Method Article

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

DOI:

10.3791/63665

⸱

June 6th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, geliştirilmiş bir tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi kullanarak protein fosforilasyonunu ölçmek için numune hazırlama ve veri analizini açıklamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosforilasyon, protein fonksiyonunu düzenleyen ve hücre sinyal sonuçlarını yönlendiren gerekli bir posttranslasyonel modifikasyondur. Protein fosforilasyonunu ölçmek için mevcut yöntemler, tek tek proteinler arasında fosforilasyondaki heterojenliği koruyamaz. Tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi, makromoleküler komplekslerin bileşimini, proteinlerin bir cam kapak kapağı üzerindeki immünopresipitasyonu ve ardından tek moleküllü görüntüleme yoluyla araştırmak için geliştirilmiştir. Mevcut teknik, tek molekül seviyesinde tam uzunluktaki membran reseptörlerinin fosforilasyon durumunun sağlam bir şekilde ölçülmesini sağlayan SiMPull'un bir uyarlamasıdır. Binlerce bireysel reseptörün bu şekilde görüntülenmesi, protein fosforilasyon paternlerinin ölçülmesine izin verir. Mevcut protokol, numune hazırlamadan görüntülemeye kadar optimize edilmiş SiMPull prosedürünü detaylandırır. Cam hazırlama ve antikor fiksasyon protokollerinin optimizasyonu veri kalitesini daha da artırır. Mevcut protokol, bir numune içinde fosforile edilen reseptörlerin fraksiyonunu hesaplayan tek moleküllü veri analizi için kod sağlar. Bu çalışma epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) fosforilasyonuna odaklanırken, protokol diğer membran reseptörlerine ve sitozolik sinyal moleküllerine genelleştirilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membranla ilişkili sinyalleşme, ligand kaynaklı membran reseptör aktivasyonu ve sinyali yayan aşağı akış aksesuar proteinlerinin işe alınmasının bir kombinasyonu ile ayarlanır. Reseptör sitoplazmik kuyruklarındaki anahtar tirozinlerin fosforilasyonu, sinyal komplekslerinin veya sinyalozomların oluşumunu başlatmak için kritik öneme sahiptir 1,2. Bu nedenle, biyolojide önemli bir soru, sinyal ortaklarını işe almak ve hücresel sonuçları dikte etmek için fosforilasyon modellerinin nasıl oluşturulduğu ve sürdürüldüğüdür. Bu, reseptör fosforilasyonunun heterojenliğini, hem bol miktarda hem de sinyalozom <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kapak kapağı hazırlığı

NOT: Bu adım için, çift katmanlı nitril eldiven, güvenlik gözlüğü veya yüz siperliği ve bir laboratuvar önlüğü içeren kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilmesi gerekir.

