Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Mevcut protokol, aynı anda birden fazla beyin yapısından in vivo olarak yerel alan potansiyellerini kaydetmek için özel yapım mikroelektrot dizilerinin yapımını açıklamaktadır.

Abstract

Araştırmacıların genellikle birkaç beyin yapısından aynı anda yerel alan potansiyellerini (LFP’ler) kaydetmeleri gerekir. İstenilen birden fazla beyin bölgesinden kayıt yapmak farklı mikroelektrot tasarımları gerektirir, ancak ticari olarak temin edilebilen mikroelektrot dizileri genellikle böyle bir esneklik sunmaz. Burada, mevcut protokol, LFP’leri aynı anda farklı derinliklerde birden fazla beyin yapısından kaydetmek için özel yapım mikroelektrot dizilerinin basit tasarımını özetlemektedir. Bu çalışmada bilateral kortikal, striatal, ventrolateral talamik ve nigral mikroelektrotların yapımına örnek olarak anlatılmaktadır. Özetlenen tasarım prensibi esneklik sunar ve mikroelektrotlar, stereotaksik koordinatları hesaplayarak ve yapıyı serbestçe hareket eden veya anestezi uygulanan farelerde farklı beyin bölgelerini hedeflemek için buna göre hızlı bir şekilde değiştirerek LFP’leri herhangi bir yapıdan kaydetmek için değiştirilebilir ve özelleştirilebilir. Mikroelektrot tertibatı standart alet ve sarf malzemeleri gerektirir. Bu özel mikroelektrot dizileri, araştırmacıların nöronal aktiviteyi izlemek için herhangi bir konfigürasyonda mikroelektrot dizilerini kolayca tasarlamalarına olanak tanır ve LFP kayıtlarını milisaniye çözünürlükte sağlar.

Introduction

Yerel alan potansiyelleri (LFP’ler), beyindeki hücre dışı alandan kaydedilen elektrik potansiyelleridir. Nöronların dışındaki iyon konsantrasyonu dengesizlikleri tarafından üretilirler ve küçük, lokalize bir nöron popülasyonunun aktivitesini temsil ederler ve makro ölçekli EEG kayıtlarına kıyasla belirli bir beyin bölgesinin aktivitesini tam olarak izlemeye izin verirler¹. Bir tahmin olarak, 1 mm ile ayrılmış LFP mikroelektrotları, tamamen farklı iki nöron popülasyonuna karşılık gelir. EEG sinyali beyin dokusu, beyin omurilik sıvısı, kafatası, kas ve cilt tarafından filtrelenirken, LFP sinyali lokal nöronal aktivitenin güvenilir bir belirtecidir¹.

Araştırmacıların genellikle LFP’leri birkaç beyin yapısından aynı anda kaydetmeleri gerekir, ancak ticari olarak temin edilebilen mikroelektrot dizileri genellikle böyle bir esneklik sunmaz. Burada, mevcut protokol, LFP’leri istenen herhangi bir beyin bölgesinden farklı derinliklerde aynı anda kaydetmek için tamamen özelleştirilebilir, kolayca oluşturulmuş mikroelektrotları tanımlamaktadır. LFP’ler, belirli bir beyin bölgesinin nöronal aktivitesini kaydetmek için yaygın olarak kullanılmasına rağmen 2,3,4,5,6,7,8,9, mevcut kolay özelleştirilebilir tasarım, LFP’lerin herhangi bir çoklu yüzeysel veya derin beyin bölgesinden kaydedilmesine izin verir ^11,12 . Protokol ayrıca, beyin bölgelerinin stereotaksik koordinatlarını belirleyerek ve diziyi buna göre monte ederek istenen herhangi bir mikroelektrot dizisini oluşturmak için değiştirilebilir. 10 kHz örnekleme hızına ve 60-70 kΩ dirence (2 cm uzunluk) sahip bu mikroelektrotlar, LFP’leri milisaniye hassasiyetiyle kaydetmemizi sağlar. Veriler daha sonra 16 kanallı bir amplifikatör ile güçlendirilebilir, filtrelenebilir (düşük geçişli 1 Hz, yüksek geçişli 5 kHz) ve sayısallaştırılabilir.

