Yöntem makalesi

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi

2.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63636

⸱

6 Nisan 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Bu makalede

Özet

Caenorhabditis elegans'ın mikrosporidian parazit Nematocida parisii tarafından enfeksiyonu, solucanların aynı patojene karşı oldukça dirençli yavrular üretmesini sağlar. Bu, kötü anlaşılmış bir epigenetik fenomen olan kalıtsal bağışıklığın bir örneğidir. Mevcut protokol, genetik olarak izlenebilir bir solucan modelinde kalıtsal bağışıklığın incelenmesini açıklamaktadır.

Özet

Kalıtsal bağışıklık, bazı hayvanların önceki bir enfeksiyonun "hafızasını" yavrularına nasıl geçirebileceğini açıklar. Bu, soylarındaki patojen direncini artırabilir ve hayatta kalmayı teşvik edebilir. Birçok omurgasızda kalıtsal bağışıklık bildirilmiş olsa da, bu epigenetik fenomenin altında yatan mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Caenorhabditis elegans'ın doğal mikrosporidian patojen Nematocida parisii tarafından enfeksiyonu, mikrosporidiaya karşı sağlam dirençli yavrular üreten solucanlarla sonuçlanır. Bu protokol, basit ve genetik olarak izlenebilir N. parisii -C. elegans enfeksiyon modelinde nesiller arası bağışıklık çalışmasını açıklamaktadır. Bu makalede, C. elegans'ı enfekte etme ve bağışıklık astarlı yavrular üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Mikrosporidia için boyama yaparak mikrosporidia enfeksiyonuna direnci arttırmak ve mikroskopi ile enfeksiyonu görselleştirmek için yöntemler de verilmektedir. Özellikle, kalıtsal bağışıklık, mikrosporidia tarafından konakçı hücre invazyonunu önler ve invazyon olaylarını ölçmek için floresan in situ hibridizasyon (FISH) kullanılabilir. Bağışıklık astarlı yavrularda üretilen mikrosporidia sporlarının nispi miktarı, sporların kitin bağlayıcı bir boya ile boyanmasıyla ölçülebilir. Bugüne kadar, bu yöntemler kalıtsal bağışıklığın kinetiği ve patojen özgüllüğünün yanı sıra bunun altında yatan moleküler mekanizmalara ışık tutmuştur. Bu teknikler, C. elegans araştırması için mevcut kapsamlı araçların yanı sıra, kalıtsal bağışıklık alanında önemli keşifler sağlayacaktır.

Giriş

Kalıtsal bağışıklık, ebeveynlerin patojenlere maruz kalmasının enfeksiyona dirençli yavruların üretimini sağlayabileceği epigenetik bir olgudur. Bu tip bağışıklık hafızası, adaptif bağışıklık sistemlerinden yoksun olan ve viral, bakteriyel ve fungal hastalıklara karşı koruma sağlayabilen birçok omurgasızda gösterilmiştir1. Kalıtsal bağışıklığın hem sağlığı hem de evrimi anlamak için önemli etkileri olsa da, bu korumanın altında yatan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Bunun nedeni kısmen, kalıtsal bağışıklığın tanımlandığı hayvanların çoğunun, araştırma için kurulmuş model organizmalar olmamasıdır. Buna karşılık, şeffaf nematod Caenorhabditis elegans'taki çalışmalar, kapsamlı bir genetik ve biyokimyasal araç seti 2,3, yüksek açıklamalı bir genom 4,5 ve kısa bir üretim süresinden yararlanmaktadır. Gerçekten de, C. elegans'taki araştırmalar, epigenetik ve doğuştan gelen bağışıklık6,7 alanlarında temel ilerlemeler sağlamıştır ve şimdi bağışıklık hafızasını incelemek için kurulmuş bir model 8,9.

