Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bağırsak Bölgesine Özgü İşlevselliği Modellemek için İnsan Organoidlerini ve Çip Üzerinde Organ Teknolojisini Birleştirme

26K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63724

⸱

5 Mayıs 2022

 ,  ,  ,  , 
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Biyopsi kaynaklı intestinal organoidler ve çip üzerinde organ teknolojileri, bölgeye özgü bağırsak işlevselliğini özetlemek için mikrofizyolojik bir platformda birleştirilir.

Özet

Bağırsak mukozası, sayısız önemli işlevi yerine getiren karmaşık bir fiziksel ve biyokimyasal bariyerdir. Besin maddelerinin ve ksenobiyotiklerin taşınmasını, emilimini ve metabolizmasını sağlarken, mikrobiyota ile simbiyotik bir ilişkiyi kolaylaştırır ve mikroorganizmaların istilasını kısıtlar. Çeşitli hücre tipleri ile fiziksel ve biyokimyasal ortamları arasındaki fonksiyonel etkileşim, bağırsak dokusu homeostazını kurmak ve sürdürmek için hayati öneme sahiptir. Bu karmaşık etkileşimlerin ve entegre bağırsak fizyolojisinin in vitro olarak modellenmesi, yeni terapötik hedeflerin ve ilaç adaylarının keşfedilme ve geliştirilme şeklini dönüştürme potansiyeline sahip zorlu bir hedeftir.

Organoidler ve Organ-on-a-Chip teknolojileri, yakın zamanda, bağırsak fizyolojisinin ve patofizyolojisinin in vitro fonksiyonel yönlerini incelemek için uygun insanla ilgili bağırsak çipleri üretmek için birleştirilmiştir. Küçük (duodenum) ve kalın bağırsağın biyopsilerinden elde edilen organoidler, bir organ çipinin üst bölmesine ekilir ve daha sonra her bağırsak bölgesinin farklı hücresel, moleküler ve fonksiyonel özelliklerini korurken tek katmanlı olarak başarıyla genişler. İnsan bağırsak dokusuna özgü mikrovasküler endotel hücreleri, epitelyal-endotel arayüzünü yeniden oluşturmak için organ çipinin alt bölmesine dahil edilir. Bu yeni platform, besinlere, ilaçlara ve mikroorganizmalara luminal maruziyeti kolaylaştırarak bağırsak taşınması, geçirgenlik ve konakçı-mikrop etkileşimleri üzerine çalışmalara olanak tanır.

Burada, insan duodenum (duodenum çipi) ve kolon (kolon çipi) temsil eden bağırsak yongalarının ve bunların sürekli akış ve peristalsis benzeri deformasyonlar altında müteakip kültürlerinin oluşturulması için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Prototipik indükleyiciler ve substratlar kullanarak duodenum çipinde ilaç metabolizmasını ve CYP3A4 indüksiyonunu değerlendirmek için yöntemler gösteriyoruz. Son olarak, bir kolon çipinde interferon gama (IFNγ) aracılı bariyer bozulmasının (sızdıran bağırsak sendromu) in vitro modellenmesi için, parasellüler geçirgenliğin değişimini, sitokin sekresyonundaki değişiklikleri ve çip içindeki hücrelerin transkriptomik profillemesini değerlendirme yöntemleri de dahil olmak üzere adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Giriş

İnsan bağırsağı, kendini yenileyebilen karmaşık ve çok görevli bir organdır. İnce ve kalın bağırsağa ayrılır. İnce bağırsağın birincil işlevi, mideden gelen yiyecekleri daha fazla sindirmek, tüm besinleri emmek ve kalıntıyı suyu ve elektrolitleri geri kazandıran kalın bağırsağa geçirmektir. İnce bağırsak ayrıca anatomik olarak farklı bölgelere ayrılır: duodenum, jejunum ve ileum, her biri belirli işlevleri yerine getirmek için uyarlanmıştır. Örneğin, duodenum, jejunumdaki proteinleri, karbonhidratları, vitaminleri ve mineralleri içeren besinlerin uygun şekilde emilimini sağlamak için kekiğin (mide içeriği) parçalanmasına yardımcı olur. İnce bağırsağın bu proksimal kısmı aynı zamanda bağırsak ilaç emilimi ve metabolizmasının ana bölgesidir ve ilam ve kolon1'deki ekspresyonlarına kıyasla ilaç metabolize edici enzimlerin (örneğin, CYP3A4) daha yüksek ekspresyonu ile karakterizedir. Besinlerin sindirilmesi ve emilmesindeki ana rolüne ek olarak, bağırsak ayrıca patojenik mikroorganizmalar, mikrobiyal metabolitler, diyet antijenleri ve toksinler gibi potansiyel olarak zararlı luminal içeriklere karşı etkili bir bariyerdir 2,3. İnsan kolonunun, insan vücudundaki toplam hücrelerinkinden çok daha fazla, beslenme, metabolizma ve bağışıklığa birçok fayda sağlayan çok sayıda mikroorganizma tarafından yaşadığı dikkat çekicidir. Bu nedenle, bağırsak epitel hücreleri tarafından oluşturulan mukozal bariyerin bütünlüğünün korunması, bağırsak mikrobiyotası ile konakçı hücreler arasındaki simbiyotik ilişkinin, gereksiz immün hücre aktivasyonunu önlemek için fiziksel olarak ayrılarak izin vermesi açısından kritik öneme sahiptir2. Ek olarak, programlanmış bağırsak hücresi ölümü, enfekte hücrelerin devam etmesini veya çoğalmasını önleyen kendi kendini koruyucu bir mekanizma olarak önemli bir rol oynar - böylece potansiyel patojenleri yayar3 - bağırsak epitelinin her dört ila yedi günde bir sürekli kendini yenilemesi, bariyer bütünlüğünü ve doku homeostazını sağlayan hücre kaybını telafi eder. Besin emilimi, bariyer bütünlüğü veya bağırsak hücresi ölümü ve kendini yenilemedeki dengesizlik dahil olmak üzere tanımlanmış bağırsak fonksiyonlarının bozulması, yetersiz beslenme ve enflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) dahil olmak üzere bir dizi gastrointestinal bozukluğun gelişmesine neden olabilir2,3.

Daha önce, insan bağırsak dokusunun fizyolojik ve patofizyolojik işlevlerini incelemek için hayvan modelleri ve dönüştürülmüş kanser kaynaklı bağırsak hücre hatları kullanılmıştır. Bununla birlikte, iki tür arasındaki önemli eşitsizliklerin varlığından kaynaklanan hayvan araştırmalarının insanlara çevrilebilirliği konusunda giderek daha belirgin hale gelen endişeler, insanla ilgili alternatif yöntemlere duyulan ihtiyacı vurgulamıştır4. Yaygın olarak kullanılan in vitro bağırsak hücre hatları T84, Caco-2 ve HT29 hücrelerini içerir. Bağırsak bariyer fonksiyonunun ve membran transportunun belirli yönlerini taklit ederken, ilaç metabolize edici enzimler5, yüzey reseptörleri ve taşıyıcıların4'ün değiştirilmiş bir ekspresyonu ile karakterize edilirler. Ek olarak, bağırsak segmenti özgüllüğünden yoksundurlar ve bağırsak epitelinin karmaşıklığını özetlemekte başarısız olurlar, her model bağırsakta bulunan beş epitel hücre tipinden sadece birini içerir6.

