Method Article

Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/63690

⸱

May 5th, 2022

 , 
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Periferik sinirlerdeki mitokondriyal disfonksiyon, otoimmün hastalıklar, diyabet, enfeksiyonlar, kalıtsal bozukluklar ve tümörler dahil olmak üzere birçok nedenden dolayı tetiklenebilen periferik nöropati ile ilişkili çeşitli hastalıklara eşlik eder. Fare periferik sinirlerinde mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, küçük örneklem büyüklüğü, dokuda bulunan sınırlı sayıda mitokondri ve bir miyelin kılıfının varlığı nedeniyle zor olabilir. Bu çalışmada açıklanan teknik, mitokondrileri dokudan izole etmek yerine siyatik sinir mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için kas lifleri için kullanılandan uyarlanmış benzersiz bir geçirgenlik protokolü kullanarak bu zorlukları en aza indirir. Amplex Red/Peroksidaz ile florimetrik reaktif tür üretimini ölçerek ve saponin-geçirgenleştirilmiş sinirlerdeki farklı mitokondriyal substratları ve inhibitörleri karşılaştırarak, mitokondriyal solunum durumlarını, reaktif oksijen türlerini (ROS) ve mitokondriyal komplekslerin aktivitesini aynı anda tespit etmek mümkün olmuştur. Bu nedenle, burada sunulan yöntem, mitokondriyal fonksiyonun diğer tekniklerle değerlendirilmesine kıyasla avantajlar sunmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, hücre canlılığını korumak için gereklidir ve enerji metabolizması (glikoz, amino asit, lipit ve nükleotid metabolizma yolları) gibi çok sayıda hücre fonksiyonunu yerine getirir. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin birincil yeri olan mitokondri, apoptoz gibi çeşitli hücre sinyal süreçlerinde merkezidir ve demir-kükürt (Fe-S) kümelerinin sentezine, mitokondriyal protein ithalatına ve olgunlaşmasına ve genomlarının ve ribozomlarının korunmasına katılır 1,2,3. Mitokondriyal membran dinamiği ağı, füzyon ve fisyon süreçleri tarafından kontrol edilir ve ayrıca ka....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Araştırmada Hayvanların Kullanımı Etik Komitesi, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri deney hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kılavuzlar tarafından onaylanmıştır. Siyatik sinir, dört aylık erkek C57BL / 6 farelerinden izole edilir ve kurumsal kılavuzlara göre servikal çıkık ile ötenazi yapılır. Protokol adımları, mitokondriyal bozulmayı önlemek için optimize edilmiştir. Bu nedenle bu protokolde polarografik oksijen sensörlerinin kalibrasyonu fare siyatik sinir dokusu diseksiyonu ve geçirgenliği öncesinde gerçekleştirilmiştir.

1. Reaktiflerin hazırlanması

  1. Doku Koruma Tamponunu (TP T....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Permeabilize siyatik sinir tarafından mitokondriyal oksijen tüketimi Şekil 2'de gösterilmiştir. Kırmızı iz, pmol / s.mg cinsinden birim kütle başınaO2 akısını temsil eder. Endojen substratlarla (rutin solunum) bazal oksijen tüketimini kaydettikten sonra, kompleks II (süksinat dehidrogenaz) güdümlü solunumu kaydetmek için süksinat (SUCC) enjekte edilir ve bu da oksijen tüketim oranında bir artışa neden olur. Sırayla, ATP sentazı aktive eden ve oksidatif fosforilasyonu yönlendiren d.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöropatilere eşlik eden çeşitli hastalıklar veya durumlar risk faktörü olarak mitokondriyal disfonksiyona sahiptir. Periferik sinirlerde mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, mitokondrinin bu nörodejeneratif koşullarda nasıl davrandığını aydınlatmak için gereklidir. Mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, izolasyon yönteminin zorluğu ve malzeme kıtlığı nedeniyle zahmetlidir. Bu nedenle, mitokondri izolasyonunu gerektirmeyen doku geçirgenleştirme tekniklerinin geliştirilmesi esastır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) tarafından finanse edilmiştir. Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli ve Dr. Claudio Masuda'ya laboratuvar tesislerine verdikleri destek için ve Dr. Martha Sorenson'a makalenin geliştirilmesinde nazik ve değerli yorumları için minnettarız.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Adenozin 5' trifosfat dissodyum tuzu hidratSigma-AldrichA26209
Adenozin 5′-difosfat sodyum tuzuSigma-AldrichA2754
Amplex Red ReaktifThermo Fisher scientificA12222Amplex Red, ürün veri sayfası
Antimisin A'ya (Streptomyces sp.'den)Sigma-AldrichA8674
Sığır Serumu AlbüminiSigma-AldrichA7030ısı şoku fraksiyonu, proteaz içermez, yağ asidi içermez, esasen globulin içermez, pH 7, & ge; % 98
Kalsiyum karbonatSigma-AldrichC6763
Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Sitokrom cSigma-AldrichC7752(at kalbinden; küçük hemeprotein)
DataLab sürüm 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS, AvusturyaTelif Hakkı (c) 2002 - 13 Dr. Erich Gnaiger tarafından
Dijital orbital mikroplaka çalkalayıcı 120VThermo Fisher bilimsel88882005
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43819
EGTA sodyum tuzuSigma-AldrichE8145
Hamilton şırıngaSigma-AldrichHAM8007510 uL, 25 uL ve 50 uL
HEPESSigma-AldrichH3375
Hidrojen peroksit çözeltisi %30 W/WMerckH1009
İmidazolSigma-AldrichI2399
L-(&eksi;)-Malik asitSigma-AldrichM7397
Magnezyum klorür hekzahidratSigma-AldrichM2393
MES sodyum tuzuSigma-AldrichM3885
Mikro diseksiyon forsepsleri, kavisliSigma-AldrichF4142
Mikro diseksiyon forsepsleri, düzSigma-AldrichF4017
O2K - Filtre seti Amplex RedOROBOROS INSTRUMENTS, Avusturya44321-01Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Florometri: fare beyni mitokondrilerinde HRR ve H2O2 üretimi. Mitokondr Fizyol Ağı 17.17.
O2K - Floresan LED2 - modül bileşeni Floresan Sensörü YeşilOROBOROS INSTRUMENTS, Avusturya44210-01
OligomisinSigma-AldrichO4876(Streptomyces diastatochromogenes'ten; oligomisin A, B ve C karışımı
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS, Avusturyahttp://www.oroboros.at
Palmitoilkarnitin (Palmitoil-DL-karnitin-HCl)Sigma-AldrichP4509
Yaban turpundan elde edilen peroksidazSigma-AldrichP8375
Petri kapları, polistirenMERCKP5606
Fosfokreatin disodyum tuzu hidratSigma-AldrichP7936
Potasyum dihidrojen fosfat monobazikSigma-AldrichPHR1330
Potasyum hidroksitSigma-Aldrich221473
RotenoneSigma-AldrichR8875
SaponinSigma-AldrichSAE0073
Sodyum piruvatSigma-AldrichP5280
Sodyum süksinat dibazik hekzahidratSigma-AldrichS2378
SükrozSigma-AldrichS9378
TaurinSigma-AldrichT0625
uygun olarak DMSO'da hazırlanmıştır.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reac....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial FunctionSciatic NerveHigh Resolution RespirometryOxygen ConsumptionReactive Oxygen SpeciesSaponin PermeabilizationElectron Transport SystemMitochondrial Complex ActivityATP SynthesisPeripheral Neuropathy

Related Articles