Yöntem makalesi

Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Mekansal Etkileşimin İncelenmesi

DOI:

10.3791/63679

⸱

31 Mart 2022

 , 
1Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), The Hebrew University of Jerusalem

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve beyin temizlemeyi birleştirmek, aynı anda çok sayıda nöron ve astrositin araştırılmasına izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve doku temizlemeyi birleştirmek, aynı anda birkaç beyin hücresi türünü ve etkileşimlerini araştırmayı mümkün kılar. Viral vektör iletimi, aynı doku içinde farklı floresan renklerinde farklı hücre tiplerinin işaretlenmesini sağlar. Hücreler genetik olarak aktivite veya projeksiyon ile tanımlanabilir. Modifiye edilmiş bir CLARITY protokolü kullanarak, astrositlerin ve nöronların potansiyel örneklem büyüklüğü 2-3 büyüklük sırasına göre büyümüştür. CLARITY kullanımı, dilimler halinde bütününe sığmayacak kadar büyük olan astrositlerin tamamının görüntülenmesini ve somatanın tüm işlemleriyle incelenmesini sağlar. Ek olarak, astrositler ve farklı nöronal hücre tipleri arasındaki mekansal etkileşimi, yani her astrositik alandaki piramidal nöronların sayısını veya astrositler ile spesifik inhibitör nöron popülasyonları arasındaki yakınlığı araştırma fırsatı sunar. Bu makale, bu yöntemlerin nasıl uygulanacağını ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, astrosit fonksiyonu ve nöronal devrelerle nasıl etkileşime girdikleri bilgisi çarpıcı bir şekilde artmıştır. Astrositler plastisiteyi etkileyebilir 1,2, nöronal yaralanma sonrası iyileşmeye yardımcı olabilir3,4 ve hatta astrositlerin hafıza edinimi ve ödülündeki önemini gösteren son çalışmalarla, daha önce tamamen nöronal fonksiyonlar olarak kabul edilen 5,6,7 . Astrosit araştırmalarında özellikle ilgi çekici bir özellik, hipokampus ve diğer beyin yapılarında benzersiz mekansal organizasyonları koruyan hücrelerin mekansal düzenlemesidir 8,9,10. Hücre somataları arasında iç içe geçen nöronal dendritlerin aksine, hipokampal astrositler, süreçleri arasında hafif örtüşme ile görsel olarak ayırt edilebilir bölgelerde yaşarlar ve farklı alanlar yaratırlar 8,11,12,13. Astrositlerin nöronal devrelere katılımını destekleyen kanıtlar, bu tür popülasyonların ve alanlarındaki nöronların ayrıntılı anatomik tanımının eksikliğini desteklememektedir14.

Viral vektör transdüksiyon prosedürleri, transgenik hayvanlarla (TG) birlikte, beyin yapılarını, fonksiyonlarını ve hücre etkileşimlerini araştırmak için bir araç seti olarak popülerleştirilmiştir15,16. Farklı promotörlerin kullanılması, spesifik hücrelerin genetik özelliklerine, aktivasyon seviyelerine17,18 veya projeksiyon hedeflerine göre hedeflenmesini sağlar. Farklı virüsler, farklı popülasyonlarda farklı renkli floroforları ifade edebilir. Bir virüs, TG'deki floroforların endojen ekspresyonu ile birleştirilebilir veya TG hayvanları virüslere ihtiyaç duymadan kullanılabilir. Bu teknikler nöronal işaretleme için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bazı laboratuvarlar bunları astrositler 5,9,19 gibi diğer hücre tiplerini hedeflemek için uzmanlaşmış modifikasyonlarla kullanmaya başlamıştır.

