Method Article

Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/63690

⸱

May 5th, 2022

 , 
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Periferik sinirlerdeki mitokondriyal disfonksiyon, otoimmün hastalıklar, diyabet, enfeksiyonlar, kalıtsal bozukluklar ve tümörler dahil olmak üzere birçok nedenden dolayı tetiklenebilen periferik nöropati ile ilişkili çeşitli hastalıklara eşlik eder. Fare periferik sinirlerinde mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, küçük örneklem büyüklüğü, dokuda bulunan sınırlı sayıda mitokondri ve bir miyelin kılıfının varlığı nedeniyle zor olabilir. Bu çalışmada açıklanan teknik, mitokondrileri dokudan izole etmek yerine siyatik sinir mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için kas lifleri için kullanılandan uyarlanmış benzersiz bir geçirgenlik protokolü kullanarak bu zorlukları en aza indirir. Amplex Red/Peroksidaz ile florimetrik reaktif tür üretimini ölçerek ve saponin-geçirgenleştirilmiş sinirlerdeki farklı mitokondriyal substratları ve inhibitörleri karşılaştırarak, mitokondriyal solunum durumlarını, reaktif oksijen türlerini (ROS) ve mitokondriyal komplekslerin aktivitesini aynı anda tespit etmek mümkün olmuştur. Bu nedenle, burada sunulan yöntem, mitokondriyal fonksiyonun diğer tekniklerle değerlendirilmesine kıyasla avantajlar sunmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, hücre canlılığını korumak için gereklidir ve enerji metabolizması (glikoz, amino asit, lipit ve nükleotid metabolizma yolları) gibi çok sayıda hücre fonksiyonunu yerine getirir. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin birincil yeri olan mitokondri, apoptoz gibi çeşitli hücre sinyal süreçlerinde merkezidir ve demir-kükürt (Fe-S) kümelerinin sentezine, mitokondriyal protein ithalatına ve olgunlaşmasına ve genomlarının ve ribozomlarının korunmasına katılır 1,2,3. Mitokondriyal membran dinamiği ağı, füzyon ve fisyon süreçleri tarafından kontrol edilir ve ayrıca kalite kontrol ve mitofi 4,5,6 için makinelere sahiptir.

Mitokondriyal disfonksiyon, kanser, diyabet ve obezite gibi çeşitli patolojik durumların ortaya çıkmasıyla ilişkilidir7. Mitokondriyal fonksiyondaki bozukluklar, Alzheimer hastalığı8,9, Parkinson hastalığı10,11, amiyotrofik lateral skleroz12,13 ve Huntington hastalığı 14,15'te olduğu gibi, merkezi sinir sistemini etkileyen nörodejeneratif bozukluklarda tespit edilir. . Periferik sinir sisteminde, Guillain-Barré sendromu 16,17 gibi immün nöropatilerde aksonlarda mitokondriyal fonksiyon kaybı gözlenir ve aksonlara yüksek mitokondriyal ROS üretimi ile birlikte, bu olaylar Schwann hücrelerinde MAP Kinaz aktivasyonuna yol açar18. Bu, mitokondriyal fizyolojinin sadece bölgeye özgü bir hücre için değil, tüm doku için gerekli olabileceğini göstermektedir. HIV ile ilişkili distal duyusal polinöropatide (HIV-DSP), mitokondri, transkriptasyon transaktivatörü (HIV-TAT) proteininin HIV'in etkili bir şekilde çoğalmasına izin verdiği mekanizmada ve HIV enfeksiyonu patogenezinde diğer birçok rolde rol oynamaktadır19,20.