Protocol

Mevcut çalışma Virginia Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Deneyler için her iki cinsiyetten (7-12 hafta) C57Bl / 6 fareler kullanıldı. Hayvanlar 12 saat ışık / 12 saat karanlık döngüde tutuldu ve yiyecek ve suya ad libitum erişimi vardı.

1. Mikroelektrot yapımı

1. Mikroelektrotları oluşturmak için, 50 μm (çap) diamel kaplı nikel-krom tel kullanın (bkz. Telin bir ucunu platformun arkasına bantlayın ve teli platformdaki en yakın düğmenin etrafına üç kez sarın (Şekil 1A, C).
   NOT: Burada iki düğmeli (2 x 5 inç) akrilik bir platform kullanılmıştır, ancak herhangi bir platform kullanılabilir.
   1. Düğmeler arasında iki döngü yapmak için teli en uzak ikinci düğmenin etrafına gerin. Teli yerine sabitlemek için teli ilk düğmenin etrafına üç kez daha sarın ve ucu platformun arkasına tekrar bantlayın.
      NOT: Teller ayrıldıktan sonra (adım 1.2-1.3.1), her iki tarafta iki tel bulunmalıdır (toplamda dört tel, Şekil 1B).
2. Gergi çubuklarını, bant etraflarına sarılmış olarak tellerin altına yerleştirin (yapışkan tarafı yukarı) (Şekil 1C).
   NOT: Gergi çubukları için üçgen akrilik parçalar kullanıldı, etraflarına bant sarıldı (telleri bağlamak için yapışkan taraf dışarıda). Bandın gergi çubuklarının dışındaki yapışkan tarafı, aralarındaki mesafeyi ayarlamak için telleri yerinde tutacaktır. Gergi çubukları düğmelerden ~ 2,5 cm uzakta olmalı ve teller gevşek olmamalıdır.
3. Bir mikroskop ve ince forseps kullanarak, teller arasında 3 mm veya 4.5 mm’lik bir boşluk açın (kortikal (Ctx) – ventrolateral talamik çekirdek (VL) mikroelektrotları yapmak için teller arasında 3 mm boşluk; striatal (Str) – nigral (SNR) mikroelektrotlar yapmak için 4.5 mm boşluk) (Şekil 1B).
   1. Mikroskopta büyütme kullanılıyorsa, büyütmedeki farkı ve teller arasındaki gerçek mesafeyi hesapladığınızdan ve ayarladığınızdan emin olun.
      NOT: Mikroelektrotlar burada kullanılanlar dışındaki yapılar için inşa edilmişse, teller arasındaki mesafenin yapılar arasındaki stereotaksik mesafeye ayarlanması gerekir. Şekil 2B , tellerin nasıl organize edileceğine dair bir örnek sağlar; Buna göre, diğer yapılar için stereotaksik koordinatlar ayarlanmalıdır.
4. Dört küçük plastik parçasını (0,5 mm kalınlığında) ~6 mm (genişlik) x 3 mm (yükseklik) kesin (Şekil 1C).
   NOT: Herhangi bir plastik parça 0,5 mm kalınlığında oldukları sürece kullanılabilir; Burada, pimlerin satıldığı kare borular kullanılmıştır (Pimler , bkz. Farklı bir kalınlık kullanılıyorsa, lütfen gerekli stereotaksik koordinatlara uyacak şekilde daha fazla veya daha az plastik parçası ekleyin.
5. Plastik üzerine yapıştırıcı uygulayın (bakınız Malzeme Tablosu) ve bunları tellerin üzerine yerleştirin (Şekil 1C). Plastik parçaları, gergi çubuğundan 1,0 cm uzakta olan telin ortasından ~ 1,0 cm uzağa yerleştirin. Süper yapıştırıcının fazlalığını pamuklu çubukla çıkarın.
6. Süper yapıştırıcı kuruduktan sonra, telleri Şekil 1C’de belirtilen sırayla ince makas kullanarak kesin.
7. Ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak dört adet 7 mm’lik cam tüpü kesin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve elektrot tellerini Şekil 2A’da belirtildiği gibi cam tüplere yerleştirin.
   1. VL ve SNR elektrot çiftlerini cam tüplere yerleştirin.
      NOT: Cerrahi implantasyonu desteklemek için cam tüplere sadece derin yapılara ait tellerin yerleştirilmesi gerekir. Cam tüpe kortikal elektrotlar sokmadığınızdan emin olun.
8. Yapıştırıcıyı plastiğe bağlamak için cam tüplerin tabanına yerleştirin. Tutkal kuruyana kadar biraz bekleyin.
9. Cam tüpleri ve telleri Tablo 1’de belirtildiği gibi bir neşter kullanarak kesin; mikroelektrotların uzunluklarının doğru olduğundan emin olun. Mikroelektrotlar farklı yapıları hedefliyorsa, kesme mesafesini gerekli stereotaksik koordinatlara göre ayarlayın.

