Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu

Burada, DNA'yı PCR tabanlı uygulamalar için erişilebilir kılmak amacıyla Caenorhabditis elegans'ın lizisi için iki ilgili protokol sunulmuştur. PCR, diğerlerinin yanı sıra klonlama ve dizileme için DNA fragmanlarının genotiplenmesi ve çoğaltılması da dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılan yaygın olarak kullanılan bir moleküler tekniktir. Küçük (1 mm), serbest yaşayan yuvarlak kurt C. elegans, biyolojik araştırmalar için popüler bir hayvan sistemidir. Tek bir hayvandan veya birkaç hayvandan uygun genomik DNA elde etmek, diziyi PCR ile yükseltmek için yeterlidir. Geç L4 larvaları ve yetişkinleri, utero 1'de sadece ~ 1.000 somatik hücre (bazı çoklu nükleer, poliploid hücreler dahil), germ hücreleri ve (hayvan gravid bir hermafrodit ise) yavru ^içerir. Bununla birlikte, bu hayvanlar genomik DNA^2'yi çıkarmak için bozulması gereken bir kütikül ile korunmaktadır. PCR için nematod genomik DNA şablonu hazırlamak için standart yöntemler birden fazla adım içerir ve birkaç saat sürer. Hayvanlar ilk önce proteinaz K (-70 ° C veya altı) içeren solucan lizis tamponunda en az 15-45 dakika (bazı protokoller tarafından daha uzun süre tavsiye edilir) ^3,4,5,6 dondurulur. Bu adım hayvanları açar.

Dondurulduktan sonra, proteinleraz K'nın çalışması için hayvanlar 60-65 ° C'de 1 saat inkübe edilir, daha sonra enzim 95 ° C'de 15-30 dakika boyunca inaktive edilir. Proteinaz K, DNA'yı bozan nükleazları yok eder. PCR'den önce proteinaz K'nın inaktivasyonu, proteinaz K'nın DNA polimerazı bozmasını önlemek için önemlidir. Burada açıklanan iki kit tabanlı protokol, günlük araştırma ve öğretim laboratuar uygulamaları için tek bir hayvandan veya birkaç nematoddan genomik DNA'yı çıkarmak için hızlı, güvenilir ve uygun maliyetli yöntemlerdir. Kullanılan kit başlangıçta üretici tarafından hayvan dokusundan, tükürükten ve saçtan DNA çıkarmak için optimize edildi⁷. Hücreleri lize etmek ve genomik DNA'yı erişilebilir kılmak için tescilli bir doku hazırlama çözeltisi ve ekstraksiyon çözeltisi kullanır. Tescilli bir nötralizasyon çözeltisi daha sonra PCR'yi inhibe edebilecek bileşenleri nötralize eder (örneğin, tuzlar, iyonlar ve Mg^{2 +} bağlayıcı moleküller).

Genotipleme yaparken, tek bir hayvan test edilebilir. Bir suşun homozigot olup olmadığını belirlerken, tek bir hayvandan altı veya daha fazla yavruyu test etmek, bir çizginin homozigot olup olmadığına dair yüksek güven verir (heterozigot bir ebeveynden altı homozigot mutant soyunun rastgele seçilme şansı% 0.02'dir [(1/4)⁶ ×% 100 =% 0.02]). Bu yöntem 1) proteinaz K yönteminden daha az adımla basittir ve 2) şablon hazırlama süresini 15 dakikaya düşürür. Bu çalışmadaki sonuçlar, geliştirilen protokolün, PCR de dahil olmak üzere yüksek oranda saflaştırılmış DNA gerektirmeyen aşağı akış uygulamaları için güvenilir bir şekilde kullanılabilen tek veya birkaç solucandan genomik DNA'nın çıkarılmasında sağlam bir şekilde çalıştığını göstermektedir.

1. C. elegans bakımı

NOT: N2 (vahşi tip) ve blmp-1 (tm548) C. elegans suşları standart nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları üzerinde 20 °C'de tutulmuştur.