Mikrosporidia, hemen hemen tüm hayvanları enfekte eden ve bağışıklık sistemi baskılanmış insanlarda ölümcül enfeksiyonlara neden olan mantar patojenleridir10. Enfeksiyon, bir mikrosporidia sporu, hücresel içeriğini (sporoplazma) polar tüp adı verilen bir yapı kullanarak konakçı hücreye enjekte ettiğinde veya "ateşlediğinde" başlar. Parazitin hücre içi replikasyonu, sonuçtahücre 11,12'den çıkabilen olgun sporlara farklılaşan merontların oluşumuna neden olur. Bu parazitler hem insan sağlığına hem de gıda güvenliğine zararlı olsa da, enfeksiyon biyolojileri hakkında hala öğrenilecek çok şey var12. Nematocida parisii, yalnızca solucanların bağırsak hücrelerinde çoğalan ve doğurganlığın azalmasına ve nihayetinde ölüme neden olan doğal bir mikrosporidian parazittir. N. parisii-C. elegans enfeksiyon modeli şunları göstermek için kullanılmıştır: (1) patojen klirensinde otofajinin rolü13, (2) mikrosporidia'nın enfekte hücrelerden litik olmayan bir şekilde nasıl çıkabileceği 14, (3) patojenlerin sinsiti oluşturarak hücreden hücreye nasıl yayılabileceği 15, (4) N. parisii'nin konakçısı16 ile arayüz oluşturmak için kullandığı proteinler ve (5) transkripsiyonel hücre içi patojen yanıtının (IPR) düzenlenmesi 17, 18.

C. elegans enfeksiyonu için protokoller mevcut çalışmada tanımlanmıştır ve benzersiz mikrosporidia biyolojisini ortaya çıkarmak ve konağın enfeksiyona tepkisini incelemek için kullanılabilir. Kitin bağlayıcı boya Direct Yellow 96 (DY96) ile boyanmış sabit solucanların mikroskopisi, kitin içeren mikrosporidia sporlarının bağırsak boyunca enfeksiyon yayılımını gösterir. DY96 boyama ayrıca, konakçı uygunluğunun bir okuması olarak solucan yerçekiminin (embriyo üretme yeteneği) eşzamanlı olarak değerlendirilmesi için kitin içeren solucan embriyolarının görselleştirilmesini sağlar.

Son zamanlarda yapılan çalışmalar, N. parisii ile enfekte olmuş C. elegans'ın aynı enfeksiyona karşı sağlam bir şekilde dirençli yavrular ürettiğini ortaya koymuştur19. Bu kalıtsal bağışıklık tek bir nesil sürer ve doza bağımlıdır, çünkü daha ağır enfekte olmuş ebeveynlerden gelen yavrular mikrosporidiaya karşı daha dirençlidir. İlginçtir ki, N. parisii astarlı yavrular, doğal patojen Orsay virüsü19'a karşı korunmamalarına rağmen, bakteriyel bağırsak patojeni Pseudomonas aeruginosa'ya karşı daha dirençlidir. Bu çalışma ayrıca immün astarlanmış yavruların mikrosporidia tarafından konakçı hücre invazyonunu sınırladığını göstermektedir. Yöntem ayrıca bağışıklık astarlanmış yavruların toplanmasını ve FISH'in bağırsak hücrelerinde konakçı hücre invazyonu ve spor ateşlemesi20'yi test etmek için N. parisii RNA'yı tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Birlikte, bu protokoller C. elegans'ta mikrosporidia ve kalıtsal bağışıklığı incelemek için sağlam bir temel sağlar. Bu model sistemindeki gelecekteki çalışmaların, kalıtsal bağışıklığın yeni ortaya çıkan alanında önemli keşiflere olanak sağlayacağı umulmaktadır. Bu tekniklerin aynı zamanda diğer konakçı organizmalarda mikrosporidia kaynaklı kalıtsal bağışıklığı araştırmak için başlangıç noktaları olması muhtemeldir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada, 21 ° C'de yetiştirilen vahşi tip C. elegans Bristol suşu N2 kullanılmaktadır.

1. Ortamın hazırlanması

  1. M9 ortamını önceki rapor21,22'ye göre hazırlayın.
  2. Bir önceki rapor21,22'ye göre nematod büyüme ortamı (NGM) hazırlayın. 6 cm plaka başına 12 mL NGM veya 10 cm plaka başına 30 mL dökün.
  3. Escherichia coli suşu OP50-1'i önceki bir rapora göre hazırlayın23.
  4. Aşağıdaki adımları izleyerek OP50-1 tohumlu NGM plakalarını hazırlayın.
    1. 10x konsantre OP50-1'i vorteks yaparak yeniden askıya alın.
    2. Ortadaki plakaları tohumlamak için tekrarlayıcı pipet kullanın. 6 cm ve 10 cm plakalar için, sırasıyla 200 μL veya 500 μL hacimli tohum.
    3. 10 cm'lik plakalar için, OP50-1'i yaymak ve bir bakteri çimi oluşturmak için bir cam serpme makinesi kullanın. Bakterileri plakanın en kenarına yaymayın.
      NOT: Etanol daldırma ve steriliteyi sağlamak için her beş plakada bir yayıcıyı alevlendirin. Bakterilerin öldürülmesini önlemek için yayılmadan önce yayıcının birkaç saniye soğumasını bekleyin.
    4. Plakaları kuruması ve bakteriyel çimlerin büyümesini sağlamak için 2 gün oda sıcaklığında bırakın.
      NOT: Tohumlu plakalar oda sıcaklığında 2-3 hafta veya 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.