İlk olarak 201320,21'de tanımlanan CLARITY tekniği, mikroskobik yapıları sağlam bırakırken tüm beyni şeffaf hale getirerek kalın beyin dilimlerinin incelenmesini sağlar. İki yöntemi birleştirerek - viral vektör transdüksiyonu ve doku temizliği - farklı hücre tipi popülasyonları arasındaki uzamsal etkileşimleri inceleme seçeneği artık mevcuttur. Çoğu astrosit-nöron etkileşimi çalışması ince beyin dilimleri üzerinde gerçekleştirildi, bu da büyük alanları nedeniyle tamamlanmamış astrositlerin görüntüleriyle sonuçlandı ve böylece analiz edilen hücrelerin sayısını radikal bir şekilde kısıtladı. CLARITY tekniğinin kullanılması, aynı anda büyük ölçekli hacimlerde hücre popülasyonlarının tek hücreli çözünürlük karakterizasyonuna izin verir. Berrak beyinlerde floresan olarak etiketlenmiş hücre popülasyonlarının görüntülenmesi sinaptik çözünürlük sağlamaz, ancak astrositler ve çeşitli nöronal hücre tipleri arasındaki uzamsal etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesine izin verir.

Bu nedenle, astrositlerin dorsal CA1 boyunca özelliklerini araştırmak ve tüm laminaları (Stratum Radyatum, piramidal tabaka ve Stratum Oriens) görüntülemek için bu son teknoloji teknikleri kullandık. On binlerce astrositi ölçtük (viral penetransı >% 965 ile), böylece CA1 çevresindeki tüm astrositik popülasyonun bilgilerini analiz ettik. Nöronal belirteçlerin etkili penetransı ile, CA1 astrositlerinin tüm popülasyonu ile dört tip nöronal hücre-parvalbümin (PV), somatostatin (SST), VIP inhibitör nöronlar ve uyarıcı piramidal hücreler arasındaki etkileşimleri kaydedebiliriz9.

TG hayvanlarından floresan ve farklı renkli viral vektörlerin (tüm inhibitör hücreler) bir kombinasyonu kullanılarak çeşitli deneyler yapılırken, diğerleri (uyarıcı) farklı promotörler altında farklı floroforları ifade eden iki viral vektör kullandı9. Bu makale, beyinde istenen hücrelerin etiketlenmesi, değiştirilmiş bir CLARITY prosedürü kullanılarak beynin şeffaf hale getirilmesinin yanı sıra çeşitli prosedürler ve yazılımlar kullanarak tüm beyin yapılarının görüntülenmesi ve analiz edilmesi de dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel protokoller İbrani Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun yönergelerini karşıladı.

1. Viral vektör transdüksiyonu

NOT: Viral vektör iletimi, beyindeki floroforları eksprese etmek için kullanılır.

  1. Hedef alanın ilgili koordinasyonunu bulmak için bir atlas (örneğin, Allen Beyin Atlası) kullanın.
    NOT: 3B atlaslar çevrimiçi olarak bulunabilir (örneğin, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
  2. Stereotaktik cerrahi kullanarak, viral vektörleri ilgili beyin yapısına enjekte edin. Ayrıntılı bir protokol için9'a bakın.
  3. Florofor ekspresyonu için 3-6 hafta bekleyin.
    NOT: Sadece hücre gövdelerinin işaretlenmesi gerekiyorsa kısa bir süre yeterlidir. Aksonal projeksiyonlar soruyla ilgiliyse, floroforların birkaç milimetre uzunluğunda olabilen aksonlarda eksprese edilmesi daha uzun sürdüğü için uzun bir süreye ihtiyaç duyulacaktır.
  4. Florofor ekspresyonunun (hem viral ekspresyon hem de TG hayvanlarının) özgüllüğünü ve penetransını önceden doğrulayın (Şekil 1A). CLARITY prosedürüne geçmeden önce, ince dilimler için en az bir beyin belirleyin ve florofor ekspresyonunun hem güçlü hem de hedef hücre özelliğine özgü olduğundan emin olun.

2. NETLİK

NOT: Bu yöntem beyni 2-6 hafta içinde saydam hale getirir.