Son zamanlarda, ince bağırsak ve kolon7,8 veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC)9 taze biyopsilerinden oluşturulan insan bağırsak organoid kültürleri, gelecekte hayvan deneylerini tamamlama, azaltma ve belki de yerini alma potansiyeline sahip alternatif deneysel modeller olarak tanıtılmıştır. İPSC'ler invaziv olmayan bir şekilde elde edilebilirken, iPSC'lerden organoidlerin oluşturulması, karmaşık ve uzun protokollerin (birkaç deneysel adımla) kullanılmasını gerektirir ve insan fetal dokusuna benzeyen kültürler üretir. Buna karşılık, biyopsi kaynaklı organoidler, bağırsak dokusunun doğal yenileme kapasitesinden yararlanabildikleri ve in vitro olarak süresiz olarak geçilebildikleri ve çoğaltılabildikleri için oldukça ölçeklenebilirler. Önemli olarak, biyopsi kaynaklı organoidler, geliştirildikleri birincil dokunun hastalığını ve bağırsak bölgesine özgü özelliklerini korur ve bağırsak epitelinin hücresel çeşitliliğini taklit eder. Organoidler, çeşitli gastrointestinal bozuklukların biyolojisini ve patogenezini çözmek ve terapötik yönetimlerini iyileştirmek için in vitro olarak hastaya özgü avatarlar olarak kullanılabilir. Bağırsak organoidleri etkileyici bir fizyolojik işlevsellik derecesine ulaşmış olsalar da, kan damarları, bağ dokusu, periferik sinirler ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere kritik stromal bileşenlerin yanı sıra mekanik stimülasyon eksikliği nedeniyle doğal organların karmaşıklığını yeniden üretememektedirler. Akış, kayma gerilmesi, gerilme ve basınç gibi mekanik parametrelerin doku morfogenezini ve homeostazı in vivo olarak etkilediği bilinmektedir ve daha önce in vitro10,11,12,13 hücrelerinin olgunlaşmasını iyileştirdiği gösterilmiştir. Organoid sistemlerin bir diğer önemli dezavantajı, lümenin ve dolayısıyla epitelin apikal tarafına erişilememesidir. Bu, iyon ve ilaç taşıyıcılarının polarize ekspresyonu, konakçı-mikrobiyom etkileşimleri ve farmasötik toksisite testi ile ilişkili çeşitli mekanizmaları araştırmak için bir zorluk teşkil etmektedir. Son olarak, organoid kültürler, in vitro öz-organizasyon sürecinin stokastik doğası ve hücre kaderi seçimleri nedeniyle boyut, morfoloji ve fonksiyonda önemli farklılıklardan muzdariptir. Bu nedenle, bağırsak organoidlerinin hastalık modelleme, ilaç taraması ve rejeneratif tıptaki tam potansiyelini gerçekleştirmek için, organoid gelişimindeki değişkenliği azaltan, luminal bölmeye erişimi artıran ve eksik hücre-hücre etkileşimlerini içeren yeni stratejiler araştırmak gerekir.

Çip üzerinde organ teknolojisi, mekanik kuvvetlerin ve sıvı akışının bağırsak hücre kültürlerine in vitro olarak dahil edilmesi için birçok teknik getirmiştir. Bununla birlikte, ilk kavram kanıtı çalışmalarının çoğu, yeterli hücresel çeşitlilik göstermeyen kanser kaynaklı hücre hatları kullandığından, bu sistemlerin alaka düzeyi sorgulanmıştır. Son zamanlarda, her yaklaşımın en iyi özelliklerini bir in vitro sistem14,15,16'ya dahil etmek için bağırsak organoidlerini ve çip üzerinde organ teknolojisini sinerjik olarak birleştirdik. Ortaya çıkan bağırsak-çip, bağırsak epitelinin çok hücreli mimarisini, epitelyal-endotel doku arayüzünün varlığını ve sıvı akışı ve gerilmesinin mekanik kuvvetlerini özetleyerek in vitro organ seviyesi fonksiyonlarının emülasyonunu sağlar. Ek olarak, birincil doku kaynaklı organoidlerin (insan bağırsağının farklı bölgelerinden örneklenebilen) bir başlangıç materyali olarak kullanılması, bu modelin çok yönlülüğünü arttırır, çünkü insan duodenum, jejunum, ileum ve kolonunu temsil eden çipler benzer tohumlama ve kültür prosedürlerini takiben kurulabilir. Önemli olarak, Bağırsak Çipleri gerçek zamanlı değerlendirmeyi sağlar: bağırsak bariyeri bütünlüğü; fırça sınırının ve ilaç metabolizması enzimlerinin aktivitesi; müsin üretimi; sitokinlerin salgılanması; ve bağırsak hücrelerinin patojenik ve kommensal mikroorganizmalarla etkileşimi, daha önce yayınlanan raporlarda gösterildiği gibi. Özellikle, farklı bireylerin dokularından üretilen organoidler kullanılarak bağırsak çipleri kurulduğunda, bu modeller çeşitli ilaçlara ve tedavilere fonksiyonel yanıtlarda beklenen donörler arası değişkenliği yakaladı. Organoidlerin Organ-on-a-Chip teknolojisi ile birleştirilmesi, in vitro bulguların fizyolojik alaka düzeyini ve doğruluğunu ve ayrıca insanlara ekstrapolasyonunu artırabilecek daha gelişmiş, kişiselleştirilmiş, in vivo ilgili modellere kapı açar. Burada, bağırsak çipinin kurulması ve iki bağırsak segmentinin fizyolojik fonksiyonlarının çalışmalarında uygulanması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır: duodenum ve kolon. İlk olarak, duodenum çipindeki ilaç metabolize edici enzim CYP3A4'ün aktivitesini ve ayrıca rifampisin ve D3 Vitamini gibi prototipik bileşikler tarafından indüksiyonunu değerlendirme yöntemleri açıklanmaktadır. İkincisi, kolon çipinde "sızdıran bağırsak" ı modellemek için gereken adımlar protokolde özetlenmiştir, epitel bariyerinin bozulması, IBD'nin patogenezinde rol oynayan ayırt edici sitokinler kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Kısaca, insan biyopsilerinden elde edilen organoidler in vitro olarak yayılır, enzimatik sindirime tabi tutulur ve çipin üst kanalına sokulur. Büyüme faktörü ile zenginleştirilmiş ortamlarla sürekli perfüzyon varlığında, 3D mimarisi ve kolayca erişilebilen apikal hücre yüzeyi ile birleştirilmiş bir epitel tek katmanına dönüşürler. Altta, "vasküler" çip bölmesi, ince veya kalın bağırsaktan izole edilen mikrovasküler endotel hücreleri ile tohumlanır. Epitel ve endotel, iki doku arasındaki parakrin etkileşimleri kolaylaştıran gözenekli gerilebilir bir zar ile ayrılır ve siklik deformasyonlara maruz kaldığında, insan bağırsağının peristalsis benzeri hareketlerini taklit eder. Ko-kültür, uygun hücre kültürü ortamı ile luminal ve vasküler perfüzyonun oluşturduğu dinamik akış koşulları altında korunur. Son olarak, doğrudan çip üzerinde veya örneklenmiş hücre kültürü atık sularından gerçekleştirilebilecek çok sayıda tahlil ve uç nokta analizi türünü açıklıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Tüm hücre kültürleri uygun bir aseptik teknik kullanılarak ele alınmalıdır.

