüntüsü. Karakterize edilecek biyomateryal ve içerdiği hücreler, altın kaplama, örnekleme vb. işlemlerden daha kolay geçebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

5. İmmün boyama yöntemi ile nörojenik farklılaşmanın belirlenmesi

  1. Küre formlarını kesintiye uğratmadan sferoidleri toplayın ve doku kesitleme için parafine gömmek yerine, daha kolay bir yöntemle restain etmek için yeni plakalara yeniden tohumlayın.
  2. 48 delikli plakaları yaklaşık 20 mL önceden otoklavlanmış% 0.1 jelatin çözeltisi ile örtün ve en az 1 saat boyunca bir inkübatörde tutun. Pipet, yaklaşık 500 μL hazırlanmış% 0.1 jelatini 48 delikli plakalara dönüştürür. Jelatinli plakaları inkübatörde 10 dakika bekletin.
    NOT: Bu, jelatinin hafifçe şişmesine, yüzeyi kaplamasına ve toplanan sferoidlerin yapışması için daha iyi bir ortam yaratmasına izin verecektir.
  3. Sferoidleri pipetleme yoluyla toplayın, toplanan sferoidleri inkübatörden 48 delikli plakanın kuyucuklarına dağıtın ve taze ortam ekleyin. Ardından, 12-24 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: Sferoidleri sayarak dağıtmak oldukça zordur. Sferoidleri tek bir tüpte toplayın ve toplam hacmi kuyucuklara eşit olarak dağıtın. Bu çalışma için, her bir kuyu yaklaşık 4-6 sferoid içeriyordu.
    NOT: 2D numuneler için ön leke yıkama yeterlidir ve ortam değişimi gerekmez.
  4. Ortamı çıkarın ve sferoidler en üstte olacağından hücreleri PBS ile yavaşça yıkayın. 2 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
  5. Numuneleri PBS ile tekrar yıkayın ve 30 dakika boyunca yaklaşık 10 mL% 2 BSA ve% 0.1 TritonX ile bloke edin. Ardından, PBS 3x ile yıkayın.
  6. Seçilen primer antikorları (N-kadherin-tavşan ve β-III tübülin-fare) antikor seyreltici reaktif çözeltisi ile 1:100 oranında seyreltin. Numunelerin her birine 100 μL antikor çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  7. Numuneleri PBS ile 3 kat yıkayın. β-III tübülin için anti-fare IgG-FTIC-tavşan ve N-Cad için anti-fare IgG-SC2781-keçi ikincil antikoru ile inkübe edin, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1:200'e seyreltilir. Tüm işlemleri karanlıkta gerçekleştirin.
    NOT: Çift boyamada birincil antikor (örneğin fare) olarak hangi suş kullanılırsa, ikincil antikor için farklı bir suş (örneğin keçi veya tavşan) kullanılmalıdır.
  8. İkincil antikoru PBS 3x ile yıkayın ve ardından DAPI çözeltisini (1:1) numunelerin her birine damlatın. 15-20 dakika bekleyin. İmmünofloresan görüntüleme yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grafen toksisitesi ve 2D görüntüleme
Elde edilen MTT sonuçlarının istatistiksel analizi, istatistiksel analiz yazılımında Tukey'in testi ile tek yönlü ANOVA ile yapılmış olup, elde edilen grafik Şekil 2'de gösterilmiştir. Kontrole kıyasla grafen yüzdesi sadece% 0.001 grafen konsantrasyonu için anlamlı bir düşüş gösterdi (**p < 0.01).. Diğer gruplar ile kontrol arasında anlamlı fark saptanmadı (p > 0.05). Bu nedenle, MTT test sonuçlarına ve dikiş görüntülerine göre b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mühendislik ürünü 3D iskelelerle uygulanan tedavilerin geleneksel 2D yöntemlere göre avantajları her geçen gün daha belirgin hale gelmektedir. Bu tedavilerde tek başına veya biyouyumluluğu düşük, biyolojik olarak parçalanabilirliği düşük çeşitli biyomalzemelerden üretilen iskelelerle birlikte kullanılan kök hücreler periferik sinir rejenerasyonunda genellikle yetersiz kalmaktadır. Wharton'un jöle mezenkimal kök hücreleri (WJ-MSC'ler), özellikle edinim protokollerinin optimizasyonu, çoğalma yetenekleri ve farklılaşma kapa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Proje, 3D biyobaskı teknolojisinin geliştiricisi HD Bioink ile işbirliği içinde gerçekleştirildi.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan grafen, Kırklareli Üniversitesi Makine Mühendisliği Bölümü'nde geliştirilmiştir. Dr. Karabeyoğlu tarafından bağışlanmıştır. Grafen toksisite testi, TÜBİTAK 2209-B-Sanayi Odaklı Lisans Tez Destek Programı kapsamında tamamlanan "Grafen Katkılı Biyomürekkepli 3D Biyoyazıcılarda Mezenkimal Kök Hücrelerin Basımı ve Farklılaştırılması" (Uygulama No: 1139B411802273) başlıklı proje ile finanse edilmiştir. Çalışmanın diğer kısmı ise Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (TSA-2021-4713) tarafından sağlanan araştırma fonu tarafından desteklenmiştir. Hızlandırılmış görüntüleme aşamasında kullanılan GFP'li mezenkimal kök hücreler Virostem Biyoteknoloji tarafından bağışlandı. Yazarlar, verimli tartışmalar için Darıcı LAB ve YTÜ Hücre Kültürü ve Doku Mühendisliği LAB ekibine teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar

