HIV-1 Enfekte İnsanlaştırılmış Farelerde Oral Kombinasyonel Antiretroviral Tedavi

Kronik insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile enfekte bireylerin yaşam beklentisi, kombinasyonel antiretroviral tedavi (cART) ile anlamlı derecede ^{iyileşmiştir1,2}. cART, HIV-1 replikasyonunu başarılı bir şekilde azaltır ve kronik olarak enfekte olmuş katılımcıların çoğunda CD4 + T hücre sayısını normale yükseltir³, bu da genel sağlığın iyileşmesine ve hastalığın ilerlemesini önemli ölçüde azaltmasına neden olur⁴. Bununla birlikte, gizli HIV-1 rezervuarı, akut enfeksiyon sırasında ART başlatıldığında bile kurulur ^5,6,7. Rezervuarlar YÜT sırasında yıllar içinde devam eder ve YÜT kesintisinden sonra hızlı viral geri tepme iyi belgelenmiştir ^8,9. ART üzerinde HIV ile yaşayan insanlar ayrıca kardiyovasküler hastalık, kanser ve nöro bozukluklar gibi daha yüksek komorbidite riskine yatkındır^10,11,12. Bu nedenle, HIV için fonksiyonel bir tedaviye ihtiyaç vardır. HIV-1 enfeksiyonu için hayvan modelleri, yeni HIV tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde ve doğrulanmasında belirgin avantajlar sunmaktadır^13,14,15. İnsanlaştırılmış fareler, küçük bir hayvan modeli olarak, farklı dokularda çok soylu insan bağışıklık hücresi resutansiyonu sağlayabilir, bu da HIV enfeksiyonunun yakından incelenmesine izin verir^16,17,18,19. İnsanlaştırılmış modeller arasında, insanlaştırılmış kemik iliği-karaciğer-timus (BLT) modeli, kronik HIV-1 enfeksiyonunun yanı sıra HIV-1 enfeksiyonuna karşı fonksiyonel insan bağışıklık tepkilerini başarıyla özetler^{20,21,22,23,24}. Bu nedenle, insanlaştırılmış BLT fare modeli, HIV araştırma alanındaki çeşitli yönleri araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. İnsanlaştırılmış BLT fareleri sadece kalıcı HIV-1 enfeksiyonu ve patogenezinin özetlenmesi için iyi kurulmuş modeller değil, aynı zamanda hücre tedavisine dayalı müdahale stratejilerinin değerlendirilmesi için sonuç niteliğinde araçlardır. Mevcut yazarlar ve diğerleri, insanlaştırılmış BLT fareleri modelinin kalıcı HIV-1 enfeksiyonu ve patogenezi^25,26,27'yi özetlediğini ve hücre tedavisine dayalı müdahale stratejilerini değerlendirmek için araçlar sağladığını göstermiştir 28,29,30,31,32,33.

Günlük olarak alınan antiretroviral ilaçların kombinasyonlarından oluşan cART rejimleri, başarılı bir şekilde tedavi edilen bireylerde viral yükün uzun süre³⁴ boyunca tespit edilemediği noktaya kadar HIV-1 replikasyonunu baskılar. HIV ile enfekte olmuş insanlaştırılmış farelerin klinik olarak ilgili cART rejimleriyle tedavi edilmesinin sonuçları, HIV-1 ile enfekte olmuş ART ile tedavi edilen bireylerde gözlenenlere benzemektedir²²: HIV-1 seviyeleri, cART'nin tespit ve kesinti sınırlarının altında bastırılır ve bu da HIV replikasyonunun gizli rezervuardan geri tepmesine neden olur³⁵. Subkutan (SC)27,36,37 veya intraperitoneal (IP)^37,38,39 enjeksiyonu^, insanlaştırılmış farelerde cART tedavisinde yaygın olarak kullanılan yoldur. Bununla birlikte, yoğun günlük enjeksiyon, fiziksel kısıtlama⁴⁰ ile hayvanlara strese neden olur. Ayrıca, keskin nişan kullanırken HIV'e daha fazla maruz kalma nedeniyle araştırmacılar için emek yoğun ve potansiyel olarak güvensizdir. Oral uygulama, HIV-1 ile enfekte olmuş bireyler tarafından alınan cART ilaçlarının emilimini, dağılımını ve atılımını taklit etmek için idealdir. Oral uygulama tipik olarak, antiretroviral ilaçları sterilize edilmiş (farelerin immün yetmezliği nedeniyle gerekli) gıda 24,37,41 veya su^{42,43,44,45,46} içine koymak için özelleştirilmiş ve sıklıkla zahmetli prosedürleri içerir. Birçok antiretroviral ilaçla kimyasal olarak uyumlu olabilir veya olmayabilir veya farelerin kolayca yiyemeyeceği veya içmeyeceği bir şeyle sonuçlanabilir (bu da vücuttaki doz ve ilaç seviyelerini etkiler). Burada önerilen yeni peroral cART uygulama yöntemi, farklı antiretroviral ilaç türleriyle uyumluluğu, güvenliği ve hazırlık ve uygulama kolaylığı ve günlük enjeksiyondan kaynaklanan hayvan stresi ve kaygısının azaltılması nedeniyle önceki doğum girişimlerini aşmaktadır.