2. C. elegans'ın bakımı

  1. Solucanları OP50-1 tohumlu NGM plakalarında sabit bir bakteriyel besin kaynağı üzerinde tutun.
    NOT: Açlık, sonuçları etkileyebilecek nesiller arası fenotiplere neden olabilir. 10 cm'lik OP50-1 tohumlu bir plaka, 72 saate kadar 2.500 L1'i ( C. elegans'ın en erken larva aşaması) destekler.
  2. Solucanlar açlıktan ölürse, solucanları deneyler için kullanmadan önce OP50-1'de üç nesil boyunca büyüyün.

3. Sodyum hipoklorit (beyazlatma) kullanılarak C. elegans popülasyonlarının senkronizasyonu

NOT: Bu adım zamana çok duyarlıdır, bu nedenle başlamadan önce santrifüjün kullanılabilir olduğundan emin olun. Alternatif, daha az hızlı beyazlatma protokolleri literatürde mevcuttur ve tercih edilirse kullanılabilir. % 6 sodyum hipokloritin zamanla aktivitesini kaybetmesini önlemek için, reaktifi karanlıkta 4 ° C'de saklayın ve 1 yıla kadar saklayın.

  1. 400 μL 1 M NaOH, 250 μL %6 sodyum hipoklorit (bkz. Malzeme Tablosu) ve 1350 μL damıtılmış su karıştırarak her numune için 2 mL ağartıcı çözeltisi hazırlayın.
  2. Yetişkin solucanları (~ 72 saat sonra kapaktan sonra) 1 mL M9 ortamı kullanarak bir mikrosantrifüj tüpüne yıkayın.
    NOT: Plakalarda çok sayıda solucan kalırsa, solucanları oda sıcaklığında 30 s boyunca 1.400 x g'de santrifüjleme yoluyla pelet edin, 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak süpernatantı çıkarın ve ek plaka yıkamaları yapın.
  3. Solucanları peletlemek için oda sıcaklığında 30 s boyunca 1.400 x g'da santrifüj yapın, ardından bakterileri uzaklaştırmak için 1 mL M9 ortamı ile 2x'i yıkayın.
  4. Süpernatanı çıkarın, hazırlanan ağartıcı çözeltisinden 1 mL ekleyin (Adım 3.1.) ve 1 dakika boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın. Tüpleri 3-4x ters çevirin.
    NOT: Bir ışık mikroskobu altında, solucanların parçalanmayı durdurduğu görülebilir.
  5. 1 dakika sonra, solucanları peletlemek için oda sıcaklığında 30 s için 3.000 x g'da santrifüj yapın, ardından süpernatantı çıkarın ve 1 mL taze ağartıcı çözeltisi ekleyin.
  6. Solucan karkaslarının açılıp embriyoları serbest bıraktığını görselleştirmek için tüpleri bir ışık mikroskobu altında yakından izleyin. Karkasların ~% 50-80'i ayrıldığında ve birçok embriyo serbest bırakıldığında hemen bir sonraki adıma geçin.
    NOT: Hayvan sayısına ve solucan suşuna bağlı olarak, bu adım 15 s ila 4 dakika sürebilir. Bilinmeyen nedenlerden dolayı, N. parisii ile enfekte olmuş solucanların ağartılması genellikle enfekte olmamış hayvanlardan daha uzun sürer.
  7. Embriyoları peletlemek için oda sıcaklığında 30 s boyunca 3.000 x g'da santrifüj yapın, ardından 1 mL M9 ortamında 3x'i yıkayın.
    NOT: Yıkamalar, tüplerden kalan hipoklorit çözeltisini seyreltir ve ağartıcı çözeltisinin embriyolara zarar vermemesini sağlamak için hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
  8. Son pelete 1 mL M9 ortam ekleyin ve 4 mL M9 ortam içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın. Embriyoları 5 mL'lik son bir hacimde askıya alın.
  9. Tüpleri mekanik bir rotor üzerinde döndürün (bakınız Malzeme Tablosu) 21 °C'de 18-24 saat boyunca embriyoları L1'lere yumurtadan çıkarın.
    NOT: N. parisii solucan bağırsağını enfekte ettiğinden ve germ hattını istila etmediğinden, enfekte olmuş ebeveynler enfeksiyonu dikey yolla soylarına geçirmezler19. Enfekte yetişkinlerin ağartılması, F1 hayvanlarını senkronize eder ve N. parisii sporlarını yok ederek F1 soyunun ebeveynlerden taşınan sporlar tarafından enfekte olmamasını sağlar.
  10. L1'leri peletlemek için tüpleri oda sıcaklığında 1.800 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanın 1 mL'si hariç hepsini atın.
  11. Tohumlanmamış bir NGM plakasına 1-5 μL L1 karışımını pipet edin ve hemen bir ışık mikroskobu altında görselleştirerek damlacıktaki L1 sayısını sayın. L1'lerin konsantrasyonunu ve toplam sayısını belirlemek için 3x'i tekrarlayın ve sayımların ortalamasını alın.
    NOT: Embriyoların çoğunluğu yumurtadan çıkmalı ve L1'ler sıvı damlacıkta hızla hareket etmelidir. Yumurtadan çıkmamış embriyoların ve uyuşuk (yavaş hareket eden) L1'lerin büyük bir kısmı kalırsa, bu çok uzun süre ağartıldığını gösterir.