Siyatik sinir mitokondriyal fizyolojisinin değerlendirilmesi, nöropatinin araştırılmasında temel bir hedef olarak ortaya çıkmıştır 7,21,22. Diyabetik nöropatide, proteomik ve metabolomik analizler, diyabetteki moleküler değişikliklerin çoğunun siyatik sinir mitokondriyal oksidatif fosforilasyonunu ve lipid metabolizmasını etkilediğini düşündürmektedir7. Bu değişiklikler aynı zamanda obeziteye bağlı diyabetin erken belirtileri gibi görünmektedir21. Kemoterapiye bağlı ağrılı nöropatinin bir fare modelinde, siyatik sinirdeki mitokondriyal bozulma, oksidatif fosforilasyon22'de bir azalma ve mitokondriyal komplekslerin aktivitelerinin, membran potansiyelinin ve ATP içeriğinin azalması olarak tespit edilir23. Bununla birlikte, birkaç grup nöropatilerde mitokondriyal disfonksiyondan bahsetmiş olsa da, bu çalışmalar mitokondriyal membranların korunmadığı, mitokondriyal bütünlüğün değerlendirilmesi veya mitokondriyal ATP üretimi için bir parametre olarak ATP içeriğinin ölçülmemesi ile mitokondriyal komplekslerdeki aktivite ölçümleri ile sınırlıdır. Genel olarak, mitokondriyal oksijen tüketiminin ve ROS üretiminin uygun bir değerlendirmesi, bir perkoll/sakkaroz gradyanında diferansiyel santrifüjleme ile mitokondrinin izolasyonunu gerektirir. Mitokondrinin izolasyonu, ihtiyaç duyulan büyük miktarda doku ve mitokondri kaybı ve bozulması nedeniyle siyatik sinir dokusu için sınırlayıcı bir faktör olabilir.

Bu çalışma, mitokondriyal fizyolojiyi siyatik sinirde mitokondriyal oksijen tüketimi ve ROS üretimi olarak ölçmek, mitokondriyal membranları korumak ve mitokondri izoline ihtiyaç duymadan ölçmek için bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş kas lifleri24'teki oksijen tüketimi ölçümlerinden yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) ile uyarlanmıştır. Bu prosedürün avantajları, siyatik sinir gibi az miktarda dokuda mitokondrinin değerlendirilmesi ve mitokondriyal parametrelerin in situ olarak değerlendirilmesi, böylece mitokondriyal ortamın, yapının ve biyoenerjetik profilin korunması, fizyolojik olarak güvenilir bir sonuç elde edilmesidir. Mitokondriyal solunum durumları, mitokondriyal membran bütünlüğü için mitokondriyal biyoenerjetik ve sitokrom c katsayısını doğru bir şekilde değerlendirmek için siyatik sinir geçirgenizasyonundan sonra substratlar ve inhibitörler ile belirlendi ve mitokondriyal elektron taşıma sisteminin (ETS) değerlendirilmesi ve temel parametrelerin hesaplanması adımları için bir rehber sağladı. Bu çalışma, periferik nöropatiler gibi siyatik sinir metabolizmasının rol oynadığı patofizyolojik mekanizmalardaki soruları cevaplamak için araçlar sağlayabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Araştırmada Hayvanların Kullanımı Etik Komitesi, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri deney hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kılavuzlar tarafından onaylanmıştır. Siyatik sinir, dört aylık erkek C57BL / 6 farelerinden izole edilir ve kurumsal kılavuzlara göre servikal çıkık ile ötenazi yapılır. Protokol adımları, mitokondriyal bozulmayı önlemek için optimize edilmiştir. Bu nedenle bu protokolde polarografik oksijen sensörlerinin kalibrasyonu fare siyatik sinir dokusu diseksiyonu ve geçirgenliği öncesinde gerçekleştirilmiştir.