Tenofovir disoproksil fumarat (TDF), Elvitegravir (ELV) ve Raltegravir (RAL) zayıf suda çözünür ilaçlardır. İlginç bir şekilde, TDF'nin biyoyararlanımının artması yağlı gıdalarla gözlenir, bu da lipazların yağlı gıdalarla rekabetçi inhibisyonunun TDF⁴⁷ için belirli bir koruma sağlayabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, DietGel Boost bardakları, normal kemirgen chow'una (100 g başına 10 g) ve tipik bir fare yüksek yağlı diyetine (100 g başına 40-60 g) kıyasla, mütevazı yağ içeriğine (100 g başına 20.3 g) dayanarak teslimat yöntemi olarak normal kemirgen chow'unun yerini almak üzere seçilmiştir^. Bir bardağın toplam ağırlığı 75 g'dır; Böylece, her fincan 3 gün boyunca beş fare için yeterli miktarda yiyecek ve dolayısıyla ilaç içerecektir.

Anonimleştirilmiş insan fetal dokusu ticari olarak edinildi. Hayvan araştırmaları, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles ve (UCLA) Hayvan Araştırma Komitesi (ARC) tarafından onaylanan protokollere göre, tüm federal, eyalet ve yerel yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Özellikle, tüm deneyler, UCLA ARC Protokol Numarası 2010-038-02B kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) ve Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Derneği (AALAC) laboratuvar hayvanlarının barınması ve bakımı için önerilere ve kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm ameliyatlar ketamin (100 mg/kg)/ksilazin (5 mg/kg) ve izofluran anestezisi (%2-3 vol) altında yapılmış ve hayvan ağrı ve rahatsızlığını en aza indirmek için tüm çabalar gösterilmiştir.

1. HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış fareler

NOT: İnsanlaştırılmış fareler daha önce ^30,31,49'da açıklandığı gibi inşa edilmiştir. Protokol aşağıda kısaca açıklanmıştır.

1. CD34 + hematopoetik progenitör hücrelerini, üreticinin protokolüne göre anti-CD34 mikroboncukları aracılığıyla insan fetal karaciğerinden arındırın.
2. 6-8 haftalık NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) erkek ve dişi fareleri anestezi altına alın ve ameliyattan önce alt lökal olarak ışınlayın (2.7 Gy).
3. İmplant timus, fetal karaciğer ile aynı donörden türetilen, karaciğer ile birlikte böbrek kapsülünün altında.
4. İmplantasyonu takiben, farelere intravenöz olarak 0.5 milyon ila bir milyon CD34 + hücresi enjekte edin.
5. 8-10 hafta sonra, retro-orbital kanama yoluyla 100 μL fare kanını^{toplayın 50, 5} μL EDTA içeren mikrosantrifüj tüplerine ve 3 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın.
6. Fareye HIV-1 bulaştıktan sonra viral yükü izlemek için plazmayı -80 ° C'de saklayın. 2 mL% 83 NH4C çözeltisi ekleyin ve kırmızı kan hücrelerini lize etmek için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
7. Lizizi durdurmak için% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile 10 mL RPMI ekleyin. 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün.
8. Süper natantı aspire edin. Antikor panelli leke hücreleri (bakınız Malzeme Tablosu) ve insan bağışıklık hücresi engraftmanını kontrol etmek için akış sitometrisi ile analiz edin.
9. Bir insülin şırıngası kullanarak bir^HIV-1 suşunun (yani, NFNSXSL9 30,53,54) en az 200 ng p24'ü ile retro-orbital ven enjeksiyonu ^51,52 ile dolaşımdaki ^CD45 + hücrelerinin%^50'sinden fazlasını sergileyen fareleri enfekte edin. Akış sitometri analizi ve viral yükü ölçmek için iki haftada bir kan toplayın.