1. 23.005 g NGM tozunu 973 mL su içinde 2 L'lik bir şişede çözerek NGM plakalarını hazırlayın. Şişe açıklığını alüminyum folyo (veya havalandırmaya izin veren otoklavlanabilir kapak) ile örtün ve kaplamayı otoklav bantla sabitleyin. Tozu çözmek ve içeriği en az 30 dakikalık bir sterilizasyon döngüsü ile sterilize etmek için otoklav.
2. Ortamı bir su banyosunda 60 ° C'ye soğutun.
3. Soğutulmuş ortama 25 mL steril 1 M fosfat (KH₂PO₄) tamponu, pH 6.0 ekleyin; 1 mL 1 M kalsiyum klorür çözeltisi; ve 1 mL 1 M magnezyum sülfat çözeltisi.
4. Homojen bir karışım elde etmek ve düzensiz soğutma ve katılaşma (~ 5 dakika) önlemek için ortamı manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın. Karıştırma çubuğunun bir vorteks oluşturacak kadar hızlı döndüğünden, ancak kabarcıkların ortaya çıkacağı kadar hızlı olmadığından emin olun (~ 250-300 rpm).
5. Her 10 cm'lik Petri plakasına (toplamda ~ 40 plaka) ortamın ~25 mL'sini dökün. Plakaları gece boyunca oda sıcaklığında (tipik olarak 16-25 ° C) kurulayın.
6. Bir Escherichia coli OP50 kolonisini 37 ° C'de gece boyunca 30-50 mL LB suyunda büyütün.
7. Her plakayı 500 μL E. coli OP50 kültürü ile tohumlayın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında kurumasını bekleyin (tipik olarak 16-25 ° C)⁸. Plakaları 4 ° C'de 3 haftaya kadar saklayın.
8. C. elegans'ı bir tel toplama veya başka bir yöntem kullanarak tohumlanmış plakalara aktarın ve suş için gereken sıcaklıkta L4 veya yetişkin aşamasına büyümelerine izin verin (tipik olarak 16-25 ° C, hayvanlar dauer olarak aç bırakılmışsa 1-2 gün, hayvanlar embriyo olarak kaplanmışsa 3-4 gün)⁸.

2. Tek solucanlı DNA ekstraksiyonu

NOT: Bu yöntem, DNA'yı tek bir solucandan (toplam hacmin 1,8 μL'sinde bir solucan) çıkarmak için kullanışlıdır. Aynı anda birden fazla solucan lize edilecekse bir ana karışım yapılabilir.

1. Bir termosikler, 10 dakika boyunca 55 ° C'de bir döngü için programlayın, ardından 3 dakika boyunca 95 ° C (lizis programı).
2. Aliquot 0.8 μL ekstraksiyon çözeltisinin kitinden buz üzerindeki 0.2 mL'lik bir PCR tüpünün iç duvarına kadar. Kitten ekstraksiyon çözeltisinin damlacığına 0.2 μL doku hazırlama çözeltisi ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
3. Diseksiyon mikroskobu altında bir L4 veya yetişkin hayvanı tanımlayın⁹. L4 hermafroditlerini tanımlamak için, hayvanın ortasında soluk bir yarım daire olarak görülebilen karakteristik bir vulva arayın. Yetişkin hermafroditleri, uteruslarında görülebilen oval embriyolara sahip olabilecek plakadaki en büyük hayvanları arayarak tanımlayın.
4. Bir platin tel çekme kullanarak, seçilen hayvanı çözelti^10'a aktarın.
5. Borunun altındaki içeriği toplamak için tüpü oda sıcaklığında kısaca (2-3 sn, ≤6.000 rpm / 2.000 × g) santrifüj yapın.
6. Tüpü termosikler içine yerleştirin ve Adım 2.1'de ayarlanmış lizis programını çalıştırın.
7. Program tamamlandığında, tüpü kısaca santrifüj edin ve buzun üzerine yerleştirin. Kitten karışıma nötralizasyon çözeltisinin 0.8 μL'sini ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
8. Tüpü oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj yapın (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
9. Lisatı PCR için doğrudan kullanın veya ileride kullanmak üzere 4 °C veya -20 °C'de saklayın.
   NOT: Ekstrakte edilen DNA, en az 6 ay boyunca 4 °C veya -20 °C'de stabildir⁷.