  1. Soğuk Fosfat tamponlu Salin (PBS) ve ardından PBS'de% 4 Paraformaldehit (PFA) kullanarak hayvanlar üzerinde transkraniyal perfüzyon uygulayın. Beyni çıkarın ve 50 mL'lik bir tüp veya benzeri bir kapta 4 ° C'de gece boyunca PFA'da tutun.
    NOT: Transkraniyal perfüzyon yapılmadan önce, hayvan derin anestezi altına alınmalıdır. Bu protokolde sunulan örneklerde, tüm hayvanlar Ketamin ve Ksilazin (sırasıyla% 90 ve% 10) kullanılarak uyuşturulmuştur.
  2. PFA'yı 4 °C'de 48 saat boyunca Hidrojel Çözeltisi (HS; bakınız Tablo 1) ile değiştirin.
    NOT: Bu aşamada malzemelerin soğutma sıcaklığından (4-8 ° C) daha sıcak olmasına izin vermeyin, aksi takdirde Hidrojel polimerize olur. Bu protokolde kullanılan HS, önceki protokollerin aksine% 4 veya% 17 öneren% 2 akrilamid içerir. %2'nin faydası tartışma bölümünde detaylandırılmıştır. HS'yi hazırlarken, buz gibi soğuk bir yüzey üzerinde çalışın. -20 °C'de saklayın.
  3. Gazdan arındırma
    NOT: Bu aşamanın amacı,O2 polimerizasyon işlemine müdahale ettiği için dokudaki tüm serbest oksijeni uzaklaştırmaktır. O2 olmayan herhangi bir gaz kullanılabilir (örneğin, N 2, CO2); N2 önerilir.
    1. N2'yi , ucundaki 19 G'lik bir iğneye bağlı 5 mm'lik (iç) esnek bir boru ile tanktan aktarın (Şekil 1B).
    2. Tüpün kapağında iki küçük delik (iğne genişliğinde) açın: biri gazı sokmak için, diğeri havanın tüpten ayrılmasına izin vermek için (Şekil 1C).
    3. BoruyuN2 gazından tüpe takın ve gazları oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 30 dakika boyunca değiştirin.
    4. Boruyu çıkarın ve delikleri hemen her tüpte modelleme kili ile kapatın (Şekil 1D).
  4. Gazdan arındırılmış sızdırmaz tüpleri, bir jel haline gelecek olan HS'yi polimerize etmek için 3,5 saat boyunca 37 ° C'lik bir banyoya aktarın. Tüpleri sallamamaya dikkat edin (Şekil 1E).
  5. Beyni tüpten çıkarın ve laboratuvar mendilleri kullanarak polimerize jeli etrafından yavaşça çıkarın. Doku yüzeyine bağlı artık jel kalmadığından emin olun, çünkü aşağıdaki adımlarda çözelti ile reaksiyona girerek doku temizleme işlemini inhibe edebilir (Şekil 1F).
    NOT: Jel PFA içerdiğinden, ekstraksiyon bir duman başlığı altında yapılmalıdır.
  6. Eldeki soru sadece bir kısmını gerektiriyorsa beyni dilimleyin. Ikiye veya tüm ilgi alanlarını içeren çok kalın dilimlere bölün (Şekil 1G).
  7. Dilimleri Birinci Temizleme Çözeltisine (CS1, bakınız Tablo 2) yeni bir kaba yerleştirin ve 37 °C'de 24 saat boyunca 70 rpm'de çalkalayın.
  8. Beyni CS1'den ikinci Temizleme Çözümüne aktarmak için aşağıda açıklanan adımları izleyin (CS2, bkz. Tablo 2).
    1. Beyin için önceden delikli bir tüp hazırlayın (Şekil 1H).
    2. CS2'yi tüpü içerecek kadar büyük bir beherde 40-45 °C'ye kadar önceden ısıtın. Bunu karıştırıcılı bir ocakta yapın. İfade edilen proteinlerin ağartılmasını önlemek için sıcaklığın 55 ° C'ye ulaşmadığından emin olun.
    3. CS2 ile doldurulmuş beheri ve delikli tüpü bir karıştırma cihazına ( Şekil 1I'de 2 L beher) yerleştirin. Sıvının dokuyu bozmadan akmasına neden olacak ılımlı bir karıştırma hızı ayarlayın.
      NOT: 2-6 hafta içinde doku saydam hale gelecektir (süreç çevreden başlar ve merkezi beyin yapılarına doğru içe doğru hareket eder). Dokunun ne zaman "yeterince açık" olduğuna dair karar kişisel yargıya bağlıdır. Beyin, mikroskop altında girişim olmadan görüntüleme için yeterince şeffaf olmalıdır (Şekil 1J yeterince açık değildir; Şekil 1K yeterince açık). Dokunun yeterince berrak olduğu noktanın aşılması doku sertliğinin kaybına neden olabilir.
  9. CS2'den PBST'ye (PBS'de %0,5 Triton X-100, bakınız Tablo 2) 37 °C'de yeni bir kapta 24 saat boyunca hafif sarsıntı (70 rpm) ile aktarın.
    NOT: PBST'de doku beyazımsı hale gelecektir (Şekil 1L). Netlik, Kırılma İndisi Eşleştirme Çözümüne (RIMS, bkz. adım 2.14) yerleştirildiğinde geri döner (ve iyileşir).
  10. PBST'yi yeni PBST ile değiştirin. Aynı koşullar altında (hafif sallanma ile 37 ° C) 24 saat daha saklayın.
  11. PBST'yi tekrar yeni PBST ile değiştirin ve RT'de 24 saat boyunca saklayın.
  12. RT'de PBS'ye 24 saat boyunca aktarın.
  13. PBS'yi değiştirin ve RT'de 24 saat daha bekletin.
  14. Beyni PBS'den çıkarın ve gece boyunca 37 ° C'de RIMS'ye aktarın.
    NOT: Başlangıçta, RIMS'deki dalgalanmalar beyni çevreleyebilir. Bu protokol iki özel ticari RIMS kullanılarak tasarlanmış ve doğrulanmıştır (bkz. Tablo 3). Bununla birlikte, protokol diğer RIM'leri (ticari veya kendi kendine yapılan) kullanırken farklılık göstermemelidir.
  15. Dokuyu RT'de 24 saat daha veya çözelti tam dengeye ulaşana kadar, yani doku şeffaf hale geldiğinde ve çözelti artık görünür dalgalanmalar içermediğinde tutun (Şekil 1M).
  16. Doku şeffaf ise, oda hazırlığına devam edin. Bu noktada, doku şeffaf yerine beyaz hale gelirse (artık SDS moleküllerinin agregaları nedeniyle), 2.9 ve 2.10 adımlarını tekrarlayarak numuneyi tekrar temizleyin ve dokuyu birkaç gün boyunca CS2'ye (adım 2.8) aktarın, ardından adım 2.15'e kadar tüm adımları izleyin.