Resim 1: Mikroelektrot yapısının şeması . (A) Tellerin altında gergi çubukları bulunan platform üzerinde tellerin kurulması. (B) Teller arasındaki boşluk. (C) Tellere dört parça plastik yapıştırılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

	Arjantin	Sokaklar	VL	SNR
AP (Anterior/Posterior)	2.2	1.2	-1.3	-3.3
ML (Medial/Yanal)	1.8	1.5	1	1.5
DV (Dorsal/Ventral)	0.5	3.5	4	4.75
Elektrot uzunluğu	4	4.75	5.25	6

Tablo 1: Stereotaksik implantasyon koordinatları ve mikroelektrotların boyutları.

2. Mikroelektrot dizisi montajı

1. Plastikleri hedef bölgelerin istenen sırasına göre tutturmak için yapıştırıcıyı kullanın. Kortikal, talamik, striatal ve nigral elektrotlar için bir örnek Şekil 2B, C’de gösterilmiştir.
   1. Ctx-VL elektrot çiftini yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin (elektrot tellerinin olduğu taraf aşağı bakmalıdır) ve iki adet 6 mm x 3 mm boş plastik parçasını yapıştırıcı ile üstüne bağlayın.
   2. Üç plastik parçasının üzerine, ikinci Ctx-VL elektrot çiftini elektrotlar yukarı bakacak şekilde yerleştirin (mikroskop kullanın ve VL elektrotlarının hizalandığından emin olun).
      NOT: İki taraflı elektrotların hizalanması (burada, sol ve sağ VL elektrotlarının hizalanması), istenen bilateral yapıları uygun şekilde hedeflemek için gereklidir.
   3. SNR elektrotlarını, VL elektrotlarından 2,0 mm ve kortikal elektrotlardan ~ 5,0 mm uzaktaki SNR elektrotlarıyla üste bağlamak için yapıştırıcıyı kullanın (SNR elektrot tellerinin yukarı bakması gerekir).
   4. 2.1.3 adımını yineleyin. diğer taraf için (SNR elektrot telleri mikroelektrot dizisinin dışına bakmalıdır).
2. Elektrotları birbirine bağlamak için plastiğin etrafına epoksi reçine uygulayın. Elektrotların üzerine epoksi reçine koymaktan kaçının.
3. Kalın bir tel alın ve bir ucunda bir halka yapın. Döngüyü epoksi çözeltisine batırın ve plastiğin üzerine yerleştirin, kalın telin düz durduğundan emin olun (Şekil 2D), böylece sonraki adımlar için bu tel bir tutamak olarak kullanılabilir. Elektrotlar tamamen kuruyana kadar bekleyin.
4. Telleri Şekil 2E’de gösterildiği gibi 2 cm’ye kesin.