4. N. parisii sporlarının hazırlanması

  1. Daha önce yayınlanmış referansları takip ederek N. parisii sporlarını hazırlayın19,24.

5. C. elegans'ın bağışıklık astarlanmış yavrular vermek için N. parisii ile enfeksiyonu

  1. Planlı enfeksiyonlardan bir gün önce, gerekli sayıda 10 cm'lik tohumlanmamış NGM plakasını 4 °C'den oda sıcaklığına taşıyın.
  2. Enfeksiyondan hemen önce, solucanları peletlemek için bir mikrosantrifüj tüpünde oda sıcaklığında 30 s için 1.400 x g'da ~ 2.500 senkronize L1 solucanını santrifüj edin. Solucanları ~ 50 μL M9 ortamında bırakmak için süpernatantı pipet ucuyla çıkarın.
  3. L1'lere 1 mL 10x OP50-1 ve N. parisii sporlarını istenen konsantrasyona ekleyin (tipik olarak ~ 2.5 milyon spor). Enfekte olmayan bir kontrol olarak, kullanılan spor preparatının hacmine eşdeğer bir M9 ortam hacmine sahip eşdeğer bir L1s ve OP50-1 tüpü hazırlayın.
    NOT: Bağışıklık astarlı yavrular elde etmek için, hayvanların% >90'ının 72 saat (DY96 boyaması, Adım 7 ile ölçüldüğü gibi) enfekte olması için yeterince yüksek bir spor dozu kullanın, ancak hayvanların% >80'i hala gravid olacak kadar düşüktür. Bu, çoğu yavrunun enfekte ebeveynlerden gelmesini ve ebeveynlerin ağartılmasının F1 testi için yeterli embriyo vermesini sağlar. Spor preparatları konsantrasyon ve bulaşıcılığa göre değişmekle birlikte, uygun bir ebeveyn dozu tipik olarak 10 cm plaka başına 5-15 μL spor preparatı (~ 2.5 milyon spor) arasındadır.
  4. Yukarıdaki 1 mL solucanı 10 cm'lik tohumsuz bir NGM plakasına karıştırmak ve plakalamak için kısaca vorteks. Sıvının tüm plakaya yayılmasını sağlamak için girdap.
  5. 72 saat boyunca 21 ° C'de inkübe etmeden önce, plakaları kapakları kapalı olarak temiz bir dolapta 10-20 dakika veya tamamen kuruyana kadar kurutun.
  6. Enfeksiyon sonrası 72 saatte (hpi), solucanları plakalardan 1 mL M9 ortamı kullanarak bir mikrosantrifüj tüpüne yıkayın. Plakalarda birçok solucan kalırsa, solucanları 30 s boyunca 1.400 x g'de santrifüjleme yoluyla pelet edin, süpernatanı çıkarın ve ek plaka yıkamaları yapın.
  7. Pelet solucanlarına oda sıcaklığında 30 s için 1.400 x g'de santrifüj yapın, 2x'i 1 mL M9 ortamla veya süpernatant temizlenene kadar yıkayın. 1 mL'lik M9 ortamın son cildinde yeniden askıya alın.
  8. Karıştırmak için pipeti yukarı ve aşağı doğru çevirin, ardından asılı solucanların 100 μL'sini taze bir tüpe aktarın.
    NOT: ~ 250 yetişkinden oluşan bu örnek, Adım 7'de ve Adım 3'ün başında açıklandığı gibi, ebeveyn solucanı uygunluğunu ve enfeksiyon durumunu belirlemek için daha sonra sabitlenebilir ve boyanabilir.
  9. Yetişkin solucanları açmak ve test için F1 embriyolarını serbest bırakmak için, Adım 3'te açıklandığı gibi kalan 900 μL asılı solucanı ağartın.
    NOT: Bu adım aynı zamanda sonraki enfeksiyon tahlillerinden önce herhangi bir N. parisii sporunu da yok eder.