Bu çalışmada kullanılan insan bağırsak organoidleri Johns Hopkins Üniversitesi'nden elde edilmiş ve tüm yöntemler onaylanmış kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm deneysel protokoller Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB #NA 00038329) tarafından onaylanmıştır.

1. Hücre kültürü reaktiflerinin hazırlanması

  1. İnsan organoid büyüme ortamını üreticinin talimatlarını izleyerek hazırlayın (Malzeme Tablosu) ve 100 μg / mL primosin ile tamamlayın.
  2. Üreticinin talimatlarını (Malzeme Tablosu) izleyerek insan mikrovasküler endotel hücre büyüme ortamını hazırlayın ve 100 μg / ml primosin yerine 1:20 vol / vol FBS ve 50 μg / ml ile tamamlayın.
  3. 10 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için DPBS'de steril% 0.1 BSA'da Y-27632'yi (Rho-kinaz İnhibitörü) yeniden askıya alın. Aliquot steril mikrotüplere ve -20 ° C'de 6 aya kadar saklayın.
  4. 5 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için CHIR99021'i (GSK-3 İnhibitörü) steril dimetilsülfoksit (DMSO) içinde yeniden askıya alın. Aliquot steril mikrotüplere ve -20 ° C'de 6 aya kadar saklayın.
  5. İnsan organoid sindirim çözeltisini, 1: 1 vol / vol organoidler ayrışma çözeltisini (Malzeme Tablosu) DPBS çözeltisi (Malzeme Tablosu) ile karıştırarak ve 10 μM stok çözeltisi olan Y-27632 ile tamamlayarak hazırlayın. Bu reaktif her kullanım için taze yapılmalıdır.

2. İnsan Bağırsak Mikrovasküler Endotel Hücreleri Kültürü (HIMEC'ler)

  1. HIMEC kültürünü (Malzeme Tablosu) çipe tohumlamadan 7 gün önce başlatın. Talaş tohumlama için sadece 1-6 arasındaki geçişteki HIMEC'ler kullanılabilir.
  2. Bir T150 şişesine 5 mL ataşman faktörü çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyin; 1 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve çözeltiyi atın.
  3. Şişeye oda sıcaklığında önceden ısıtılmış 19 mL endotel hücresi büyüme ortamı ekleyin (bkz. adım 1.2).
  4. Dondurulmuş bir HIMEC şişesini (2 milyon hücre/şişe) 37°C su banyosunda çözün.
  5. Şişenin içeriğini şişeye aktarın ve hücreleri eşit olarak dağıtmak için şişeyi hafifçe sallayın. Endotel hücrelerinin yapışmasına izin vermek için şişeyi gece boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
  6. Ortamı, ertesi gün ve bundan sonraki 3 günde bir oda sıcaklığında önceden ısıtılmış 20 mL endotel hücresi büyüme ortamı ile değiştirin. Kültürler, çip deneyleri için hücre hasadı gününde akıcılığın% 90'ına ulaşmalıdır.

3. Mikrofabrikasyon ve çipin hazırlanması

  1. Ticari bir tedarikçiden çip alın (Malzeme Tablosu). Talaşları ambalajından çıkarın ve kare bir Petri kabına (Malzeme Masası) yerleştirilmiş çip yuvasına yerleştirin. Her çip taşıyıcısının ön tarafını deneysel koşullarla etiketleyin (Şekil 1A).
    NOT: Sunulan protokol, ticari olarak temin edilebilen belirli bir çip ve enstrümantasyonun kullanımına dayanırken, alternatif avantajlar sunabilecek ancak gerilme kabiliyetinden yoksun olan farklı satıcılar aracılığıyla sunulan birkaç mikroakışkan cihaz vardır. Ek olarak, Çip Üzerindeki Organların mikrofabrikasyonu, Huh ve ark.21'de açıklanan prosedürleri izleyerek "evde" gerçekleştirilebilir.

4. Membranın aktivasyonu ve ECM kaplaması

  1. Aktivasyon çözeltisinin hazırlanması
    1. Kullanmadan önce dengelemek için ER-1 ve ER-2 reaktiflerini (Malzeme Tablosu) oda sıcaklığına getirin. ER-1 ışığa duyarlıdır ve karanlıkta kullanılmalıdır.
    2. 0.5 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon yapmak ve ER-1'in tamamen çözündüğünü doğrulamak için ER-1'i 10 mL'lik ER-2 reaktifinde yeniden oluşturun.
  2. Yüzey aktivasyonu
    1. ER-1 çözeltisinin 50 μL'sini çipin her iki kanalından yavaşça itin (Şekil 1A).
    2. Fazla ER-1 çözeltisini aspiratör kullanarak çipin yüzeyinden çıkarın.
    3. Tüm çiplerin ER-1 çözümünü aldığından emin olmak için çipleri inceleyin. Hava kabarcıkları durumunda, kabarcıklar tamamen çıkarılana kadar daha fazla ER-1 çözeltisi uygulayın.
    4. UV lamba odasının (Malzeme Tablosu) içindeki cipsleri 15 dakika boyunca inkübe edin. UV lambasının Tutarlı ayarına ayarlandığını onaylayın.
    5. ER-1 aktif çipleri biyogüvenlik kabinine (BSC) geri getirin. ER-1 çözeltisini her iki kanaldan da aspire edin. ER-1 çözeltisinin herhangi bir kalıntısını 200 μL ER-2 ile yıkayın.
    6. 200 μL steril Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini (DBPS) kanallardan (Malzeme Tablosu) itin ve DBPS'yi bir sonraki adıma kadar kanallarda bırakın.
  3. Hücre dışı matris (ECM) ve membran kaplamanın hazırlanması
    1. ECM bileşenlerinin stok çözeltilerinin hazırlanması
      1. Kollajen IV (Malzeme Tablosu) ve fibronektin (Malzeme Tablosu) steril hücre kültürü dereceli su (Malzeme Tablosu) kullanılarak 1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden oluşturun. Alikotları hazırlayın ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.
    2. Membran kaplama için ECM çalışma çözeltisinin hazırlanması
      1. Kaplanacak her 12 talaş için üst ve alt kanal için her ECM çözeltisinden 1,5 mL'sini hazırlayın. ECM çözeltisi her zaman kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.
      2. Üst kanal için, kollajen IV ve çözünür bazal membran matrisini (BMM) (Malzeme Tablosu) steril soğuk DBPS'de sırasıyla 200 μg / mL ve 100 μg / mL'de karıştırın. Alt kanal için, kollajen IV ve fibronektin'i steril soğuk DPBS'de sırasıyla 200 μg / mL ve 30 μg / mL'de karıştırın.
    3. Talaşların ECM kaplaması
      1. DBPS'yi yongaların her iki kanalından da aspire edin ve her kanal için uygun ECM çalışma çözeltisi ile değiştirin (Şekil 1A).
      2. Kaplama çözeltisini aldığından emin olmak için her çipi kontrol edin. Hava kabarcıkları durumunda, tüm kabarcıklar tamamen çıkarılana kadar daha fazla kaplama çözeltisinden geçirin.
      3. Talaş yuvasına steril DPBS ekleyin ve cipsleri içeren Petri kabını 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. ECM proteinlerinin aktive edilmiş PDMS membranı ile iyonik bağlar oluşturmasına izin vermek için gece boyunca inkübe edin. İstenirse, hücreler cipslerin kaplanmasından sonra 2 saat ile 1 gün arasında herhangi bir zamanda ekilebilir. Alternatif olarak, kaplanmış talaşlar gece boyunca 4 ° C'de saklanabilir, ardından 37 ° C'de gece boyunca inkübasyon ve talaş tohumlama yapılabilir.