Şekil 2: Mikroelektrot yapısı ve boyutları. (A) Şekil 1C’de belirtildiği gibi, teller makasla kesildikten sonra oluşan dört çift elektrot (2 çift Ctx-VL elektrot ve 2 çift Str-SNR elektrot). Cam tüplere derin yapı elektrotları (VL ve SNR) yerleştirin ve tabanlarını plastiğe (kırmızı noktalar) yapıştırın. (B) Üstten görünüm: (A)’dan gelen elektrot çiftleri, mikroelektrot çekirdeğini oluşturmak için bir yığına yapıştırılır. Kırmızı çizgiler tutkal çizgilerini gösterir. (C) (B)’nin önden görünümü. (D) Kalın tel mikroelektrotlara bağlandı. (E) Teller belirtildiği gibi gruplandırılmıştır ve izole uçlar kazınarak 2 cm’ye kesilir.

3. Kulaklığa mikroelektrot bağlantısı

1. Telleri Şekil 2E’de belirtildiği gibi gruplandırın ve izole uçların 1 mm’sini bir neşterle kazıyın.
2. Kortikal elektrotları Şekil 3A’da gösterildiği gibi bükün. Kabloları Şekil 3B’de gösterildiği gibi ayırın. İnce forseps kullanarak, her telin sonunda bir döngü yapın (Şekil 3B).
3. Hemostatlı 10 pimli bir kulaklık tutun (bkz. Malzeme Tablosu) ve pimlere minimum miktarda akı uygulamak için pamuklu çubukla kaplı ahşap ucunu kullanın (Şekil 3C). Pimler arasında kısa devre olmasını önlemek için pimlerin dışına akı koymadığınızdan emin olun.
4. Bir pamuklu çubuğun ahşap ucunu kullanarak, tel halkalarına akı uygulayın.
5. Tel halkaları Şekil 3C’de gösterildiği gibi 10 pimli kulaklığa lehimleyin. Lehimlemeden sonra, pimler arasında kısa devre olmasını önlemek için kulaklığı kurutun.
6. Referans ve topraklama telleri için ince bir tel (0,005-0,008 inç) alın ve plastiği bir ucundan çıkarın. Telin diğer ucunda bir döngü yapın.
7. Referansın ve topraklama tellerinin soyulmuş tarafını ilgili pimlerine lehimleyin (Şekil 3A, C).
8. Kalın teli tutarak (Şekil 2D), özellikle tellerin pimlere bağlandığı yerlerde mikroelektrotların etrafına kraniyoplasti çimentosu uygulayın. Çimento ile gerçek elektrot uçlarına dokunmaktan kaçının.
9. Çimento kuruduktan sonra, cam tüplerin, striatal mikroelektrot tellerinin ve tüm elektrotun tabanına epoksi reçine koyun. Epoksi reçine ile gerçek elektrot uçlarına dokunmaktan kaçının. Elektrotlar tamamen kuruyana kadar bekleyin.
10. Elektrotlar hazır. Bir diş matkabı kullanarak farenin kafatasında delikler açın (gerekli stereotaksik koordinatlara göre) ve kulaklığı kafatasına bakan mikroelektrotlarla ve uygun deliklerle indirerek kulaklığı Şekil 3D’de gösterildiği gibi implante edin. Kulaklık, implantasyon sırasında destek için stereotaksik kola takılabilir.