1. Reaktiflerin hazırlanması

  1. Doku Koruma Tamponunu (TP Tamponu) hazırlayın.
    1. Aşağıdaki reaktifleri ultra saf su çözeltisinde hazırlayın: 0.1 μM serbest kalsiyum, 20 mM imidazol, 20 mM taurin, 50 mM K-MES, 0.5 mM DTT, 6.56 mM MgCl2, 5.77 mM ATP, 15 mM fosfokreatin içeren 10 mM Ca-EGTA tamponu (bkz. -20°C'de saklayın.
  2. Mitokondri Solunum Tamponunu (MR Tamponu) hazırlayın.
    1. Aşağıdaki reaktifleri ultra saf su çözeltisinde hazırlayın: 0,5 mM K 2 EGTA, 3 mM MgCl 2, 60 mM MES, 20 mM taurin, 10 mM KH2PO 4, 20 mM HEPES, 110 mM D-sakaroz,1 mg / mL BSA (yağ asidi içermeyen) (bkz. Malzeme Tablosu), pH7.4. -20 °C'de saklayın.
  3. 1 mL TP Tamponunda (adım 1.1) 5 mg saponini (Malzeme Tablosuna bakınız) çözerek saponin stok çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Saponin taze olarak hazırlanır.
  4. 2 mM'lik bir stok konsantrasyonu elde etmek için tozu DMSO ile yeniden askıya alarak Amplex Red'i hazırlayın (bkz.
    NOT: Probun donma ve çözülme yoluyla yıpranmasını önlemek için, 6 aydan daha uzun olmayan depolama için küçük alikotlar yapın25.

2. Yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) için polarografik oksijen sensörlerinin kalibrasyonu

  1. Cihazın ve şırıngaların HRR odalarını temizleyin (bkz.
    1. HRR odalarını açın, tepeye kadar damıtılmış suyla doldurun ve 5 dakika 3x karıştırın. Etanol ile tekrarlayın ve sonra tekrar su ile tekrarlayın. Tapaları ve şırıngaları her biri 3 kat su / etanol / su ile yıkayın.
  2. HRR yazılımında aşağıdaki kalibrasyon ayarlarını uygulayın (bkz.
    1. HRR yazılım kontrolünde, deneysel sıcaklığı (37 ° C), oksijen sensörü parametrelerini (kazanç, 2; polarizasyon voltajı, 800 mV) ve amperometrik sensör (kazanç, 1000; polarizasyon voltajı, 100 mV) ekleyin.
  3. Oksijen sensörlerini kalibre edin.
    1. Her hazneye 2,1 mL MR Arabelleği (adım 1.2) pipetin. Tapalarla kapatın ve bir kabarcık oluşana kadar odaya hava çekin. Kütle başına oksijen akışı sabit olana kadar kalibrasyon modunda 1 saat boyunca 37 °C'de karıştırın.
    2. Yazılımdaki polarografik oksijen sensörlerinin hava kalibrasyonunu üreticinin protokolüne göre gerçekleştirin24.
      NOT: Kalibrasyon adımı bir deneyden önce yalnızca bir kez gerçekleştirilir. Aynı solunum ortamında ve sıcaklığında ek deneyler sadece yıkama odalarından sonra yapılabilir (adım 2.1).

3. Siyatik sinirin diseksiyonu ve geçirgenleşmesi

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek siyatik siniri çıkarın.
    1. Kafesten çıkarıldıktan sonra servikal çıkık ile hayvanı ötenazi yapın ve bankta dinlenmek için hafifçe kısıtlanır.
    2. Ötenazi yapılan hayvanda, omurganın yakınından başlayarak ve uyluktan ayağa doğru ilerleyerek alt sırtta makasla bir kesi yapın. Sinire bağlı deri ve kası çıkarın ve ardından tüm siyatik siniri kesin ve çıkarın.
    3. Dokuyu hemen tartın ve soğuk TB Tamponu (4 ° C) ile dolu bir şişeye yerleştirin. Buz üzerinde 3.2-3.3 arasındaki adımları uygulayın.
      NOT: Islak doku ağırlığı, aşağıdaki adımlarda oksijen tüketimini ve ROS üretim akışını normalleştirmek için kullanılır. Doku hemen tartılamazsa, soğuk TB Tamponunda saklayın. İşlem taze dokuda gerçekleştirilir ve mitokondriyal hasarı önlemek için dondurulmamalıdır.
  2. Doku hazırlığı için, siyatik siniri, örtmek için yeterli TP Tamponu olan bir Petri kabına yerleştirin. Sinirin bir ucunu forsepslerle tutun ve başka bir çift forseps ile sinir demetlerini yatay olarak çekin.
    NOT: Doku bozulmasını önlemek için bu prosedürün 10 dakikadan daha kısa sürede yapılması gerekir. Doku, önceki beyaz opak dokunun karşısında, şeffaf sisli tabakalar olarak görselleştirilebildiğinde hazır olacaktır (Şekil 1).
  3. İlk olarak, oynatılmış dokuyu doku geçirgenliği için 1 mL TP Tamponu içeren küçük bir kaba aktarın. Permeabilizasyonu başlatmak için, forsepsli dokuyu 1 mL TP Tamponu ve 10 μL saponin içeren bir kaba aktarın (stok çözeltisinden, adım 1.3).
    1. Bir mikroplaka çalkalayıcıda 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayın, ardından forseps içeren dokuyu MR Tamponu (1 mL) içeren taze bir kaba aktarın ve 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Forseps ile dokuyu kalibre edilmiş bir HRR odasına aktarın.