5. Çipin alt kanalında Bağırsak Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin (HIMEC'ler) tohumlanması

NOT: İnce bağırsak ve kolonik HIMEC'ler sırasıyla duodenum ve kolon çipinin alt kanalına tohumlanır.

  1. Cips hazırlama
    1. ECM kaplı talaşları BSC'ye aktarın. ECM kaplamasını talaşların her iki kanalından nazikçe aspire edin ve ardından her iki kanalı da sırasıyla 200 μL organoid büyüme ortamı ve endotel hücresi büyüme ortamı ile yıkayın.
    2. Yıkanmış cipsleri, endotel hücrelerinin tohumlanmasına devam edene kadar 37 ° C'lik bir inkübatörde saklayın.
  2. Endotel hücrelerini hasat edin
    1. HIMEC kültür şişesini BSC'ye getirin ve steril DPBS kullanarak yıkayın.
    2. Şişeye 3 mL ayrışma çözeltisi ekleyin ve tam hücre ayrılmasına izin vermek için 2 dakika boyunca 37 ° C inkübatöre yerleştirin.
    3. Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve 10 mL'ye ulaşana kadar endotel hücre büyüme ortamı ekleyin. Hücre sayımı için hücre süspansiyonunun 15-20 μL'lik örneği. 5 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj.
    4. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve HIMEC'leri endotel hücre büyüme ortamında 8-10 x 106 hücre / mL yoğunluğa yeniden askıya alın.
  3. Endotel hücrelerini çipin alt kanalına tohumlayın
    1. Talaşları içeren Petri kabını BSC'ye getirin ve 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak tüm ortamları alt kanaldan nazikçe çıkarın.
    2. HIMEC süspansiyonunun 10-15 μL'sini çipin alt kanalına yerleştirin. Optimum tohumlama yoğunluğunu (kapsama alanının% 80-90'ı) ve kanal içinde homojen hücre dağılımını sağlamak için tohumlamadan hemen sonra çipi kontrol edin (Şekil 1D). Tohumlama yoğunluğu beklenenden daha yüksek veya daha düşükse veya eşit değilse, kanal 2x'i 200 μL endotel hücresi büyüme ortamı ile yıkayın ve tohumlama prosedürünü tekrarlayın.
    3. PDMS zarının alt tarafına endotel hücresi bağlanmasına izin vermek için her altı yonga partisini tohumladıktan hemen sonra Petri kabını ters çevirin. Petri kaplarını 37°C inkübatöre 30 dakika ila 1 saat arasında veya alt kanaldaki HIMEC'ler membrana yapışana kadar yerleştirin (Şekil 1D).
  4. Talaşları yıkayın
    1. Bağlanmamış hücreleri çıkarmak ve ortamdaki besinleri yenilemek için 200 μL endotel hücresi büyüme ortamını alt kanal girişinden yavaşça itin.
    2. Üst kanala yapışmayan hücreleri, 5 μM CHIR99021 ve 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 200 μL organoid büyüme ortamı ile yıkayın.
    3. Epitel hücresi tohumlamasına geçene kadar cipsleri 37 ° C inkübatöre yerleştirin.

6. Çipin üst kanalındaki organoid parçalarının tohumlanması

NOT: Çeşitli bağırsak bölgelerinin biyopsilerinden izole edilen organoidler bağırsak çipinde kültürlenebilir7. İnsan bağırsak kriptlerinin izolasyonu ve organoid kültürlerin kurulması için Fujii ve ark.'da açıklanan prosedürleri izleyin22. Burada, duodenum ve kolonik organoidler sırasıyla duodenum ve kolon çiplerini üretmek için kullanılır. Organoid oluşumu ve büyümesindeki yüksek partiden partiye ve donörden donöre değişkenlik göz önüne alındığında, 8 milyon hücre / mL'lik optimum tohumlama yoğunluğunu elde etmek için organoid süspansiyon kültüründe (24 delikli plaka formatı) hücre yoğunluğunun pilot değerlendirmesinin yapılması önerilmektedir.

  1. Statik organoid kültürün hücre sayılarının/kuyularının pilot değerlendirmesi.
    NOT: Aşağıdaki prosedür yalnızca talaş tohumlaması için gerekli organoid süspansiyon kültürünün kuyucuk sayısını belirlemek içindir. Elde edilen tek hücreler çip tohumlama için kullanılmamalıdır.
    1. Süpernatantı organoid kültür plakasının üç kuyucuğundan dikkatlice aspire edin. Her bir oyuğa 500 μL buz gibi soğuk BMM ayrışma çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyin ve çözünür BMM'yi plastikten ayırmak için plastik bir kazıyıcı kullanın.
    2. Organoid süspansiyonu, buz gibi soğuk 1.000 μL pipet kullanarak steril düşük proteinli bağlayıcı konik bir tüp halinde toplayın. 60 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın, tüpü hafifçe sallayarak her 15 dakikada bir karıştırın. 4°C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
    3. Süpernatantı aspire edin ve 2 mL Tripsin ekleyin. Organoidleri tek hücre seviyesine kadar sindirmek için 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için 10 mL tam organoid büyüme ortamı ekleyin. 4°C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
    4. Hücre peletini 1 mL'lik tam organoid büyüme ortamında yeniden askıya alın ve standart yöntemlere göre bir hematositometre kullanarak toplam hücre sayısını sayın.
  2. Organoid fragmanlarının hazırlanması ve çipte tohumlanması
    NOT: Aşağıdaki prosedürler, çipin üst kanalındaki duodenal veya kolonik organoidleri tohumlamak için kullanılabilir. İn vivo ilgili 3D sitomimariye sahip bir epitel monokatmanının kurulması, akış 15,23'ün varlığına ve organoid fragmanlarının başarılı bir şekilde tohumlanmasına bağlıdır.
    1. Ortamı, statik organoid kültürün kuyucuk sayısından dikkatlice aspire edin, bu da adım 6.1'de belirlendiği gibi, 8 milyon hücre / mL'lik nihai tohumlama yoğunluğuna ulaşmak için yeterlidir. Her bir kuyucuğa 500 μL buz gibi soğuk BMM ayrışma çözeltisi ekleyin.
    2. Çözünür BMM'yi plastik kazıyıcı veya 1.000 μL pipet kullanarak kuyucukların yüzeyinden ayırın. Süspansiyonu 15 mL'lik düşük proteinli bağlayıcı konik bir tüp halinde toplayın.
    3. Süspansiyonu 60 dakika boyunca buz üzerinde saklayın, tüpü hafifçe sallayarak her 15 dakikada bir karıştırın. 4°C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjlemeye devam edin. Santrifüjlemeden sonra iyi tanımlanmış bir organoid pelet görülmelidir. Hücre peletinin üzerinde şeffaf bir jel tabakası gözlenirse (çözünür BMM kalıntıları) (Şekil 1B), aşağıdaki adımlarla devam edin.
      1. Süpernatant ve hücre peletini karıştırın ve tüpe eşit miktarda BMM ayrışma çözeltisi ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 10 dakika daha buz üzerinde saklayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjlemeye devam edin.
      2. Gerekirse, çözünür BMM kalıntıları kalmayana kadar adım 6.2.3.1'i tekrarlayın.
    4. Süpernatantı atın ve organoid peleti organoid sindirim çözeltisi ile yeniden askıya alın (bkz. adım 1.5). Peletin tamamen daldırılmasını sağlamak için yeterli miktarda organoid sindirim çözeltisi kullanın. Yaklaşık 2.400-12.000 orta büyüklükteki organoid için 2 mL çözelti uygundur (Şekil 1D, Tohumlama Sonrası). 1-3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    5. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için tüpe Gelişmiş DMEM / F-12 ekleyin. Kullanılan sindirim çözeltisinin hacminin dört katını kullanın. 4°C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
    6. Süpernatantı aspire edin ve 8 milyon hücre / mL elde etmek için organoid fragmanları peletini 5 μM CHIR99021 ve 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş tam bir organoid büyüme ortamında yeniden askıya alın. Duvarlara yapışma nedeniyle hücre yoğunluğunun azalmasını önlemek için süspansiyonun 360 μL alikotlarını steril 1.5 mL düşük proteinli bağlayıcı tüplerde hazırlayın.
    7. Ortamı kaplanmış talaşların üst kanalından çıkarın. Her çipin üst kanalına 30 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Organoid parçalarının ECM kaplı membrana yapışmasını sağlamak için talaşları gece boyunca 37°C'lik bir inkübatörde inkübe edin (Şekil 1D).