Şekil 3: Mikroelektrot implantasyonu . (A) Kortikal elektrotlar belirtildiği gibi bükülür. (B) Teller, uçlarda ilmekler oluşturacak şekilde ayrılır. (C) Akı (kırmızı noktalarda) ve döngülü teller 10 pimli kulaklığa lehimlenir ve her telin uygun pime gitmesi sağlanır. (D) Kulaklık, LFP’leri kaydetmek için implante edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Kayıtlardan sonra elektrot konumunu işaretleme

1. LFP kayıtlarının sonunda, bir lezyon oluşturmak için elektrot uçlarına bir akım uygulayarak ve fareyi delmeden önce 30 dakika bekleyerek elektrotların hedef bölgedeki doğru konumunu onaylayın.
   NOT: Elektrot uçlarının konumunu doğrulamak için lezyon ayarları: Tek patlama, 40 μA, 0,75 ms monofazik kare dalga darbesi, 50 Hz, 30 s.
2. Fareleri izofluran ile anestezi altına alın (fare uykuya dalıncaya kadar) ve^0.1 M sodyum fosfat tamponunda% 4 paraformaldehit (PFA) ile 10 transkardiyal perfüze edin. Beyinleri (40 μm kalınlığında) bir kriyostat üzerine bölün (bakınız Malzeme Tablosu) ve DAPI ile lekeleyin (PBS’de% 0.02). Elektrotların doğru yerini, Şekil 4B,C’de gösterildiği gibi elektrot ucu lezyonlarının varlığı ile onaylayın.
   NOT: İzofluran yüzdesinin, bireysel kurumun yönergelerine uygun olarak uygulanması gerekir.

5. Elektrot direncinin ölçülmesi

1. Elektrotların direncini ölçün ve çok aralıklı bir ohmmetre kullanarak elektrotlar arasındaki kısa devreyi kontrol edin (bkz. Direnç ölçeğini R x 10.000 olarak ayarlayın, işaretçideki birim sapmasının 1 kΩ dirence karşılık geldiğini gösterir. 2 cm uzunluğundaki elektrotların 60-70 kΩ dirence sahip olması gerekir.
2. On ayrı iğne alarak kulaklığı özelleştirin (bkz. Her bir pimi bir kabloda ince, çok telli bir bakır tel ile lehimleyin.
   1. Lehimli pimleri, karşılık gelen kablo kuyruklarıyla birlikte 10 pimli çift sıralı çiftleşme soketine (eşleşen soketler) bastırarak takın. Çiftleşme soketinin açık uçlu pimlerini LFP kulaklığa bastırın. Bu şekilde, her LFP elektrodu, montajda belirlenmiş bir kablo teline sahiptir.
3. Her LFP elektrodunun ucunu (direnci ölçülecek) % 0.9 NaCl salin çözeltisine (kandaki NaCl konsantrasyonu) batırın. LFP elektroduna karşılık gelen kablo kablosu ucunu ohmmetrenin pozitif terminaline bağlayın.
   1. Bir tarafı tuzlu suda, diğer tarafı açık uç olarak düşük dirençli ( ̴100 Ω) bir tel kullanın. Düşük dirençli telin açık ucunu ohmmetre işaretçisinin zeminine bağlayın.
      NOT: Bu düzenleme devreyi tamamlar ve ohmmetre işaretçisinin sapmasını ister.
4. Kulaklıktaki iki elektrot arasında elektrik bağlantısı olmadığından emin olun. İkili LFP elektrotlarının elektrik yalıtımını kontrol edin (toprak: bir kablo bir elektrota karşılık gelir; pozitif: başka bir kablo başka bir elektroda karşılık gelir). Bu durumda herhangi bir sapma gözlenirse elektrotları atın.

Representative Results

Discussion

Tarihsel olarak, mikroelektrot dizileri, ^{2,3,4,5,6,7,8,9,13} ile ilgilenilen belirli bir beyin bölgesinden nöronal aktiviteyi kaydetmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, kolay mikroelektrot tasarımımız aynı anda birden fazla yapıdan kayıt yapılmasına izin verir^11,12. Burada, kortikal, talamik, striatal ve nigral mikroelektrotların yapısı örnek olarak açıklanmaktadır. Araştırmacılar, gerekli stereotaksik mesafeleri hesaplayarak ve konstrüksiyonu buna göre ayarlayarak mikroelektrot tasarımını istenen herhangi bir yapıya uyacak şekilde değiştirebilirler.