3. Birkaç kişinin DNA ekstraksiyonu

NOT: Bu yöntem, birkaç solucandan DNA çıkarmak için kullanışlıdır. Aynı anda birden fazla suş lize edilecekse bir ana karışım hazırlanabilir.

1. Termosikler'i 10 dakika boyunca 55 ° C'de bir döngü için programlayın, ardından 3 dakika boyunca 95 ° C (lizis programı).
2. Aliquot 2.0 μL ekstraksiyon çözeltisinin kitinden buz üzerindeki 0.2 mL'lik bir PCR tüpünün iç duvarına kadar. Kitten ekstraksiyon çözeltisinin damlacığına 0.5 μL doku hazırlama çözeltisi ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
3. L4 veya yetişkin hayvanları diseksiyon mikroskobu altında tanımlayın⁹. L4 hermafroditleri, hayvanın ortasında soluk bir yarım daire olarak görülebilen karakteristik bir vulvaya sahiptir. Yetişkin hermafroditler plakadaki en büyük hayvanlardır ve uteruslarında görülebilen oval embriyolara sahip olabilirler.
4. Bir platin tel toplama kullanarak, birkaç hayvanı çözeltiye aktarın: 9 hayvan, 0.5 μL lizat başına 1 hayvan eşdeğeri genomik DNA verir ve 16 hayvan, 0.25 μL'de (3.5 nematod / μL) ^{10'da ~ 1} hayvan eşdeğeri genomik DNA verir.
   NOT: Bu hacme 16'dan fazla hayvan aktarmak zordur.
5. Tüpü oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj yapın (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
6. Tüpü termosikler içine yerleştirin ve Adım 3.1'de ayarlanmış lizis programını çalıştırın.
7. Program tamamlandığında, tüpü kısaca santrifüj edin ve buzun üzerine yerleştirin. Kitten karışıma nötralizasyon çözeltisinden 2 μL ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
8. Tüpü oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj yapın (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
9. PCR için lizizi doğrudan kullanın veya ileride kullanmak üzere 4 °C veya -20 °C'de saklayın.
   NOT: Ekstrakte edilen DNA, en az 6 ay boyunca 4 °C veya -20 °C'de stabildir⁷.

4. PCR reaksiyonu

NOT: Bu solucan lizis tekniğinin, hızlı bir polimeraz kullanarak bir delesyon mutasyonunu tespit eden bir aşağı akış uygulaması açıklanmaktadır. İki solucan lizis protokolünün, reaksiyon başına bir solucanın 1 /^50'sine kadar seyreltmelerde başarılı PCR için genomik şablon DNA üretmedeki etkinliği de gösterilmiştir.

1. Yukarıda Adım 2 ve Adım 3'te açıklandığı gibi, vahşi tip N2 ve mutant suşlar kullanarak tek bir solucandan ve 16 solucandan DNA çıkarın.
2. Vahşi tip N2 hayvanlarından tek solucanlı DNA'nın 2, 10, 20 ve 50 kat seyreltilmesini hazırlayın.
3. İlgilenilen sıraya özgü primerler ve hot-start PCR ana karışımı kullanarak üreticinin protokolünü izleyerek PCR reaksiyonlarını ayarlayın (Tablo 1 ve Tablo 2). Her reaksiyonda şablon olarak 1 μL seyreltilmemiş DNA veya 2 μL seyreltilmiş DNA kullanın.
4. PCR ürünlerini jel elektroforezi ve görüntüleme¹¹ ile onaylayın.

Tek veya birkaç vahşi tip yetişkinden genomik DNA, bu iki yöntemin etkinliğini karşılaştırmak için ticari kit veya geleneksel lizis protokolü kullanılarak ekstrakte edildi. Bu lizatlar daha sonra PCR'nin ~ 2.100 bp'lik daha büyük bir hedefi (blmp-1'i kodlama) veya ~ 500 bp'lik daha küçük bir hedefi (sma-10'un bir bölümünü kodlama) yükseltmesi için şablonlar olarak kullanıldı. Her iki yöntem de uygun PCR ürünlerini başarıyla vermiştir (Şekil 1A).