7. Bağırsak çipinin dinamik kültürü - akış ve peristalsis benzeri hareketlerin başlatılması ve sürdürülmesi

  1. Ortam hazırlama ve gaz giderme
    1. Talaş boyunca sabit laminer akışı korumak için, ortam sıcaklığının oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin ve ardından bir vakum pompası ve PVDF filtresi konik tüpleri (ortam gaz giderme) kullanılarak 10 dakika boyunca vakumla çalışan filtrelemeye tabi tutun.
  2. Portatif modüllerin astarlanması
    NOT: Portatif modüller, talaşlar ve kültür modülü arasında bir arayüz görevi gören rezervuarlardır ve ortamın tekrarlanması ve örneklenmesine izin verir.
    1. Taşınabilir modülleri BSC'de açın ve taşınabilir modüllerin hizalanması için özel kaplar olan kültür modülü tepsilerine yerleştirin.
    2. Üst giriş rezervuarına 5 μM CHIR99021 ve 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 3 mL önceden dengelenmiş tam organoid büyüme ortamı ve alt giriş rezervuarında 3 mL önceden dengelenmiş endotel hücre büyüme ortamı ekleyin (Şekil 1C). İlgili çıkış rezervuarlarına aynı ortamdan 300 μL ekleyin.
    3. Tepsileri 37°C inkübatöre getirin ve kültür modülüne kaydırın (Şekil 1C). "Prime Cycle"ı (1 dakika uzunluğunda) çalıştırmak için kültür modülünün ekranındaki kontrolleri kullanın. Durum çubuğunda "Hazır" ifadesi gösterildiğinde, Prime Döngüsü tamamlanır. Çipleri başarıyla bağlamak için yeterli damlacıkların oluştuğundan emin olmak için Prime Cycle'ı tekrarlayın.
    4. Tüm taşınabilir modüllerin astarlandığından ve görünür ortam damlacıklarına sahip olduğundan emin olun.
  3. Akışın tanıtımı
    NOT: Akış, bağırsak epitel hücrelerinin zara sıkıca yapışmasını sağlamak için tipik olarak organoid fragmanlarının tohumlanmasından 24 saat sonra başlatılır.
    1. Herhangi bir kabarcık veya hücre kalıntılarını gidermek için tohumlanmış cipslerin her iki kanalını da ilgili ortamın 200 μL'si ile yıkayın. Yıkamadan sonra portlarda küçük medya damlacıkları bırakın. Talaş taşıyıcısını taşınabilir modülün içine kaydırın (Şekil 1C).
    2. Taşınabilir modülleri tepsilere ve ardından kültür modülüne yerleştirin. Uygun organ çipi kültürü koşullarını (akış hızı ve esneme) programlamak için kültür modülünün ekranındaki kontrolleri kullanın.
      NOT: Standart duodenum ve kolon talaş kültürü koşulları için, hem üst hem de alt kanallar için akış hızını sırasıyla 30 μL/s 15 ve60 μL/h16 olarak ayarlayın. Bununla birlikte, her kanal için akış hızları bağımsız olarak kontrol edilir ve 0-1.000 μL / s arasında ayarlanabilir. Şırınga veya peristaltik pompalar, burada sunulan kültür modülleri yerine, mikroakışkan çiplere laminer akış sağlamak için kullanılabilir. Bununla birlikte, boru ve konektörler kullanılarak talaşlar ve pompalar arasında güvenilir akışkan bağlantıların kurulması, birden fazla talaşın aynı anda perfüzyonu gerektiğinde teknik olarak zor olabilir.
    3. Hava kabarcıklarının çekirdeklenmesini önlemek için taşınabilir modül ve çipteki kültür ortamını basınçlandıran "Düzenleme Döngüsünü" (2 saat uzunluğunda) başlatın. Programlanan koşullar, Düzenleme Döngüsünün tamamlanmasından sonra devam edecektir.
  4. Medya değişikliği
    1. Her iki kanal için de taze ortam hazırlayın ve giriş rezervuarlarına 2 mL taze ortam ekleyerek her 48 saatte bir doldurun (Şekil 1C).
    2. Kültür modüllerini duraklatın ve tepsileri BSC'ye getirin. Tüm rezervuarlardaki ortamları aspire edin ve taze ortamlarla doldurun. Tepsileri geri getirin ve akışı yeniden başlatın.
  5. Streç tanıtımı
    NOT: Siklik suş uygulanmadan önce hücrelerin 0 birleşime kadar büyümesine izin verin. Streç tipik olarak tohumlamadan 3 gün sonra veya akışkan kültürün başlamasından 48 saat sonra verilir. Duodenum 11 ve kolon 24 bağırsak çipi için sırasıyla% 2 siklik suş 0.2 veya0.15 Hz frekansında, ilk24 saat için uygulanır. Daha sonra, bağırsak epitel hücrelerinin in vivo olarak yaşadığı siklik suşa yakından benzemesi için bağırsak çip kültürünün kalan süresi boyunca% 10'a yükseltilir (Şekil 1D)25. Kültür modülü,% 2 -% 12 döngüsel gerinim ve 0,4 Hz'e kadar frekans uygulamasını destekleyebilir.
    1. Devam eden akışkan kültüre esneme eklemek için, kültür modülünü duraklatın. Ekrandaki kontrolleri kullanarak esnetme ayarlarını %2 esneme, 0,2 veya 0,15 Hz frekans olarak değiştirin ve kültür modülünü yeniden başlatın.
    2. 24 saat sonra, esneme, 0,2 veya 0,15 Hz frekans uygulamak için adım 7.5.1'i tekrarlayın.