3. Oda hazırlığı

NOT: Her numune, numunenin yerleştirileceği görüntüleme odasına sahip bir slayt gerektirir.

  1. Örneği slaytın ortasına yerleştirin.
  2. Sıcak bir tutkal tabancası kullanarak, slaytın kenarlarında, neredeyse doku kadar yüksek duvarlar oluşturun. Köşelerden birinde küçük bir boşluk (yaklaşık 5 mm) bıraktığınızdan emin olun (Şekil 2A,B).
  3. Üst yüzeyi nemli tutmak ve kapak kayması ile doku arasında kabarcıklar oluşmasını önlemek için numuneye 1-2 damla RIMS uygulayın.
  4. RIMS damlalarını uyguladıktan hemen sonra, duvarlara son sıcak yapıştırıcı tabakasını ekleyin (böylece beynin / dilimin yüksekliğine ulaşırlar) ve hemen (sıcak tutkal hala sıvı iken) adım 3.5'e ilerleyin.
  5. Üstünü bir kapak kayması ile kapatın, hala ılık sıcak tutkal tabakasının üstüne mümkün olduğunca eşit bir şekilde yerleştirin (Şekil 2C).
  6. Odayı sıcak tutkal duvarlarında kalan boşluktan RIMS ile doldurun (Şekil 2D, E).
  7. Boşluğu sıcak tutkalla kapatın. İçeride hava bırakmayın (Şekil 2F).
  8. Sıcak tutkal duvarları kızağın kenarlıklarının ötesine uzanıyorsa, uzatma kenarlarını kesin (Şekil 2G).
  9. Görüntüleme için kullanılan objektif daldırılırsa, daldırma çözeltisinin daha uzun süre dayanması için kapak kaymasının üzerindeki duvarlara 2-3 mm yapıştırıcı daha ekleyin (Şekil 2H).