2. ART ilaçlarının hazırlanması

1. Bireysel ilaçları tartın; Örneğin, cART ile 10 gıda bardağı yapmak için, bir biyogüvenlik kabinindeki bireysel steril 15 mL santrifüj tüplerine 250 mg FTC (Emtricitabin), 375 mg TDF ve 500 mg RAL veya ELV'yi tartmak için steril hücre kazıyıcıları kullanın.
2. 250 mg FTC tüpüne 1 mL DMSO ekleyin (250 mg / mL'lik son konsantrasyon), 375 mg TDF tüpüne 1.5 mL DMSO ekleyin (250 mg / mL'lik son konsantrasyon) ve 500 mg RAL veya ELV tüpüne 1mL DMSO ekleyin (500 mg / mL'lik son konsantrasyon). İlaç karışımını tamamen çözünene ve berrak bir çözelti elde edilene kadar karıştırın veya pipetleyin.
3. Steril bir şırınga ile çözeltileri sterilize etmek için 0,22 μM gözenek boyutunda hidrofilik PVDF membran filtre kullanın. Bireysel ilaç çözeltileri 12 hafta boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
4. Kullanıma hazır olduğunda, çözelti netleşene kadar her ilaç çözeltisinin bir alikotunu 37 ° C'de taze olarak çözün. Bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
5. Ana karışımı oluşturmak için ilaçları birleştirin ve iyice karıştırın: DMSO'da 1 mL FTC, DMSO'da 1,5 mL TDF ve DMSO'da 1 mL ELV veya RAL.
   NOT: Bu miktar 10 yemek bardağı yapacaktır.
6. Bir DietGel Boost cART fincanı yapmak için bir kaba 350 μL cART master mix solüsyonu ekleyin.
7. Bardağa 0.75 mL Trimetoprim-Sülfametoksazol (0.48 mg / mL nihai konsantrasyon) ekleyin.
8. 1 mL steril pipet uçlarını kullanarak iyice karıştırın.
9. Aliquot orijinal bardaktan cART içeren gıda kabını, gerektiğinde 60 mm'lik bir Petri kabına mikro spatula ile alın. Fare sayısına göre her kafes için cART içeren yiyecek kabı miktarını hesaplamak için yiyeceği bir ölçekte tartın.

3. ART ilaçlarının HIV-1 ile enfekte farelere uygulanması

1. Kafesten düzenli chow'u çıkarın ve cART içeren bir yiyecek kabı ile değiştirin.
   NOT: Ortalama olarak, bir fare günde 5 g'a kadar yiyecek yiyecektir. Yaklaşık bir yiyecek kabı 2 gün boyunca beş fareye uygulanabilir.
2. CART yiyeceklerini haftada üç kez yenileyin.
3. Alımı izlemek için kullanılmış bardakları tartın. Tüketimi doğrulamak için fareleri haftalık olarak tartın.

4. Gerçek zamanlı PCR ile viral yükü izleyin

1. İnsan bağışıklık hücrelerini (CD4 ve CD8 T hücre seviyeleri) ve BLT farelerinde HIV-1 replikasyonunu her 2 haftada bir retro-orbital kanama ile değerlendirin. Adım 1.5-1.8'deki talimatları izleyerek plazma toplayın.
2. 8 hafta boyunca oral cART uygulamasından önce ve sırasında HIV-1 ile enfekte olmuş farelerin plazma viral yüklerini izleyin. Bir viral RNA ekstraksiyon kiti kullanarak plazmadan plazma viral RNA'sını çıkarın ve daha önce tarif edildiği gibi primerleri ve probları kullanarak gerçek zamanlı PCR ile ölçün (bakınız Malzeme Tablosu) 27,30,31. Aşağıdaki döngü protokolünü kullanın: 48 °C (15 dakika), 95 °C (10 dakika), ardından 45 döngü için 95 °C (15 sn), 60 °C (1 dakika) bisiklet kullanın.

5. CD4 / CD8 oranlarını akış sitometrisi ile değerlendirin

1. 1.5-1.8 adımlarını izleyerek iki haftada bir kanamaların periferik kanından tek hücreli süspansiyonlar hazırlayın.
2. Yüzey belirteçleri ile leke hücreleri ve akış sitometrisi ile analiz edilir. Akış sitometrisinde aşağıdaki yüzey işaretleyici antikorları 27,30,43,49'u kullanın: CD45 (klon HI30), CD8 (klon SK1), CD3 (klon ^OKT3), CD4 (klon RPA-T4)^27,30,42,49.