  1. Camdaki organik kalıntıları gidermek için piranha aşındırma işlemi yapın.
    DİKKAT: Piranha çözeltisi, organik malzemelerle temas ettiğinde aşındırıcı ve oldukça reaktif olan güçlü bir oksitleyici ajandır. Organik enkaz ile reaksiyon ekzotermiktir ve potansiyel olarak patlayıcıdır. Bu nedenle, prosedür kanat indirilmiş kimyasal bir duman davlumbazında yapılmalıdır. Piranha çözeltisini işlemek için Pyrex cam eşyalar gerekli....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SiMPull işlemini gösteren bir karikatür Şekil 1A'da gösterilmiştir. Kapak fişleri, toplam protein lizatlarından EGFR-GFP'yi yakalamak için biyotinile anti-EGFR antikorları için bir çapa olarak NeutrAvidin kullanılarak işlevselleştirilir. Bağlı olmayan proteini yıkadıktan sonra, fosforile reseptörler bir anti-fosfotirozin (anti-PY) antikoru15 ile etiketlenir. Şekil 1B , aynı kapak fişi üzerinde birden fazla numunenin hazırlanabileceği ve g.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol, tek protein seviyesinde reseptör fosforilasyonunun kantitatif ölçümlerini sağlamak için optimize edilmiştir. SiMPull protokolünde, NaBH4 tedavisi ile otofloresanın azaltılması ve antikor ayrışmasını önlemek için numunenin son sabitlenmesi de dahil olmak üzere fosfo-tirozin tespiti için ölçümün güvenilirliğini artıran birkaç basit ama önemli değişiklik geliştirilmiştir. Anti-PY antikoru ile kolokalizasyonun hesaplanması için reseptör konumlarını tanımlamak için yeşil kanal maskesinin .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri R35GM126934, R01AI153617 ve R01CA248166 to DSL tarafından desteklenmiştir. EMB, ASERT-IRACDA programı (NIH K12GM088021) ve UNM MARC programı (NIH 2T34GM008751-20) tarafından JAR aracılığıyla desteklenmiştir. NIH P30CA118100 tarafından desteklenen New Mexico Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi floresan mikroskobu ortak kaynağını kullanarak minnetle teşekkür ederiz. SiMPull'un orijinal gelişimi bu çalışmaya ilham veren Dr. Ankur Jain ve Taekijip Ha'ya teşekkür etmek istiyoruz.
ES-C mevcut adresi: İmmünodinamik Grubu, Bütünleştirici Kanser İmmünolojisi Laboratuvarı, Kanser Araştırmaları Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleriMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7,4
10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaClT50 Tampon
100 mm Doku Kültürü kabıCELLTREAT229620Piranha kazınmış cam/dizilerin saklanması
15 mL konik tüp
%16 Paraformaldehit Sulu ÇözeltiElektron Mikroskobu Bilimleri15710Tehlikeli
50 mL konik tüpFonksiyonelleştirilmiş Cam depolama/ KOH yeniden kullanım
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaClLizis Tampon Bileşeni
60 mm Doku Kültürü kabıCorning430166
%8 Glutaraldehit Sulu ÇözeltiElektron Mikroskobu Bilimleri16020Tehlikeli
Aseton (C3H6O)Millipore Sigma270725Tehlikeli
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
Hayvansız Rekombinant İnsan EGFPeprotechAF-100-15
Anti-İnsan EGFR (Harici Alan) – BiotinLeinco Technologies, IncE101
Anti-p-Tyr Antikoru (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biyoteknolojisc-7020 AF647
Banyo sonicatorBranson1200
BCA Protein Test KitiPierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5.000
Sığır serum albüminiAltın BiyoteknolojiA-420-1Tyrode'un Tampon Bileşeni
Buchner hunisi
Bunsen brülörü
Kalsiyum Klorür (CaCl2)Millipore SigmaC4901Tyrode'un Tampon Bileşeni
Hücre KazıyıcıBioworld30900017-1
Konik Filtreleme ŞişesiFisher BilimselS15464
Coplin KavanozWHEATON900470
Kontes II Otomatik Hücre SayacıThermo Fisher BilimselAMQAX1000
Lameller 24 x 60 # 1.5Elektron Mikroskobu Bilimleri63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMKeson LaboratuvarlarıDML19-500
emCCD kameraAndor iXon