6. C. elegans'ta N. parisii'ye kalıtsal bağışıklığın test edilmesi

  1. Enfeksiyonları Adım 5.1.-5.6.'da açıklandığı gibi, aşağıda belirtilen değişikliklerle gerçekleştirin.
    NOT: F1'lerdeki enfeksiyon tahlilleri küçültülebilir ve ~1.000 L1 solucan ve 400 μL 10x OP50-1 kullanılarak 6 cm NGM plakaları üzerinde gerçekleştirilebilir. "Yüksek" bir spor dozu da kullanılmalıdır, öyle ki naif F1'lerin ~% 100'ü (yani, enfekte olmamış ebeveynlerden gelen solucanlar) enfekte olur ve naif F1'lerin sadece% 10'u yerçekimi yapılır. Spor preparatları konsantrasyon ve enfektivite bakımından değişmekle birlikte, uygun bir doz tipik olarak 6 cm'lik plaka başına 5-15 μL (~ 2.5 milyon spor) arasındadır.
  2. 72 hpi'de, Adım 7'de açıklandığı gibi solucan uygunluğunu ve enfeksiyon durumunu belirlemek için sabitleyin ve lekeleyin.

7. Embriyoları ve mikrosporidia sporlarını görselleştirmek için C. elegans'ın DY96 boyanması

NOT: DY96, solucan embriyolarını ve mikrosporidia spor duvarlarını lekeleyen yeşil floresan kitin bağlayıcı bir boyadır19,15,25. Bu, solucanların fitness ve enfeksiyon durumunun eşzamanlı olarak izlenmesini sağlar.

  1. Solucanları% 0.1 Tween-20 içeren 1 mL M9 ortam kullanarak plakalardan bir mikrosantrifüj tüpüne yıkayın. Plakalarda çok sayıda solucan kalırsa, solucanları oda sıcaklığında 30 s boyunca 1.400 x g'da santrifüjleme yoluyla pelet edin, bir pipet ucu kullanarak süpernatantı çıkarın ve ek plaka yıkamaları yapın.
  2. Solucanları peletlemek için oda sıcaklığında 30 s boyunca 1.400 x g'da santrifüj yapın ve 2x'i% 0.1 Ara-20 içeren 1 mL M9 ortamla veya süpernatant temizlenene kadar yıkayın.
  3. Süpernatanı çıkarın, 700 μL aseton ekleyin ve solucanları 10 dakika oda sıcaklığında sabitlemeye bırakın.
    NOT: Bu noktada, solucanlar istenirse birkaç ay sonrasına kadar işlenmek üzere -20 ° C'de saklanabilir.
  4. Sabit solucanları peletlemek için oda sıcaklığında 30 s için 10.000 x g'da santrifüj yapın ve %0,1 Ara-20 (PBST) içeren 1 mL PBS ile 2 kat yıkayın.
  5. 50 mL DY96 çalışma çözeltisi hazırlayın: PBST,% 0.1 (v / v) sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 20 μg / mL DY96 (damıtılmış suda 5 mg / mL stok çözeltisinden) (bkz. Tüpü folyoya sarın ve ışığa maruz kalmayı önlemek için bir çekmecede saklayın.
    NOT: DY96 stok ve çalışma çözeltileri karanlıkta tutulursa oda sıcaklığında >1 yıl saklanabilir.
  6. Solucanları peletlemek ve süpernatanı çıkarmak için oda sıcaklığında 30 s için 10.000 x g'da santrifüj. Pelet üzerine 500 μL DY96 çalışma solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika döndürün.
  7. Solucanları peletlemek için oda sıcaklığında 30 s için 10.000 x g'da santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve DAPI'li / DAPI'siz montaj ortamının 15 μL'sini ekleyin (bkz.
  8. Lekeli solucanlar içeren çözeltinin 10 μL'lik pipeti, mikroskop sürgüsüne yerleştirin ve üstüne bir kapak kayması yerleştirin.
    NOT: Slaytlar ve ek numuneler, uzun süreli depolama için karanlıkta 4 °C'de saklanabilir.