Örneğin, daha önce bu mikroelektrot dizilerinin tasarımını, hipokampus^12’deki lameller ve septotemporal yönde LFP’leri kaydetmek için değiştirdik. 50 μm’lik bir aralık teli, sinyalin çapraz kontaminasyonunu önlemek için hipokampal lamina boyunca kaydedilen dört mikroelektrot olarak bitişik elektrotları ayırdı. Bunlar tek birimli kayıtlar olmasa da, her elektrot, hücre gövdesinden uzaklığın bir fonksiyonu olarak bir başak dalga formunun değişkenliği ile gösterildiği gibi küçük bir nöron grubunu temsil ediyordu.

İnşaat sırasında, talamik ve nigral mikroelektrot tellerinin cam tüplere sokulması, bu derin yapıları hedeflemek için implantasyon cerrahisi sırasında stabilite sağlamak için gerekliydi. Sekiz bilateral mikroelektrot vardı, bunlardan dördü cam tüplere (2 VL ve 2 SNR) sahipti ve bunlar kafa içi basıncı yükseltmeden ve mortaliteyi arttırmadan önce bir sınırdı. Genel olarak, istenen yerleştirme derinliği en az 2 mm olduğunda cam tüplere ihtiyaç duyulur.

Ayrıca, elektrotlar arasındaki minimum mesafe ayrımını 0,5 mm ile sınırlayan 0,5 mm kalınlığında plastiğe ihtiyaç vardı, ancak diğer plastikler kullanılabilirdi. Mevcut durumda, plastikler kulaklığın ana ekseni boyunca yerleştirildi. Plastikler, birkaç elektrotun aynı ön-arka (AP) ancak farklı medial-lateral (ML) koordinatlara sahip olduğu kulaklık ekseni boyunca da yerleştirilebilir. Bu yöntem, belirli beyin bölgeleri için çok çeşitli olası konfigürasyonlar sunar.

Bir kulaklıktaki pim sayısı, mikroelektrot sayısını sınırlar. 12 pim içeren bir kulaklık, yetişkin bir fare kafasının ön-arka boyutunu tamamen kaplar. Lehimleme sırasında her pim diğer pimlerden izole edilmelidir. Her bir elektrot terminali çiftinin elektriksel izolasyonunu test etmek için bir ohmmetre ve% 0.9 tuzlu suya ihtiyaç vardı. 12 pimli kulaklık, kaydı 10 bölgeyle sınırlar (2 tanesi zemin ve referans için ayrılmıştır).

Materials

Amplifier 16-Channel	A-M Systems	Model 3600	Amplifier
Cranioplasty cement	Coltene	Perm Reeline/Repair Resin Type II Class I Shade – Clear	Cement to hold microelectrodes
Cryostat Microtome	Precisionary	CF-6100	To slice brain
Diamel-coatednickel-chromium wire	Johnson Matthey Inc.	50 µm	Microelectrode wire
Dremel	Dremel	300 Series	To drill holes in mouse skull
Epoxy	CEC Corp	C-POXY 5	Fast setting adhesive
Hemostat	Any		To hold the headset
Forceps	Any		To hold microelectrodes
Light microscope	Nikon	SMZ-10	To see alignment
Ohmmeter	Any		To measurre resistance
Pins (Headers and matching Sockets)	Mill-Max	Interconnects, 833 series, 2 mm grid gull wing surface mount headers and sockets	To attach microelectrodes to
Polymicro Tubing Kit	Neuralynx	ID 100 ± 04 µm, OD 164 ± 06 µm, coating thickness 12 µm	Glass tubes
Pulse Stimulator	A-M Systems	Model 2100	To mark the microelectrode location at the end of the recordings
Scissors	Any		To cut microelectrodes
Superglue	Gorilla		Adhesive
Thick wire 0.008 in. – 0.011 in.	A-M Systems	791900	Tick wire to hold the microelectrode array
Thin wire 0.005 in. – 0.008 in.	A-M Systems	791400	Thin wire for reference and ground