8. Duodenum çipinde prototipik CYP indükleyicileri kullanılarak CYP450 indüksiyonu

NOT: Sitokrom P450 (CYP450) indüksiyon testi, test bileşiğinin spesifik CYP450 enzimlerinin mRNA seviyelerini ve / veya katalitik aktivitesini artırıp artırmadığını değerlendirmeyi sağlar. Burada, CYP3A4 indüksiyonunun in vitro CYP indükleyicileri, Rifampisin (RIF) ve 1,2-dihidroksi D3 vitamini (VD3) tarafından önerilen endüstri standardı ve regülatörü ile değerlendirilmesi için protokolü açıklıyoruz. Sunulan yöntem, insan bağırsak dokusunda CYP450'nin farklı izoformlarını indüklemek için çeşitli test bileşiklerinin potansiyelini tanımlamak için kullanılabilir. Değerlendirilecek her enzim izoformu için spesifik primer ve prob substrat setlerinin seçilmesi gerekecektir.

  1. CYP İndükleyicilerine Maruz Kalma
    1. Steril DMSO kullanarak 20 mM RIF, 100 mM VD3 ve 200 mM Testosteron (Malzeme Tablosu) stok çözeltileri hazırlayın.
      DİKKAT: Testosteron, Program III kontrollü bir maddedir. Taşıma sırasında yasal prosedürleri izleyin.
    2. 20 μM RIF, 100 nmol/L VD3 elde etmek için stok çözeltilerini tam organoid büyüme ortamında ve endotel hücre büyüme ortamında seyrelterek CYP indükleyicilerle dozaj ortamı hazırlayın. DMSO'nun %0,1'ini elde etmek için ilgili ortamda DMSO'yu seyrelterek araç kontrolünü hazırlayın.
    3. Kültür modülünü duraklatın ve tepsileri BSC'ye getirin. Tüm giriş rezervuarlarındaki ortamı, indükleyiciler veya araç kontrolü ile 2 mL dozaj ortamı ile değiştirin. Taşınabilir modülleri kültür modülüne geri döndürün ve akışı 30 μL/s'de yeniden başlatın.
    4. 24 saat sonra, ortamı indükleyici çözeltiyle değiştirin ve 8.1.2-8.1.3 arasındaki adımları yineleyin. İndükleyici çözeltiler günlük olarak taze hazırlanmalı ve deney boyunca her 24 saatte bir yenilenmelidir, bu da tipik olarak 48-72 saat uzunluğundadır.
  2. Prototipik bir substrat (Testosteron) ile inkübasyon
    1. Hasat gününde, 200 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için Gelişmiş DMEM / F12'de karşılık gelen indükleyicilerle birlikte Testosteronun prob substrat çözeltisini hazırlayın.
    2. Tepsileri BSC'ye getirin ve dozaj ortamını tüm rezervuarlardan aspire edin. Üst ve alt giriş rezervuarlarını sırasıyla ılık Advanced DMEM / F12 ortamı ve endotel hücre büyüme ortamı ile yıkayın ve değiştirin.
    3. Yıkama ortamını rezervuarlardan çıkarın ve adım 8.2.1'de hazırlanan 1 mL prob substrat çözeltisi ile değiştirin. Talaşları 5 dakika boyunca 1.000 μL/s yüksek akış hızında perfüze edin ve hem üst hem de alt çıkış rezervuarlarını aspire edin. Talaşları kültür modülüne geri döndürün ve 300 μL/s sabit akışı altında 1 saat boyunca inkübe edin.
  3. Veri analizi
    1. LCMS analizi için numune toplama
      1. Aliquot 200 μL, önceden etiketlenmiş 1.5 mL tüplerde% 0.1 formik asit içeren Asetonitril içeren durdurma çözeltisi ve bunları buz üzerine yerleştirin. LCMS durdurma çözeltisinin bileşimi, analiz edilmesi gereken substrata bağlı olarak değişebilir.
      2. 1 saatlik işlem tamamlandıktan sonra, akışı durdurun ve tepsileri BSC'ye geri getirin. Üst çıkış rezervuarından 100 μL atık su toplayın ve durdurma çözeltisini içeren ilgili boruya ekleyin (Şekil 2A). Tüpleri hemen kuru buzun üzerine yerleştirin. Analize geçmeden önce numuneleri -80°C'de saklayın.
      3. HPLC veya LC-MS / MS tekniklerini kullanarak numuneleri çıkarın ve analiz edin, metabolit-6β-hidroksitestosteron (6β-OH-T) oluşumunu izleyin. CYP enzim aktivitesi pmol / dak / mg proteini olarak ifade edilebilir, burada pmol, reaksiyon sırasında oluşan metabolit (6β-OH-T) miktarını ifade eder. Çip başına toplam protein içeriği (protein; mg), adım 8.3.2'de açıklanan bir Bradford testi yapılarak belirlenir.
        figure-protocol-1
        Katlama indüksiyon aktivitesi şu şekilde hesaplanır: CYP aktivitesi (indüklenmiş) / CYP aktivitesi (araç).
      4. mRNA analizi için örnekler topluyorsanız, adım 8.3.3'e bakın.
    2. Protein ekspresyon analizi için hücrelerin lizisi
      NOT: Çip üzerindeki hücrelerden protein ekstraksiyonu, proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile desteklenmiş bir protein lizis tamponu kullanılarak gerçekleştirilir (Malzeme Tablosu). Ekstrakte edilen protein daha sonra Bradford testi kullanılarak ölçülür ve aşağı akış analizinde kullanılır.
      1. Talaşları taşınabilir modüllerden ayırın ve bir Petri kabına yerleştirin. Her iki kanalı da 200 μL steril DPBS ile yıkayın.
      2. Alt kanal çıkışını 200 μL filtre pipet ucuyla engelleyin. Ayrışma çözeltisinin 50 μL'sini alt kanaldan geçirin ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
      3. Endotel hücrelerinin tamamen ayrıldığını doğrulamak için inceleyin. Pipetleri 1-2 kez yukarı ve aşağı doğru çekin ve ayrışma solüsyonunu kanaldan çıkarın. Tekrar yıkayın.
      4. Üst kanal çıkışını 200 μL filtre pipet ucuyla engelleyin. Perfüze 75 μL protein lizis tamponu üst kanaldan. Üst kanal girişini bloke etmek için pipet ucunu takılı bırakın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın. Pipetleri 5-10 kez yukarı ve aşağı doğru toplayın ve hücre lizatlarını önceden etiketlenmiş 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın.
      5. 8.3.2.4 adımını yineleyin. hücrelerin tamamen ayrılması gözlenene kadar. Hücre lizatlarını aynı 1.5 mL tüpte toplayın ve analize kadar -80 ° C'de saklayın.
      6. Protein fraksiyonunu standart yöntemlere göre çıkarın ve Bradford testini (Malzeme Tablosu) kullanarak toplam proteini sayısallaştırın.
    3. Gen ekspresyon analizi için hücrelerin lizisi
      NOT: RNA ekstraksiyonu için çip üzerinde hücre lizisi,% 0.1 2-merkaptoetanol (Malzeme Tablosu) ile desteklenmiş bir RNA lizis tamponu kullanılarak elde edilebilir. Alternatif olarak, NGS ve mikrodiziler analizi için uygun yüksek kaliteli RNA'nın yüksek verimi gerekiyorsa, fenol bazlı bir RNA lizis tamponu kullanılabilir.
      1. Bağırsak çipini lizise hazırlamak için 8.3.2.1 ila 8.3.2.2 arasındaki adımları izleyin.
      2. 200 μL filtre pipet ucu kullanarak üst kanalın çıkışını engelleyin. Perfüze 150 μL RNA lizis tamponu üst kanaldan. Üst kanalın girişini engellemek için pipet ucunu takılı bırakın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatırın. Fenol bazlı bir RNA lizis tamponu kullanarak lizis için, reaktifin 350 μL'sini kullanın.
      3. Pipetleri 5-10 kez yukarı ve aşağı doğru toplayın ve hücre lizatlarını önceden etiketlenmiş 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın. Adımı başka bir 150 μL RNA lizis tamponu ile tekrarlayın ve toplayın. Hücre lizatlarını analize kadar -80 ° C'de saklayın. Daha sonraki RNA dizileme analizi durumunda, lizasyondan sonraki 1 ay içinde analize devam edin.
      4. Bir RNA saflaştırma kiti kullanarak hücre lizatlarından toplam RNA'yı çıkarın.
      5. Bir ters transkriptaz kiti kullanarak cDNA'ya ters transkripsiyon yapın ve gerçek zamanlı bir PCR sikler ve uygun primerler ve tampon kullanarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin. 2-ΔΔCt yöntemini kullanarak sonuçları ölçün.