Santrifüj		HitachiHücre kültürü ve biyomateryal aşamasında kullanılır
0.1N CaCl2HD BioinkÇapraz bağlayıcı
0.22 ve mikro için kullanılır; m membran filtreA ve iota; S&IOTA; moSterilizasyon için kullanılır
0.45 ve mikro; m şırınga filtresiA ve iota; S&IOTA; moSterilizasyon için kullanılan
1.5 mL konik tüpEppendorfaBioink damlası için kullanılır
15 mL Falcon tüpYuvasıHücre kültürü adımında kullanılan
25 cm2 hücre kültürü şişeleri (Falcon, TPP doku kültürü şişeleriNestHücre kültürü için kullanılır
3D BiyobaskıAxolotl Biosystems Bio A2 (Türkiye)Biyobaskı Adımı
50 mL Falcon tüpYuvasıHücre kültürü aşamasında
kullanılır 6/24/48/96 kuyulu plakalar (Falcon, TPP mikroplakalar)Merck MilliporeHücre kültürü adımında kullanılır
75 cm2 hücre kültürü şişeleri (Falcon, TPP doku kültürü şişeleriYuvaHücre kültürü için kullanılır
Anti fare IgG-FTIC-tavşanSanta Cruz BiyoteknolojiJ1514İkincil antikor, boya
için kullanılırAnti fare IgG-SC2781-keçiSanta Cruz BiyoteknolojiC3109İkincil antikor, boya
Au kaplama cihazı EM ACE600LeicaSEM görüntüleme öncesi biyomalzeme bölümünün altın kaplaması için
OtoklavNUVE-OT 90LSterilizasyon işlemi için kullanılır.
OtoklavNUVE-OT 90LSterilizasyon işlemi için kullanılır.
kültürü işlemi için kullanılanCell Cultre CabineHera Safe KS
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium/Nutrient Mix-F12SigmaRNBJ7249Hücre kültürü ortamı olarak kullanılır
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM QuantaFEG 450SEM için
Fetal Sığır Serumu-FBSCapricornFBS-16Ahücre kültürü ortamına eklenerek kullanılmıştır.
Dondurucu -80 derece; CPanasonicMDF-U5386S-PEHücreleri ve elde edilen eksozomları depolamak için kullanıldık
Jelatin-Aljinat biyomürekkep tozuHD BioinkÜretilen biyomürekkep adımı için kullanılır
GFP etiketli-WJ-MSC'lerVirostemHücre-biyomürekkep etkileşimini görüntülemek için kullanılır
Grafen nanoplateletler (Grafen-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.Üretim için kullanılan 3D-G biyomürekkep
İmmünofloresan antikorları (N-CAD; β-III Tubulin)Hücre Sinyalizasyonu ve Santa CruzBoya için kullanılır
JASCO 6600TetraFTIR
Canlılık testi
Penisilin / Streptomisin ÇözeltisiOğlakPB-SKontaminasyonu önlemek için ortama eklendi hücre kültüründe.
Thoma slideIsolabHücre sayımı için kullanılır
Hızlandırılmış Görüntüleme SistemiZeiss Axio.Observer.Z1Görüntüleme
Tripsin-EDTAMulticellŞişe, yüzeyi kaplayan hücreleri çıkarmak için kullanıldı.
VorteksBiyobazÜretilen biyomürekkep adımı
için WJ-MSC'lerATCCHücre kültürü işlemi için kullanılır
kullanılır Hücre , MTT Testi için Sigma için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
  2. Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
  3. Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195(2021).
  4. Allahverdiyev, A. Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , Nobel Medicine Bookstore. Istanbul. (2018).
  5. Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
  6. Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
  7. Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman's Medical Cell Biology, Fourth Edition. , Academic Press. 361-380 (2021).
  8. Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
  9. Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
  10. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).
  11. Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743(2021).
  12. Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
  13. Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
  14. Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
  15. Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
  16. Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
  17. Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
  18. Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
  19. Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
  20. Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448(2017).
  21. Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
  22. Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
  23. Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
  24. Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
  25. Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658(2019).
  26. Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
  27. Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789(2013).
  28. Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , E- ISBN: 978-605-70057-4-8 (2020).
  29. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
  30. Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
  31. Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
  32. Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
  33. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Grafen Hidrojel Biyo M rekkep3B Biyo BaskK k H cre DiferansiyasyonuN ral RejenerasyonSferoid Olu umuMezenkimal K k H crelermm n boyamaH cre skele Etkile imi

İlgili makaleler