8. Solucan uygunluğunu ve enfeksiyon durumunu değerlendirmek için DY96 lekeli solucanların görüntülenmesi ve analizi

  1. DY96 lekeli solucanları analiz etmek için (Adım 7.8'de olduğu gibi slaytlara monte edilmiştir.), floresan mikroskobun GFP kanalını kullanarak görüntüleme gerçekleştirin.
  2. Solucan popülasyonlarının uygunluğunu belirlemek için, durum başına >100 solucanın yerçekimini test etmek için 5x veya 10x hedefi kullanın.
    NOT: ≥1 embriyo taşıyan solucanlar gravid olarak kabul edilir. Mekanik hücre sayaçları, sayma sırasında insan hatasını en aza indirmeye yardımcı olabilir. Solucan embriyoları mikrosporidia sporlarından daha az lekelidir (daha az floresan)19. Embriyolar oval, ~50 μm x ~30 μm'dir ve sağlıklı C. elegans yetişkinlerinin orta gövdesinde bulunur. Sağlıklı, enfekte olmamış yetişkinler, vücut uzunlukları26 boyunca sıralar halinde düzenlenmiş 10-20 embriyo taşırlar.
  3. Uygunlukta daha ince farklılıklar ortaya çıkarmak için, embriyo sayımları yapın. Bunun için, durum başına 20-30 bireysel solucandaki embriyo sayısını manuel olarak sayın.
  4. Solucan popülasyonlarının nasıl enfekte olduğunu belirlemek için, durum başına 100 > solucanın enfeksiyon durumunu değerlendirmek üzere 5x-40x hedefi kullanın. Herhangi bir sayıda hücre içi bağırsak sporu içeren solucanlar enfekte olarak kabul edilir.
    NOT: Microsporidia sporları solucan embriyolarından daha parlaktır. N. parisii'nin fasulye şeklindeki sporları ~ 2.2 μm x ~ 0.8 μm'dir ve solucanın bağırsak hücrelerinde ~ 48 hpi 15'ten üretilir. Sporların sadece bağırsak lümeninde görüldüğü ve bağırsak duvarları boyunca görülmediği solucanlar enfekte olarak kabul edilmez19. Bunun nedeni, bu sporların muhtemelen bireyin enfeksiyonundan kaynaklanmayan yeni yutulmuş sporları temsil etmesidir.
  5. Görüntü analiz yazılımını kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız), aşağıdaki adımları izleyerek parazit yükünü ve solucan boyutunu ölçün.
    1. Resim 20-30 solucanlar, her örnek için floresan dik stereoskop kullanılarak mikroskop slaytlarına monte edilmiştir. Brightfield, DAPI ve GFP kanallarında görüntü yakalayın. GFP kanalında, en enfekte numunelerdeki floresanın doymamış olması için uygun bir pozlama seçin.
      NOT: Enfeksiyon, en az enfekte olmuş örneklerde hala görselleştirilebilir. Görüntüler genellikle 5x hedef kullanılarak çekilir.
    2. Dosyaları FIJI/ImageJ içinde açın. Dosya türüne bağlı olarak, görüntüleri ImageJ'de açmak için Bio-Formats Importer eklentisi gerekebilir.
    3. brightfield veya DAPI görüntülerini ve araç çubuğundaki Poligon seçimleri aracını kullanarak görüntülerdeki 20-30 ayrı solucanın ana hatlarını çizin. Her taslağı, Ekle [t] öğesine tıklayarak açılır menüdeki İlgi Çekici Bölgeleri (YG) Yöneticisi'> Analiz > Araçları ile kaydedin. Çerçevede tamamen görülebilen hayvanları ana hatlarıyla belirtin.
      NOT: Solucan anahatları, anahatları olan dosyayı Tiff olarak kaydederek daha sonra yeniden ziyaret edilebilir.
    4. Resimdeki tüm anahatları kaldırmak için YG yöneticisinde Seçimi Kaldır'a tıklayın ve açılır menüden Resim > Çoğalt'a tıklayın. GFP kanalını parazit yükü için çoğaltmak üzere ilgilenilen kanala karşılık gelen sayıyı "Kanallar" kutusuna yazın (örneğin, 2).
    5. Image > kullanarak bu kanalı eşik > Eşiği , parlak parazit yükünün yakalandığı, ancak solucan embriyolarından gelen karartma floresansının yakalanmadığı bir seviyeye ayarlayın ve ardından Uygula'ya tıklayın. Uygulanan eşik değerlerini not alın ve bunları aynı denemenin tüm görüntüleri için tutarlı bir şekilde kullanın.
      NOT: Tüm görüntüleri çözümlemeden önce eşiğin hem en az hem de en çok etkilenen örnekler için uygun bir değer olup olmadığını denetleyin.
    6. Analiz Et > Ölçümleri ayarla'yı seçin ve Alan Kesiri kutusunu işaretleyin. YG yöneticisinden sırayla tek solucan anahatlarını seçin ve Analiz > Ölçüm işlevine tıklayın. Bir Sonuç penceresi, %Area (yani, % parazit yükü) ölçümünü sağlayacaktır.
      NOT: Embriyolardan gelen floresan eşiği geçecek kadar parlaksa, araç çubuğundaki siyah renkli Boya Fırçası aracı , %Area ölçümünden önce bu bölgeleri manuel olarak silmek için kullanılabilir.
    7. Solucan boyutunu uygunluk okuması olarak belirlemek için, solucanları Adım 8.3'te açıklandığı gibi özetleyin. Analiz Et > Ölçümleri ayarla'yı seçin ve Alan kutusunu işaretleyin. YG yöneticisinden sırayla tek solucan anahatlarını seçin ve Analiz > Ölçüm işlevine tıklayın. Bir Sonuç penceresi %Area ölçümünü sağlar.

