Burada, Caenorhabditis elegans genomik DNA'sının ticari olarak temin edilebilen bir doku kiti kullanılarak bir veya birkaç hayvandan basit ve nispeten hızlı bir şekilde izole edilmesinin bir açıklaması sunulmaktadır. Elde edilen gDNA preparatı PCR için uygun bir şablondur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Tek veya birkaç Caenorhabditis elegans'tan genomik DNA ekstraksiyonu, genotipleme hatları, klonlama ve dizileme için PCR dahil olmak üzere birçok aşağı akış uygulamasına sahiptir. C. elegans'tan genomik DNA ekstraksiyonu için geleneksel proteinaz K bazlı yöntemler birkaç saat sürer. C. elegans kütikülünü etkili bir şekilde açan ve genomik DNA'yı çıkaran ticari ekstraksiyon kitleri sınırlıdır. Sınıf ve araştırma uygulamaları için iyi çalışan C. elegans genomik DNA'sını çıkarmak için kolay, daha hızlı (~ 15 dakika) ve uygun maliyetli bir yöntem burada bildirilmiştir. Bu DNA ekstraksiyon yöntemi, PCR gerçekleştirmek için güvenilir bir şablon elde etmek için başlangıç materyali olarak tek veya birkaç geç larva (L4) veya yetişkin nematodları kullanmak üzere optimize edilmiştir. Sonuçlar, DNA kalitesinin, farklı boyutlardaki gen hedeflerini PCR ile yükseltmek için uygun olduğunu ve reaksiyon başına tek bir yetişkinden genomik DNA'nın ellide birine kadar seyreltmelerde bile tek veya birkaç hayvanın genotiplenmesine izin verdiğini göstermektedir. Bildirilen protokoller, PCR tabanlı uygulamalar için tek veya küçük bir C. elegans örneğinden DNA şablonunu hızlı bir şekilde üretmek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir.
Giriş
Burada, DNA'yı PCR tabanlı uygulamalar için erişilebilir kılmak amacıyla Caenorhabditis elegans'ın lizisi için iki ilgili protokol sunulmuştur. PCR, diğerlerinin yanı sıra klonlama ve dizileme için DNA fragmanlarının genotiplenmesi ve çoğaltılması da dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılan yaygın olarak kullanılan bir moleküler tekniktir. Küçük (1 mm), serbest yaşayan yuvarlak kurt C. elegans, biyolojik araştırmalar için popüler bir hayvan sistemidir. Tek bir hayvandan veya birkaç hayvandan uygun genomik DNA elde etmek, diziyi PCR ile yükseltmek için yeterlidir. Geç L4 larvaları ve yetişkinleri, utero 1'de sad....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. C. elegans bakımı
NOT: N2 (vahşi tip) ve blmp-1 (tm548) C. elegans suşları standart nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları üzerinde 20 °C'de tutulmuştur.
- 23.005 g NGM tozunu 973 mL su içinde 2 L'lik bir şişede çözerek NGM plakalarını hazırlayın. Şişe açıklığını alüminyum folyo (veya havalandırmaya izin veren otoklavlanabilir kapak) ile örtün ve kaplamayı otoklav bantla sabitleyin. Tozu çözmek ve içeriği en az 30 dakikalık bir sterilizasyon döngüsü ile sterilize etmek için otoklav.
- Ortamı bir su banyosunda 60 ° C'ye soğutun.
- Soğutulmuş ortama 25 mL steril 1 M fosfat (KH2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tek veya birkaç vahşi tip yetişkinden genomik DNA, bu iki yöntemin etkinliğini karşılaştırmak için ticari kit veya geleneksel lizis protokolü kullanılarak ekstrakte edildi. Bu lizatlar daha sonra PCR'nin ~ 2.100 bp'lik daha büyük bir hedefi (blmp-1'i kodlama) veya ~ 500 bp'lik daha küçük bir hedefi (sma-10'un bir bölümünü kodlama) yükseltmesi için şablonlar olarak kullanıldı. Her iki yöntem de uygun PCR ürünlerini başarıyla vermiştir (Şekil 1A).
.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
C. elegans'ın genotiplerini belirlemek, yeni C. elegans suşları oluşturmak için genetik haçlar gerçekleştirirken önemli bir adımdır. Tek veya birkaç C. elegans kullanılarak genomik DNA ekstraksiyonu, C. elegans'ın genotiplendirilmesinde çok önemli bir adımdır. Bu protokol, ticari bir kit kullanarak C. elegans'tan genomik DNA ekstraksiyonunu tanımlar. Bu yöntem hızlıdır ve sağlam çalışır. Bu yöntem kullanılarak ekstrakte edilen genomik DNA, genotipleme, dizileme ve klonlama da.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
N2 suşu ve E. coli OP50 bakterileri, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden (CGC) elde edildi. Blmp-1 (tm548) suşu Japonya Ulusal Biyokaynak Projesi'nden elde edildi. Yazarlar WormBase'e teşekkür ediyor. Bu çalışma NIH R01GM097591 tarafından T.L.G.'ye, Texas Woman's University tarafından T.L.G.'ye ve TWU'nun Öğrenci Araştırma Merkezi'nin M.F.L.'ye sağladığı iç finansman tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| otoklav bandı | Defend | 43237-2 | |
| alüminyum folyo, ağır hizmet tipi | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| kalsiyum klorür | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kiti (Doku Hazırlama Solüsyonu, Ekstraksiyon Solüsyonu ve Nötralizasyon Solüsyonu içerir) | Sigma-Aldrich Co. | LLC XNAT2-1KT | |
| Isotemp ocak gözü/karıştırıcı | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB ortamı, Lennox, kapsüller | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnezyum sülfat, %97 saf, susuz | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| mikrosantrifüj | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Sıcak Başlangıç Yüksek Kaliteli DNA polimeraz | New England Biolabs, Inc. | Ek Şekil S1'de kullanılan M0515S | "Pol E", yüksek hızlı, yüksek kaliteli bir polimeraz (20– 30 s/kb) |
| NGM medya tozu | ABD Biyolojik Yaşam Bilimleri | N1000 | |
| Phusion HF Tamponlu Yüksek Kaliteli PCR Master Karışımı | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D", yüksek hızlı, yüksek kaliteli bir polimeraz (15– 30 s/kb) |
| primerler | Entegre DNA Teknolojileri | özel DNA oligoları | |
| PrimeSTAR GXL polimeraz | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C", GC açısından zengin şablonlar ve 30 kb'ye kadar şablonlar için yüksek kaliteli bir polimeraz (1 dk/kb) |
| Hızlı Yüklemeli Mor 2 günlük DNA Merdiveni (0.1– 10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Hızlı PCR Master Karışımı | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A", Şekil 1A, C, D'de kullanılan polimeraz, 5 kb'ye kadar hedefler için yüksek hızlı bir polimeraz (10 s/kb) |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaksiyon karışımı | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B", 7 kb'ye kadar olan hedefler için bir polimeraz (1 dk/kb) |
| SimpliAmp termal döngüleyici | Applied Biosystems | A24812 | |
| karıştırma çubuğu | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| girdap karıştırıcı | Fisher Scientific | 2215365 | |
| solucan toplama | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Kaynaklar
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