4. Görüntüleme (konfokal veya iki foton)

  1. Odanın kalınlığı birkaç milimetreye ulaşabileceğinden, sahnenin odayı tutup tutamayacağını kontrol edin.
    NOT: Örneğin, bu protokolde kullanılan konfokal mikroskop ( Malzeme Tablosuna bakınız) birkaç aşama (örneğin, dairesel, dikdörtgen) ile donatılmıştır. Odayı tutmak için hangi aşama seçilirse seçilsin, parametreleri oda boyutlarına uyduğu sürece önemsizdir.
  2. Yeterli bir çalışma mesafesine, yani 3 mm'≥ minimum çalışma mesafesine sahip bir hedefle çalışın, çünkü ilgilenilen beyin bölgesi birkaç milimetre derinlikte olabilir ve kapak kayması manuel olarak yerleştirildiği gibi tamamen düz olmayabilir.
    NOT: Bir gösterim olarak, Şekil 1, Video 1 ve Video 2'de sunulan sonuçlar, 652 x 483 μm görüş alanı ve düzlemler arasında 0.937 μm aralıklarla bir z-yığını elde etmek için 3 mm çalışma mesafesi ve 2.4 büyütme ile bir su daldırma 16x hedefi kullanılarak iki fotonlu bir mikroskop altında elde edilmiştir.
  3. Birkaç saat hatta günler sürebilen çok alanlı görüntüleme gerçekleştirin. Her görüntünün boyutu onlarca gigabit'e kadar ulaşabileceğinden, bilgisayarda bol miktarda boş depolama alanı olduğundan emin olun.
    NOT: CLARITY görüntüleme, derinlikte önemli ölçüde daha fazla görüntü bölümüne neden olabilir. Bu nedenle, görüntü toplama sırasında aşırı ifadeyi önlemek için ifadeyi yakalamak için kullanılan yoğunluklar nispeten düşük olmalıdır.
  4. Daldırma hedefleri için, görüntüleme sırasında sıvıyı rutin olarak kontrol edin ve gerekirse ek sıvı ile destekleyin.
    NOT: Video 3'te sunulan verilerin görüntülenmesi sırasında, buharlaşmayla mücadele etmek için odanın yüzeyine her 6-8 saatte bir su eklenmiştir.
  5. Görüntü alındıktan sonra, birkaç farklı yazılım paketi kullanarak görüntüleyin ve analiz edin.
    NOT: Önerilen yazılım, hem görselleştirme hem de analiz için Imaris ve SyGlass'ı içerir. Imaris yazılımı kullanılarak astrositlerin optimize edilmiş rekonstrüksiyonu için hassas boru hattı daha önce9 olarak tanımlanmıştır. Kısacası, bu çalışmada kullanılan Imaris özellikleri, hücre yapılarını tamamen yeniden yapılandırmak için Filamentler ve tüm somataların uzayındaki pozisyonu çıkarmak için Lekelerdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalın beyin dokusu dilimlerinin başarılı bir şekilde temizlenmesi, tek hücrelerin veya komşu hücre gruplarının özelliklerinin aksine, büyük hücre popülasyonlarının özellikleri hakkında sorulabilecek yeni bir dizi soruyla sonuçlanır. Başarılı sonuçlar elde etmek için, numuneler arasındaki varyansı azaltmak için dikkate alınması gereken çok çeşitli parametreler olduğundan (örneğin, berraklık yüzdesi, floresan bilgisi, şişlik parametreleri) CLARITY protokolüne kesinlikle uyulmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku temizleme yöntemleri, beyin araştırmalarında devrim niteliğinde bir araç sunarak, daha önce sorulamayan soruları davet ediyor. Küçük bir hücre grubunun, tek bir hücrenin veya hatta tek bir sinapsın özelliklerini hedeflemekten, CLARITY artık ilgili floroforları kullanarak toplam hücre popülasyonlarının veya uzun menzilli bağlantı özelliklerinin hedeflenmesini sağlar.