25 g ağırlığındaki ortalama bir farenin günde 4 g yiyecek tükettiğini varsayarsak, oral alım yoluyla günlük ilaç dozu 2.88 mg / kg TFV, 83 mg / kg FTC ve 768 mg / kg RAL'ye karşılık gelir. Optimize edilmiş gıda rejiminin toksik olup olmadığını ve günlük cART enjeksiyonuna kıyasla genel sağlığı etkileyip etkilemediğini test etmek için, farelerin ağırlığı, oral veya deri altı enjeksiyon yoluyla cART'den önce ve sırasında haftalık olarak izlendi. Her grupta cART uygulamasından önce anlamlı ağırlık farkı yoktu (Şekil 1). Bununla birlikte, günlük cART SC enjeksiyonu sırasında fare ağırlığı sürekli olarak azalmıştır. Buna karşılık, DietGel'deki FTC / TDF / ELV veya FTC / TDF / RAL, 5 haftalık oral cART uygulamasından sonra fare ağırlıklarını ART öncesi başlangıç seviyelerine geri yükledi. Ek olarak, Raltegravir veya Elvitegravir grupları arasında anlamlı bir ağırlık değişikliği gözlenmedi.

Oral cART uygulamasının viral yükü günlük enjeksiyon kadar etkili bir şekilde baskılayıp baskılamadığını test etmek için, iki haftada bir plazma viral yükleri RT-PCR kullanılarak değerlendirildi. Şekil 2 , FTC / TDF / ELV ART gıda rejiminin% 100 viral replikasyonu 4 hafta içinde tespit edilemeyen seviyelere etkili bir şekilde bastırdığını göstermektedir; FTC / TDF / RAL ART gıda rejimi, farelerin% 80'ini 4 hafta içinde tespit edilemeyen seviyelere baskılayabilirken, SC enjeksiyonu alan farelerin sadece% 70'i 4 haftalık tedaviden sonra tespit edilemeyen seviyelere ulaştı. Sonuçlar, oral uygulamanın viral replikasyonu SC enjeksiyonundan daha hızlı ve daha verimli bir şekilde baskıladığını göstermiştir. Ayrıca, cART gıda rejimi, SC günlük enjeksiyonundan önce periferik kandaki CD4 / CD8 oranlarının daha da düşmesini önledi (Şekil 3). Bu sonuçlar, önerilen oral cART rejiminin, plazma viremisini tespit seviyesinin altında başarılı bir şekilde baskılayabileceğini, CD4 T hücre seviyelerini hızla geri yükleyebileceğini ve HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış farelerde hayvanların genel sağlığını iyileştirebileceğini göstermiştir.

Şekil 1: Farklı gruplarda HIV-1 enfeksiyonundan sonra cART tedavisi öncesi ve sırasında fare vücut ağırlığı değişir. İnsanlaştırılmış fareler, bağışıklık resusyonundan sonra HIVNFNSXSL9 ile enfekte oldu. 4 haftalık HIV-1 enfeksiyonundan sonra, fareler ya subkutan (SC) enjeksiyon yoluyla FTC / TDF / RAL rejimi ile 7.5 hafta daha tedavi edildi ya da FTC / TDF / RAL veya FTC / TDF / ELV'nin oral yoldan uygulanmasıyla tedavi edildi. Fare vücut ağırlıkları HIV enfeksiyonundan 1 hafta önce ölçüldü. Tüm istatistiksel karşılaştırmalar Mann-Whitney testi, raporlama grubu ortalaması (± S.E.) kullanılarak yapıldı. Yeşil yıldız yıldızları FTC/TDF/ELV gıda oral grubu ile FTC/TDF/RAL SC enjeksiyon grubu arasında istatistiksel farklılıklar göstermektedir. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P 0,001'<. n=6-7 her grupta. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Gıda oral cART uygulaması daha hızlı viral baskılanma gösterir. Şekil 1'de açıklandığı gibi, fareler ya tedavi edilmedi ya da deri altı enjeksiyonu yoluyla FTC / TDF / RAL rejimi ile tedavi edildi ve 7.5 hafta boyunca gıda kabı mock, FTC / TDF / RAL veya FTC / TDF / ELV gıda rejimlerinin oral yoldan uygulanması yoluyla tedavi edildi. (A) Farklı gruplarda HIV-1 enfeksiyonundan sonra zamanla plazma viral yükü. (B

SK, CDR3 Inc.'in kurucusudur. Geri kalan yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.