Daha sonra, kit ekstrakte edilmiş genomik DNA'nın çeşitli DNA polimerazları için şablon olarak hizmet etme kabiliyeti gösterilmiştir. Ekstrakte edilen genomik DNA, farklı yeteneklere (hız, doğruluk ve ürün boyutu dahil) sahip dört polimeraz kullanarak 0.5 kb'lik bir ürünü yükseltmek için şablon olarak kullanıldı. Beklenen boyutlardaki ürünler, bu polimerazlar tarafından tek yetişkin lizis veya dokuz yetişkin lizisten şablon kullanılarak üretildi (Şekil 1B). Şablon dizisini doğru bir şekilde yükseltmek için PCR polimerazlarının şablon dizisi ve doğruluğu sıralama ile doğrulanabilir (Ek Şekil S1). Bu sonuç, kit protokollerinden ekstrakte edilen genomik DNA'nın bir dizi polimeraz için uygun bir şablon sağladığını göstermektedir.

PCR etkinliği, ticari kit kullanılarak tek bir hayvandan ekstrakte edilen genomik DNA'nın farklı konsantrasyonları kullanılarak test edildi. DNA 2-, 10-, 20- veya 50-kat ile seyreltildi ve reaksiyon başına bir solucanın yaklaşık yarısına, onda, yirmide birine ve ellide birine eşdeğer PCR'ler için kullanıldı. Bu DNA şablonu konsantrasyonları, ~2.1 kb'lik daha büyük bir hedefin veya ~0.5 kb'lik daha küçük bir hedefin amplifikasyonunu destekledi (Şekil 1C)12. 0.5 kb PCR ürününün DNA konsantrasyonuna bağlı bir verimi gözlenirken, 2.1 kb PCR ürün verimi tüm reaksiyonlarda eşdeğer görünüyordu.

Bu protokollerin PCR genotiplemesi için uygun olan C. elegans'tan genomik DNA ürettiğini göstermek için, genomik DNA, tek ve 16 vahşi tip ve blmp-1 fonksiyon kaybı mutantlarından (blmp-1 (tm548)) çıkarıldı. Blmp-1 geni, distal uç hücre göçünde, vücut büyüklüğünde ve gelişiminde önemli rolleri olan bir transkripsiyon faktörünü kodlar 12,13,14,15,16. Blmp-1 mutant, ekzon 3 ve intron 3 15'in parçalarını çıkaran810 bp'lik bir delesyona sahiptir. Primerler, vahşi tip DNA şablonu kullanıldığında 2.134 bp ürünle ve blmp-1 (-) DNA kullanıldığında 1.324 bp ürünle sonuçlanacak şekilde tasarlanmıştır. Uygun boyutlardaki PCR ürünleri, 1 μL tek solucan (reaksiyon başına yaklaşık 0.5 solucan) veya L4 evreli hayvanlardan 16 solucan lizisi (reaksiyon başına 3.5 solucan) kullanılarak tespit edildi (Şekil 1D). Bu sonuç, her iki protokolü de kullanarak kit ekstrakte edilmiş genomik DNA'nın, PCR'den genotip çizgilerine eşit derecede etkili şablonlar sağladığını göstermektedir.

Bu sonuçlar, tek ve çoklu hayvanlardan ticari bir doku DNA ekstraksiyon kiti kullanan C. elegans genomik DNA preparatlarının PCR için şablon olarak güvenilir bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir.