9. C. elegans'ın mikrosporidia ve spor ateşlemesi ile istilasını değerlendirmek için FISH testi

NOT: MicroB FISH probu, mikrosporidyen 18s rRNA'nın korunmuş bir bölgesini tanır ve hücre içi sporoplazmaları (yani istila edilmiş konakçı hücreleri) ve sporlar içindeki genetik materyali etiketlemek için kullanılabilir.

  1. 6.000 ağartıcı senkronize L1 solucanını, M9 ortamından oluşan 400 μL'lik son hacimde 4 milyon N. parisii sporu ve 10 μL 10x OP50-1 ile enfekte edin.
  2. Karışımı 6 cm'lik tohumsuz bir NGM plakasına tabaklayın, temiz bir dolapta 10-20 dakika kurutun ve 21 °C'ye yerleştirin.
  3. 30 dakika sonra, hayvanları% 0.1 Ara-20 içeren 1 mL M9 ortamı ile plakalardan yıkayın.
  4. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1.400 x g'de santrifüj yaparak solucanları toplayın.
  5. Bir pipet ucu kullanarak süpernatantı çıkarın, 700 μL aseton ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
    NOT: Bu noktada, solucanlar daha sonra işlenmek üzere -20 ° C'de saklanabilir.
  6. Daha önce yayınlanan27,19 raporlarını takiben MicroB probunu kullanarak bir gecede FISH testi yapın.
    NOT: Spor ateşlemesini değerlendirmek için, son 500 μL yıkama tamponunu numunelere 20 μg/mL DY96 ile tamamlayın ve protokole normal şekilde devam etmeden önce 21 °C'de 30 dakika döndürün.
  7. Slaytları 4 °C'de bir slayt kutusunda saklayın. Uzun süreli depolama için (yani birkaç ay), ek numuneleri karanlıkta 4 ° C'de mikrosantrifüj tüplerinde saklayın.
  8. FISH lekeli solucanlarda istilayı değerlendirmek için, floresan mikroskobun kırmızı kanalını kullanarak solucanlara bakın. L1 hayvanları küçük olduğundan ve sporoplazmalar replikasyonun erken aşamalarında olacağından enfeksiyon olaylarını yüksek büyütmede (63x hedef) görselleştirin. Spor ateşlemesini değerlendirmek için, 63x hedefi ve hem kırmızı hem de yeşil floresan kanalları kullanın.
    NOT: GFP ve mCherry sinyalinin kolokalize olduğu sporlar ateşlenmemiş olarak kabul edilir; boş GFP spor kasaları ateşlenmiş olarak kabul edilir.
  9. İstila veya spor ateşlemesini analiz etmek için, sporoplazmaların sayısını (bağırsak hücrelerinde mCherry odakları) veya durum başına 20-30 solucanda ateşlenen sporların yüzdesini manuel olarak sayın. Genellikle farklı düzlemlerde bulunan tüm enfeksiyon olaylarını ve sporlarını yakalamak için z-düzlemindeki odağı ayarlayın.
    NOT: Sporoplazmalar sadece bağırsak hücrelerinde bulunur. En yüksek sporoplazma konsantrasyonu tipik olarak farenksten hemen sonra bulunur. Numuneler ayrıca DY96 ile boyanırsa, sporla birlikte lokalize olmayan sporoplazmaların varlığını arayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, C. elegans'ın (P0) ebeveyn popülasyonları L1 aşamasında düşük dozda N. parisii sporları ile enfekte edildi. Bu enfeksiyon koşulları tipik olarak ebeveynlerin ağartılması yoluyla yüksek sayıda mikrosporidiaya dirençli F1 soyu elde etmek için kullanılır. Enfekte ebeveyn popülasyonları ve enfekte olmayan kontroller 72 ppi'de sabitlendi ve solucan embriyolarını ve mikrosporidia sporlarını görselleştirmek için DY96 ile boyandı (Şekil 1A). Enfekte hayvanlar küçüktür...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, mikrosporidia ve kalıtsal bağışıklığın basit ve genetik olarak izlenebilir bir N. parisii -C. elegans enfeksiyon modelinde incelenmesini açıklamaktadır.