4. Oksijen tüketimi ve ROS üretim tayini

  1. HRR odalarını 2.1 mL MR Tamponu ile doldurun, 5 μM'lik son konsantrasyona Amplex Red (adım 1.4) ve 2 U / mL'ye peroksidaz ekleyin ve geçirgenleştirilmiş siyatik siniri ekleyin (adım 3).
    1. Cihazın floresan sensörlerini takın, yazılımın kontrol bölümündeki ışıkları kapatın ve Oksigrafa bağlan düğmesine basın. Yazılımdaki "düzenleme protokolleri" bölümünde, adım 3.1.3'te ölçülen doku ağırlığını girin.
  2. "Düzen"e gidin, "birim numune başına spesifik akı" seçeneğini belirleyin ve oksijen tüketimi okumasına ve istenirse H2O2 üretimine aynı anda erişmek için Grafikler'i seçin. ~10 dakika bekleyin.
    NOT: Bu süre, ilave substrat (bazal) olmadan oksijen tüketiminin bazal akışını stabilize etmek için gereklidir. Daha fazla enjeksiyondan önce, oksijen akışının stabilize edildiğinden emin olun.
  3. Haznede daha sonra kalibrasyon için her biri260μM'lik son konsantrasyona kadar iki adet H2 O 2 darbesi enjekte edin.
  4. Mitokondriyal elektron taşıma sistemini aktive etmek için bir mitokondriyal kompleks II substratı olan 20 μL süksinat (bakınız Malzeme Tablosu) enjekte edin.
    NOT: Bu noktada, mitokondriyal fonksiyonu farklı kompleksler tarafından değerlendirmek için farklı mitokondriyal substratlar eklenebilir. Mitokondriyal kompleksler I ve II için değişen substratlarla temsili sonuçlar Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu noktada, Şekil 3'te eş zamanlı olarakO2 tüketimive H2O2 üretiminde bir artış gözlenmektedir.
  5. Adenozin trifosfat (ATP) sentezini aktive etmek için 20 μL adenozin difosfat (ADP) ekleyin.
    NOT: ADP, ATP sentezini uyarır ve membran potansiyelini azaltır. O2 tüketiminde artış ve H2O2 üretiminde azalma26,27 olarak gözlenmesi beklenmektedir.
  6. Sırayla, membran bütünlüğünün bir göstergesi olarak 5 μL sitokrom c ekleyin ( bakınız Malzeme Tablosu).
    NOT: Doku iyi hazırlanmış ve geçirgenleştirilmişse, sitokrom c oksijen tüketimini% 15'ten fazla artırmamalıdır. Bu durumda, öneriler için sorun giderme bölümüne bakın.
  7. O2 tüketiminde daha fazla azalma gözlenmeyene kadar 0.2 μg / mL oligomisin alikotları ile titre edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Oligomisin, ATP sentezini inhibe ederekO2 akışında bir azalmaya ve yüksek membran potansiyeli26,27tarafından tercih edilen H2O2 oluşumunda bir artışa yol açarak etki eder.
  8. 0.5 μmol / L karbonil siyanür 4-(triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) alikotları ile titrat ( bakınız Malzeme Tablosu), mitokondriyal uncoupler,O2 tüketiminde daha fazla artış gözlemlemek mümkün olana kadar. Deneyi bitirmek için, 5 μM'lik son konsantrasyona 2 μl antimisin A enjekte edin ve akış stabilizasyonunu bekleyin.
    NOT: FCCP enjekte edildikten sonra membran potansiyel dağılımınedeniyle H2O2 üretiminde bir azalma gözlenir. Antimisin A, kompleks III'ü inhibe eder, böylece elektronların akışını önler. Bu nedenle, mitokondriye bağımlı O2 tüketimi bozulur, kütle başına oksijen akışını azaltır ve elektron sızıntısını uyarır, H2 O2üretimini26,27 arttırır.
  9. Komut çubuğuna gidin, yazılımda "multisensory" yi arayın, Kontrol > Dosyayı kaydet ve Bağlantıyı kes'e tıklayın.
    NOT: Diğer substratların ve inhibitörlerin eklenmesi, çalışılan soruya göre gerçekleştirilebilir. Temsili sonuçlarda bir örnek açıklanmıştır. H2 O2 kalibrasyonu, üreticinin protokolü28'e göre deneyi bitirdikten sonra gerçekleştirilir.
  10. Kaydedilen dosyayı açın ve deneysel oksijen tüketimi sonuçlarını elde etmek için "Kütle Başına Oksijen Akısı" izini seçin. Shift + Sol fare düğmesine basarak enjeksiyonlar arasındaki pencereyi manuel olarak seçin.