9. Kolon çipinde proinflamatuar sitokinler kullanılarak epitel bariyerinin bozulması

NOT: Bu protokol, bağırsak epitel bariyerinin sitokin interferon gama (IFNγ) 26,27,28,29 tarafından bozulmasını açıklar. Sitokin, bağırsak epitel hücreleri üzerindeki IFNγ reseptörünün bazolateral ekspresyonu göz önüne alındığında, kolon çipinin alt kanalında dozlanır.  Proinflamatuar uyaran, Puygulaması 0,5 x 10-6 cm / s'nin altında stabilize edilir edilmez, kültürün 5. gününde çipe tanıtılır. Benzer bir dozlama rejimi diğer proinflamatuar sitokinler ve bariyer bozucu ajanlar için kullanılabilir.

  1. IFNγ ile stimülasyon
    1. Steril hücre kültürü suyunda 100 μg / mL'lik bir IFNγ (Malzeme Tablosu) stok çözeltisi hazırlayın. Stok çözeltisini deney boyunca -80 ° C'de saklayın. Her deney için, her zaman taze bir IFNγ stoğu kullanın ve üçten fazla donma ve çözülme döngüsünden kaçının.
    2. 10-100 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için gazdan arındırılmış endotel hücresi büyüme ortamında stok çözeltisini seyrelterek IFNγ dozaj çözeltisini hazırlayın.
    3. Tepsileri BSC'ye getirin ve ortamı alt kanal giriş rezervuarlarından çıkarın ve 3 mL IFNγ içeren ortam ile değiştirin. IFNγ dozlama ortamını günlük olarak yenileyin.
    4. Tepsileri kültür modülüne yerleştirin ve IFNγ işlemini başlatmak için talaşları 5 dakika boyunca 1.000 μL/s yüksek akış hızında perfüze edin. Akış hızını tekrar 60 μL / s'ye değiştirin ve akışkan kültüre devam edin.
  2. Veri analizi
    1. Epitel bariyer fonksiyonunun değerlendirilmesi. Epitelyal görünür geçirgenlik (Puygulaması) veya bariyer fonksiyonu, IFNγ ile işlem sonrası kültürün çeşitli zaman noktalarında, her iki kanalın giriş ve çıkış rezervuarlarının atık su ortamlarında ölçülebilir. Floresan izleyici, Puygulamasının değerlendirilmesinden 4 saat önce üst kanal organoid büyüme ortamına eklenmelidir. Tipik olarak, floresan izleyici olarak 3 kDa Dextran Kaskad Mavisi kullanılır ve 24 saat önce ortada eklenir.
      1. Kültür modülünü duraklatın ve tepsileri BSC'ye getirin.
      2. Kuyu başına 100 μL DPBS içeren 96 delikli siyah duvarlı bir plakayı etiketleyin ve hazırlayın. 200 μL çok kanallı pipet kullanarak, tüm rezervuarlardan 50 μL atık su toplayın ve ilgili kuyucuklara ekleyin (Şekil 2B).
      3. Standart eğriyi hazırlamak için, DPBS'de 100 μg/mL 3 kDa dekstran Kaskad Mavisi 1:3 içeren ortamı seyreltin. Daha sonra DPBS'de endotel hücre büyüme ortamının üç kat seyreltilmesini kullanarak seri seyreltmeler gerçekleştirin.
      4. Bir plaka okuyucu kullanarak floresanı 375 nm uyarma ve 420 nm emisyonda okuyun. Görünür geçirgenliği (Puygulaması) hesaplamak için ölçülen OD değerlerini aşağıdaki gibi kullanın:
        figure-protocol-2
    2. Çip üzerindeki hücrelerin immünofloresan boyanması
      1. Her kanal için üç kez 200 μL DPBS kullanarak yıkayın.
      2. Her kanalda fiksatif çözeltinin (DPBS'de% 4 PFA) 200 μL'sini perfüze edin. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
      3. 9.2.2.1 yıkama adımını tekrarlayın. Bu aşamada, yıkanmış cipsler 4 ° C'de 7 güne kadar saklanabilir.
      4. Her kanal için 200 μL geçirgenlik çözeltisi (DPBS'de% 10 normal eşek serumunda (NDS)% 0.1 Triton-X 100) kullanarak hücreleri geçirgenleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 9.2.2.1 yıkama adımını tekrarlayın.
      5. Her kanal için 200 μL blokaj çözeltisi (DPBS'de NDS) kullanarak çip üzerindeki hücreleri bloke edin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
      6. Antikor çözeltisindeki primer antikorları (DPBS'de %5 NDS) aşağıdaki gibi seyreltin: anti-Zonula Occludens 1 (ZO-1) (1:100, epitel sıkı bağlantı belirteci), anti-Oklüdin (1:100, epitel sıkı bağlantı belirteci), anti-Claudin 4 (1:100, epitel sıkı bağlantı belirteci), anti-E-kadherin (1:100, epitel yapışkan birleşim belirteci (Malzeme Tablosu). Birincil antikor çözeltisinin 200 μL'sini her kanaldan geçirin ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin. 9.2.2.1 yıkama adımını tekrarlayın.
      7. İkincil antikorları antikor çözeltisinde seyreltin (DPBS'de 1:300, %5 NDS). Bu çözeltinin 200 μL'sini her kanaldan geçirin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. 9.2.2.1 yıkama adımını tekrarlayın. İstenirse, bir sitoiskelet belirteci olan falloidin, ikincil antikor çözeltisine eklenebilir.
      8. DPBS'de 50 μg / mL'lik bir 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi hazırlayın ve her kanaldan 200 μL'yi perfüze etmek için kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Yıkama adımını tekrarlayın. Bu noktada, lekeli cipsler 4 ° C'de 14 güne kadar saklanabilir.
    3. Kaspaz 3 bölünmesinin değerlendirilmesi
      1. Epitel hücrelerinin toplam protein miktarını adım 8.3.2'de açıklandığı gibi izole edin ve sayısallaştırın. 8.3.2.1 yıkama adımını atlayın. Numuneleri DPBS ile 400 μg/mL'lik son konsantrasyona kadar seyreltin.
      2. Üreticinin protokolünü izleyerek kaspaz 3 tespit kitini kullanarak toplam ve parçalanmış kaspaz 3 seviyelerini ölçün.
    4. Proinflamatuar sitokinlerin sekresyonunun değerlendirilmesi
      1. Salgılanan akut fazlı proinflamatuar sitokinleri ölçmek için kolon çipinin her iki kanalının çıkışından toplanan atık suları, üretici tarafından sağlanan protokolleri izleyerek kullanın. V-PLEX Vasküler Yaralanma Paneli 2 İnsan Kiti için 5 katlı seyreltme ve V-PLEX İnsan Proinflamatuar Panel II için iki katlı seyreltme gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1D, bağırsak çip kültürünün zaman çizelgesini özetler ve çip üzerinde tohumlamadan önce ve sonra bağırsak endotel hücrelerini ve organoidlerini gösterir. Ayrıca, duodenum çipindeki villus benzeri oluşumların varlığı ve ince bağırsak mimarisinin temsilcisi olarak vurgulanan duodenum ve kolon çipleri arasındaki belirgin morfolojik farklılıkları göstermektedir.