Şekil 1: Tek nematodlardan ve çoklu nematodlardan ticari bir kit kullanılarak DNA preparatları, PCR ile sağlam amplifikasyona izin verir. PCR ürünleri, 1x TAE tamponunda (5 μL (A, B) veya 10 μL (C,D) içinde% 1 agaroz jeli üzerine yüklendi ve 30 dakika ila 2 saat boyunca 90-100 V'ta çalıştırıldı. Tüm jeller için 2 log'luk bir DNA merdiveni kullanıldı. (A) İki primer seti kullanarak şablon oluşturmak için kit ile DNA lizisinin geleneksel proteinaz K yöntemleriyle karşılaştırılması. Vahşi tip yetişkinler lize edildi ve bir hayvanın eşdeğeri tüm reaksiyonlar için şablon olarak kullanıldı. Şeritler 1-4, 2.1 kb ürün. Şerit 1, proteinaz K. Şerit 2 ile tek solucan lizisinden PCR, kit yöntemi ile tek solucanlı lizisten PCR. Şerit 3, proteinaz K. Lane 4 ile dokuz solucan solucan lizisinden PCR, kit yöntemi ile dokuz solucan solucan lizisinden PCR. Şeritler 5-8, 0.5 kb ürün. Şerit 5, proteinaz K. Lane 6 ile tek solucanlı lizisten PCR, kit yöntemiyle tek solucanlı lizisten PCR. Şerit 7, proteinaz K. Lane 8 ile dokuz solucan solucan lizisinden PCR, kit yöntemi ile dokuz solucan solucan lizisinden PCR. (B) DNA lizisi için kit yöntemi, çoklu polimerazlar tarafından PCR için uygun bir şablon sağlar. Vahşi tip yetişkinler kit yöntemi kullanılarak lize edildi ve bir hayvanın yarısına eşdeğeri 0.5 kb'lik bir ürün için PCR şablonu olarak kullanıldı. Polimeraz ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın. Şerit 1, yüksek hızlı polimeraz ile tek solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 2, yüksek hızlı polimeraz ile dokuz solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 3, bir Taq polimeraz ile tek solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 4, bir Taq polimeraz ile dokuz solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 5, yüksek doğrulukta polimeraz içeren tek solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 6, yüksek doğruluklu polimeraz içeren dokuz solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 7, yüksek hızlı, yüksek doğruluklu polimeraz içeren tek solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 8, yüksek hızlı, yüksek doğruluklu polimeraz ile dokuz solucanlı bir lizisten PCR. (C) Bir vahşi tip L4 solucan lizisinin seyreltilmesi, PCR için şablon sağlar. Şeritler 1-5, 2.1 kb ürün. 6-10 arası şeritler, 0,5 kb hedefi. Şerit 1 ve şerit 6, seyreltilmemiş DNA. Şerit 2 ve şerit 7, 2 kat seyreltilmiş DNA. Şerit 3 ve şerit 8, 10 kat seyreltilmiş DNA. Şerit 4 ve şerit 9, 20 kat seyreltilmiş DNA. Şerit 5 ve şerit 10, 50 kat seyreltilmiş DNA. (D) Blmp-1 lokusunun PCR ile 1 μL tek ve 16 solucanlı DNA preparatlarını şablon olarak kullanarak genotipleştirilmesi. Şerit 1, vahşi tip tek solucanlı lizisten PCR. Şerit 2, blmp-1 (-) tek solucanlı lizisten PCR. Şerit 3, vahşi tip 16 solucanlı lizisten PCR. Şerit 4, blmp-1 (-) 16 solucanlı lizisten PCR. Kısaltmalar: prep = hazırlama yöntemi; kb = kilobaz; st. = nematod aşaması; dil. = DNA'nın seyreltilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Astarların listesi.

Tablo 2: PCR reaksiyonu bileşenleri.

Ek Şekil S1: Ticari bir kit ile hazırlanan genomik DNA'nın kalitesinin doğrulanması için dizileme. İki dizileme reaksiyonundan elde edilen sonuçlar, 16 solucanlı bir lizisten yüksek hızlı, yüksek doğruluklu bir polimeraz (Pol E) ile güçlendirilmiş 1.600'den fazla DNA nükleotidinin beklenen dizisiyle tamamen eşleşmektedir (Tablo 1, Tablo 2A ve Tablo 2D). Sıralama okuma uçları, düşük kaliteli temel okumaları kaldırmak için kesildi. Hizalama, EMBL-EBI çoklu dizi hizalama aracı MUSCLE (Log-Beklenti ile MUltiple Dizi Karşılaştırması)17 kullanılarak gerçekleştirildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.