    1. Her bir substrat/inhibitör/bağlanmamış protokol enjeksiyonunun sonuçlarını görselleştirmek için İşaretler > İstatistikleri'ne gidin. H2O2üretimi için, aynı prosedürü "Amp-Slope" izi ile gerçekleştirin.
      NOT: Pencereyi seçerken, oksijenin (veyaH2 O2) daha kararlı ve sabit olduğu bir pencere seçerek hacim enjeksiyonlarının artefaktlarından kaçının. Seçilen pencerelerin örnekleri, temsili sonuçlarda siyah parantezlerle gösterilmiştir (Şekil 2 ve Şekil 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Permeabilize siyatik sinir tarafından mitokondriyal oksijen tüketimi Şekil 2'de gösterilmiştir. Kırmızı iz, pmol / s.mg cinsinden birim kütle başınaO2 akısını temsil eder. Endojen substratlarla (rutin solunum) bazal oksijen tüketimini kaydettikten sonra, kompleks II (süksinat dehidrogenaz) güdümlü solunumu kaydetmek için süksinat (SUCC) enjekte edilir ve bu da oksijen tüketim oranında bir artışa neden olur. Sırayla, ATP sentazı aktive eden ve oksidatif fosforilasyonu yönlendiren d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöropatilere eşlik eden çeşitli hastalıklar veya durumlar risk faktörü olarak mitokondriyal disfonksiyona sahiptir. Periferik sinirlerde mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, mitokondrinin bu nörodejeneratif koşullarda nasıl davrandığını aydınlatmak için gereklidir. Mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, izolasyon yönteminin zorluğu ve malzeme kıtlığı nedeniyle zahmetlidir. Bu nedenle, mitokondri izolasyonunu gerektirmeyen doku geçirgenleştirme tekniklerinin geliştirilmesi esastır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) tarafından finanse edilmiştir. Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli ve Dr. Claudio Masuda'ya laboratuvar tesislerine verdikleri destek için ve Dr. Martha Sorenson'a makalenin geliştirilmesinde nazik ve değerli yorumları için minnettarız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Adenozin 5' trifosfat dissodyum tuzu hidratSigma-AldrichA26209
Adenozin 5′-difosfat sodyum tuzuSigma-AldrichA2754
Amplex Red ReaktifThermo Fisher scientificA12222Amplex Red, ürün veri sayfası
Antimisin A'ya (Streptomyces sp.'den)Sigma-AldrichA8674
Sığır Serumu AlbüminiSigma-AldrichA7030ısı şoku fraksiyonu, proteaz içermez, yağ asidi içermez, esasen globulin içermez, pH 7, & ge; % 98
Kalsiyum karbonatSigma-AldrichC6763
Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Sitokrom cSigma-AldrichC7752(at kalbinden; küçük hemeprotein)
DataLab sürüm 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS, AvusturyaTelif Hakkı (c) 2002 - 13 Dr. Erich Gnaiger tarafından
Dijital orbital mikroplaka çalkalayıcı 120VThermo Fisher bilimsel88882005
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43819
EGTA sodyum tuzuSigma-AldrichE8145
Hamilton şırıngaSigma-AldrichHAM8007510 uL, 25 uL ve 50 uL
HEPESSigma-AldrichH3375
Hidrojen peroksit çözeltisi %30 W/WMerckH1009
İmidazolSigma-AldrichI2399
L-(&eksi;)-Malik asitSigma-AldrichM7397
Magnezyum klorür hekzahidratSigma-AldrichM2393
MES sodyum tuzuSigma-AldrichM3885
Mikro diseksiyon forsepsleri, kavisliSigma-AldrichF4142
Mikro diseksiyon forsepsleri, düzSigma-AldrichF4017
O2K - Filtre seti Amplex RedOROBOROS INSTRUMENTS, Avusturya44321-01Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Florometri: fare beyni mitokondrilerinde HRR ve H2O2 üretimi. Mitokondr Fizyol Ağı 17.17.
O2K - Floresan LED2 - modül bileşeni Floresan Sensörü YeşilOROBOROS INSTRUMENTS, Avusturya44210-01