Spor hazırlama, üretkenliğe bağlı olarak tipik olarak 6 aylık deneyler için yeterli spor veren yoğun bir protokoldür24. Önemli olarak, deneyler için kullanmadan önce her yeni spor "lotu" için bulaşıcılık belirlenmelidir. Spor preparatları arasındaki bulaşıcılıktaki değişkenlik nedeniyle, b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Winnie Zhao ve Yin Chen Wan'a el yazması hakkında yararlı yorumlar yaptıkları için minnettarız. Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (Hibe #522691522691) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2.0 mm zirkonya boncukBiospec Ürünleri A.Ş.11079124ZX
10 mL şırıngaFisher Scientific1482613
5 & mu; m filterMillipore SigmaSLSV025LS
Axio Imager 2Mikroskop slaytlarında DY96- ve FISH lekeli solucanların görüntülenmesi için Zeiss-Floresan mikroskobu
Axio Zoom V.16 Floresan Stereo Zoom Mikroskopgörselleştirmek için floresan transgenik hayvanların canlı görüntülenmesi için
Fırınlanmış EdgeGARD Yatay Akışlı Temiz TezgahFırıncı-
Boncuk bozucu, Genie SI-D238 Analog Bozucu Genie Hücre Bozucu, 120 VKüresel EndüstriyelT9FB893150
Hücresi-VU slaytı, Millennium Sciences Tek Kullanımlık Sperm Sayısı SitometreleriFisher ScientificDRM600
Doğrudan Sarı 96Sigma-AldrichS472409-1G
Biotium23001
ile EverBrite Montaj OrtamıDAPIBiotium23002
Fiji/ImageJ yazılımıImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
Mekanik rotorThermo Sceintific415110 / 1834090806873Gece boyunca kuluçka için ağartılmış embriyoların tüplerini döndürmek için kullanılır
MicroB FISH probuBiyoarama Teknolojileri A.Ş.-Quasar 570 (Cy3) 5' modifikasyonu ve HPLC saflaştırılmış, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2Yabani tip, Bristol suşuVarsayılan suşCaenorhabditis Genetik Merkezi (CGC
) Sodyum dodesil sülfat (SDS)Sigma-AldrichL3771-100G
Sodyum hidroksit çözeltisi (5 N)Fisher ChemicalFLSS256500
Sodyum hipoklorit çözeltisi (% 6) )Fisher ChemicalSS290-1
Stemi 508 Stereo MikroskopZeiss-Solucanlarıngünlük bakımı ve tahlil kurulumları için L1 solucanlarının sayımı için
Tween-20Sigma-AldrichP1379-100ML
Vectashield + A16BiolynxVECTH1500
Zeiss-IPR'yi DAPI olmayan EverBrite Montaj Ortamı

Kaynaklar

  1. Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938(2019).
  2. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  3. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  4. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  5. Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
  6. Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
  7. Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
  8. Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
  9. Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741(2020).
  10. Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276(2020).
  11. Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172(2020).
  12. Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247(2020).
  13. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011(2019).
  14. Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
  15. Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
  16. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023(2017).
  17. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200(2014).
  18. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  19. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  20. Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458(2022).
  21. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496(2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  24. Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227(2011).
  25. Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
  26. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  27. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
  28. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093(2016).
  29. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724(2016).
  30. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309(2008).
  31. Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425(2021).
  32. Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738(2020).
  33. Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Nesiller Aras Ba kl kNematocida ParisiiFloresan MikroskopiDY96 BoyamaFloresan n Situ HibritlemeParazit Y kSolucan Kondisyonu

İlgili makaleler