Fetal Sığır Serumu, OptimaBio-TechneS12450HIsı İnaktive
Füzyon 360 yazılımıAutodesk
Geneticin G418 DisülfatKeson LabsG030-5GM
Buzul Asetik Asit (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Tehlikeli
Cam serolojik pipetler
Cam Karıştırma Çubuğu
Glikoz (D-(+)-Glikoz)Millipore SigmaD9434Tyrode'un Tampon Bileşeni
Halt Fosfotaz ve Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100X)Thermo Fisher Scientific78446Lizis Tampon Bileşeni
HEPESMillipore SigmaH3375Tyrode'ın Tampon Bileşeni
Hidroklorik Asit (HCl)VWRBDH7204-1Tehlikeli
Hidrojen Peroksit (H2O2) (%3)HX0645
Hidrojen Peroksit (H2O2) (%30)EMD MilliporeHX0635-2
Buz
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896Lizis Tampon Bileşeni
ImmEdge Hidrofobik Bariyer KalemVektör LaboratuvarlarıH-4000
Immersol 518F daldırma yağıZeiss444960-0000-000
kurum içi vakum hattı
L-glutaminThermo Fisher Scientific25030-164
Magnessium Klorür Hekzahidrat (MgCl2< / sub>-6H2< / sub>O)MPBio2191421Tyrode'un Tampon Bileşeni
MatlabMathworksEğrisi Uydurma Araç Kutusu, Paralel Bilgi İşlem Araç Kutusu ve İstatistik ve Makine Öğrenimi araç kutusu
Metanol (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Tehlikeli
Milli-Q suyu
Mix-n-Stain CF Boya Antikor Etiketleme KitleriBiotium92245Önerilen konjugasyon kiti
mPEGLaysan BiomPEG-süksinimidil valerat, MW 5.000
N- (2-aminoetil) -3-aminopropiltrimetoksisilanUCT United ChemicalA0700Tehlikeli
NanogridMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Bağlayıcı ProteinThermo Fisher Scientific31000
Azot (sıkıştırılmış gaz)
CUDAUyumluluğu https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 MikroskoptaOlympus
Parafilm M Sızdırmazlık FilmiLaboratuvar DeposuHS234526C
PBS pH 7.4Keson LaboratuvarlarıPBL06
PC-200 Analog SıcakPlaka Corning6795-200
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
Fosfo-EGF Reseptörü (Tyr1068) (1H12) Fare mAbHücre Sinyalizasyon Teknolojisi2236BF
Potasyum Klorür (KCl)Millipore Sigma529552Tyrode'un Tampon Bileşeni
Potasyum Hidroksit (KOH)Millipore Sigma1050330500Tehlikeli
Premium PLA Filament, 1,75 mm çap3D PMS'yi Yükselt2035U / RAL: 3028Baskı sıcaklık aralığı: 205-235 ve derece; C
Pro2 3D yazıcıRaise 3D
Pyrex 1 L beher
PYREX 100 mL saklama şişeleriCorning1395-100CH3< / sub >OH / C < sub>3< / sub>H < sub>6< / sub>O yeniden kullanım
Pyrex 250 mL beherler
Pyrex 4 L beher
Dörtlü görünüm Görüntü Bölücü FotometriModeli QV2
Soğutmalı santrifüjEppendorfEP-5415R
RevCount Hücre Sayaçları, EVE Hücre Sayma SlaytlarıVWR10027-446
Semrock emisyon filtreleri: mavi (445/45 nm), yeşil (525/45 nm), kırmızı (600/37 nm), uzak kırmızı (685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serolojik pipet kontrolörü
Serolojik Pipetler
smite tek molekül analiz paketihttps://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodyum Bikarbonat (NaHCO3< / sub>)Sigma AldrichS6014Tehlikeli
Sodyum Borhidrür (NaBH4< / sub>)Millipore Sigma452874Tyrode' s Tampon Bileşeni
Sodyum Klorür (NaCl)Millipore SigmaS9625Ardışık ısı ve pH döngüsü ile etkinleştirin
Sodyum HidroksitVWRBDH3247-1
Sodyum Ortovanadat (Na3VO4)Millipore SigmaS6508Tehlikeli
Sülfürik Asit (H2SO4)Millipore Sigma258105Tehlikeli
TetraSpeck MikroKüreler Thermo Fisher ScientificT7279çoklu floresan boncuklar
Tris (Trizma) tabanıMillipore SigmaT1503
Tripan mavi leke, %0,4Thermo Fisher Scientific15250061
Tripsin-EDTA %0,05Thermo Fisher Scientific25300120
ile NVIDIA GPU arayın :

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule Pull DownProtein PhosphorylationPhosphorylation QuantificationEGFR PhosphorylationImmunoprecipitation AssayAntibody LabelingGlass PreparationSingle Molecule ImagingColocalization AnalysisGaussian Localization

Related Articles