OligomisinSigma-AldrichO4876(Streptomyces diastatochromogenes'ten; oligomisin A, B ve C karışımı
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS, Avusturyahttp://www.oroboros.at
Palmitoilkarnitin (Palmitoil-DL-karnitin-HCl)Sigma-AldrichP4509
Yaban turpundan elde edilen peroksidazSigma-AldrichP8375
Petri kapları, polistirenMERCKP5606
Fosfokreatin disodyum tuzu hidratSigma-AldrichP7936
Potasyum dihidrojen fosfat monobazikSigma-AldrichPHR1330
Potasyum hidroksitSigma-Aldrich221473
RotenoneSigma-AldrichR8875
SaponinSigma-AldrichSAE0073
Sodyum piruvatSigma-AldrichP5280
Sodyum süksinat dibazik hekzahidratSigma-AldrichS2378
SükrozSigma-AldrichS9378
TaurinSigma-AldrichT0625
uygun olarak DMSO'da hazırlanmıştır.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
  3. Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
  4. Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
  5. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
  6. Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  7. Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
  8. Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
  9. Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
  10. Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson's disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
  11. Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
  12. Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552(2021).
  13. Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737(2021).
  14. Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
  15. Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118(2021).
  16. Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and 'plugging' of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61(2018).
  17. Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218(2020).
  18. Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
  19. Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373(2021).
  20. Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, Elsevier Inc. (2019).
  21. Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286(2020).
  22. Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
  23. Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58(2015).
  24. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  25. Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
  27. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
  28. Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. 80(2014).
  29. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
  30. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967(2016).
  31. Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
  32. Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
  33. Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300(2010).
  34. Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
  35. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
  36. Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
  37. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  38. Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
  39. Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
  40. Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
  41. Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
  42. Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804(2017).
  43. Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial FunctionSciatic NerveHigh Resolution RespirometryOxygen ConsumptionReactive Oxygen SpeciesSaponin PermeabilizationElectron Transport SystemMitochondrial Complex ActivityATP SynthesisPeripheral Neuropathy

Related Articles