Florofor ekspresyonu ve CLARITY prosedür kombinasyonunun sonucu ikili değildir; birçok faktör prosedüre müdahale edebilir ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı (hibe anlaşması No 803589), İsrail Bilim Vakfı (ISF hibe No. 1815/18) ve Kanada-İsrail hibeleri (CIHR-ISF, hibe No. 2591/18) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC) finansman almıştır. Nechama Novic'e tüm el yazması hakkında yorum yaptığı için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AAV1-GFAP::TdTomatoELSC Vektör Çekirdek Tesisi (EVCF)astrositleri tespit etmek için kullanılan viral vektör
AAV5-CaMKII::eGFPELSC Vektör Çekirdek Tesisi (EVCF)nöronları tespit etmek için kullanılan viral vektör
AAV5-CaMKII::H2B-eGFPELSC Vektör Çekirdek Tesisi (EVCF)nöronal çekirdekleri tespit etmek için kullanılan viral vektör
AAV5-CaMKII::TdTomatoELSC Vektör Çekirdek Tesisi (EVCF)nöronları tespit etmek için kullanılan viral vektör
Akrilamid (%40)Bio-rad#161-0140
Bisakrilamid (%2)Bio-rad#161-0142
Borik asitSigma#B7901Molekül ağırlığı - 61,83 g/mol
Konfokal mikroskop, tarama, FV1000Olympus4x objektif (UPlanSApo, 0.16 NA)
Imaris yazılımıBitplane, UKGörüntülerin 3D analizine izin veren bir yazılım
NaOHSigma#S5881
PBS
PFA %4EMS#15710
RapiClearSunJin lab#RC147002
RapiClear CSSunJin lab#RCCS002
SDSSigma#L3771
SyGlass yazılımıSanal gerçeklik kullanarak görüntülerin 3D analizine izin veren bir yazılım
Tris tabanı 1 MBio-rad#002009239100Molekül ağırlığı - 121,14 g/mol
Triton X-100ChemCruz#sc-29112A
İki foton mikroskobuNeurolabwareTi: safir lazer (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP foto çarpan tüpleri (Hamamatsu, H10770-40), bant geçiren filtre (Semrock), suya daldırma 16x objektif (Nikon, 0.8 NA)  
VA-044 BaşlatıcıWako#011-19365

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
  2. Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease. Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).
  3. Sylvain, N. J., et al. The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573(2021).
  4. Kitchen, P., et al. Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema. Cell. 181 (4), 784-799 (2020).
  5. Adamsky, A., et al. Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement. Cell. 174 (1), 59-71 (2018).
  6. Adamsky, A., Goshen, I. Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions. Neuroscience. 370, 14-26 (2018).
  7. Nagai, J., et al. Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits. Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).
  8. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).
  9. Refaeli, R., et al. Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons. Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).
  10. Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human. eLife. 5, 15915(2016).
  11. Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).
  12. Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).
  13. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  14. Chai, H., et al. Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  15. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
  16. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159(2005).
  17. Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
  18. DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).
  19. Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  20. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  21. Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
  22. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Astrocyte Neuron InteractionTissue ClearingCLARITY MethodViral Vector TransductionSpatial ProximityBrain Cell ImagingTwo Photon MicroscopyConfocal MicroscopyMouse HippocampusPyramidal Neurons

İlgili makaleler