Şekil 3A,B, üç farklı organoid donöründen duodenum çip...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Çip üzerinde organ teknolojisi ve bağırsak organoidlerinin kombinasyonu, insan bağırsak fizyolojisinin ve patofizyolojisinin doğru modellenmesi için umut vaat etmektedir. Burada, biyopsiden türetilmiş ince bağırsak veya kolonik epitel ve mikroakışkan bir cihazda birlikte kültürlenmiş bağırsak mikrovasküler endotel hücrelerini içeren bağırsak çipinin kurulması için basit ve sağlam bir adım adım protokol ( Şekil 1'de özetlenmiştir) sunuyoruz. İnsan bağırsağının bu çip tabanlı simülasyonu, fizy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi ve Magdalena Kasendra, Emulate Inc.'in mevcut veya eski çalışanlarıdır ve özkaynaklara sahip olabilirler. Emulate Inc., organ çip cihazlarını üreten ve bu makalede belirtilen çalışmalarla ilgili patentleri yayınlanmış olan şirkettir.

Teşekkürler

Bağırsak biyopsisinden türetilmiş organoidleri sağladığı için Profesör Mark Donowitz'e ve çip, taşınabilir ve kültür modülünün bilimsel illüstrasyonlarını tasarladığı için Brett Clair'e teşekkür ederiz. Geri kalan tüm bilimsel illüstrasyonlar BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ince bağırsak İnsan Bağırsak Mikrovasküler Endotel HücreleriAlphaBioRegenALHE150.5 hücre M/ml ; dondurularak saklanmış
kolon İnsan Bağırsak Mikrovasküler Endotel HücreleriAlphaBioRegenALHE160.5 hücre M/ml ; dondurularak saklanmış
Biyopsi türevli İnsan Duodenal OrganoidleriJohn Hopkin Üniversitesi-Organoidler Profesör Mark Donowitz (Kurumsal İnceleme Kurulu Numarası: NA_00038329) tarafından sağlandı.
Biyopsiden Elde Edilen İnsan Kolonik OrganoidleriJohn Hopkin'inÜniversitesi-Organoidler Profesör Mark Donowitz (Kurumsal İnceleme Kurulu Numarası: NA_00038329) tarafından sağlandı.
Zoë CM-1 ve ticaret;   Kültür ModülüÖykünme Inc.-Kültür modülü
Orb-HM1 ve ticaret;   HubModülü Öykünme Inc.-%5 CO2, vakum streç ve güç kaynağı
Chip-S1 & ticaret; Gerilebilir ÇipÖykünme Inc.-Organ-Çip
Kapsülü ve ticareti; Taşınabilir ModüllerÖykünme Inc.-Taşınabilir modül
UV Işık KutusuÖykünme Inc.-
Chip CradleÖykünme & nbsp; Inc.Kare kültür kabı başına-
Steriflip®-HV FiltrelerEMD MilliporeSE1M003M000.45  μ m  PVDF filtre
Kare Hücre Kültürü Kabı (120 x 120 mm)VWR82051-068-El
Tipi  Vakum  aspiratörCorning4930 -
Aspirasyon  pipetlerCorning / Falcon3575582 mL,  polistiren, ayrı ayrı  sarılı
Aspirasyon uçları -Steril (otoklavlı)
Serolojik  pipetler -2 mL, 5 mL,  10 mL,  ve  25 mL  düşük endotoksin, steril
PipetP20, P200,   P1000  ve standart çok kanallı
Pipet  İpuçları P20, P200,   ve  P1000 olarak adlandırılır.
Konik tüpler ( Protein  LoBind® Tüpler)Eppendorf0030122216;   003012224015 mL, 50 mL tüpler
Eppendorf  Tüpler ve reg;   lo-bindEppendorf0224310811.5 mL tüpler
96 kuyu siyah duvarlı plaka-epitel geçirgenlik analizi için
Mikroskop (kameralı)-Parlak alan için 
görüntüleme Su banyosu (veya boncuklar)-37 ° C'ye ayarlayın; C
Vakum kurulumu --Minimum  basınç: -70 kPa
Hücre sıyırıcılarBiotium220033
T75 şişeleriBD Falcon353136Hücre kültürü şişesi
Öykünme Reaktifi-1 ( ER-1)Öykünme A.Ş.-Çip kaplama çözeltisi
Öykünme Reaktifi-2 ( ER-2)Öykünme A.Ş.-Talaş kaplama çözümü
Dulbecco' s PBS  (DPBS)Corning21-031-CV1X
Hücre Kültürü Sınıfı SuCorningMT25055CV
Tripan mavisiSigma93595Hücre sayımı için
TryplE ve nbsp; EkspresThermoFisher  Bilimsel12604013Organoidler  Ayrışma  ve endotel hücreleri  Ayrılma  çözüm
Gelişmiş DMEM/F12ThermoFisher  Bilimsel12634028Orta
Ölçekli BağırsakKült ve Ticaret; Organoid Büyüme Ortamı (İnsan)Kök Hücre teknolojileri06010Organoid Büyüme Ortamı Endotel
Hücre Büyüme Ortamı MV 2PromocellC-22121Endotel ortamı
Fetal sığır serumu (FBS)SigmaF4135Serum
Primosin ve ticaret;  InvivoGenANT-PM-1antimikrobiyal ajan
Bağlanma Faktörü ve ticareti;Hücre Sistemleri4Z0-210şişe Matrigel için kaplama çözeltisi
- Büyüme Faktörü AzaltılmışCorning356231Çözündürülmüş bazal membran matrisi
Kollajen IVSigmaC5533ECM bileşeni
FibronektinCorning356008ECM bileşeni
Y-27632Kök Hücre teknolojileri72304organoid medya takviyesi
CHIR99021Reprocell04-0004-10organoid medya takviyesi
Hücre Kurtarma SolüsyonuCorning354253Bodrum mebran matris ayrışma çözeltisi
Sığır Serum Albümini (BSA)SigmaA957630, Steril
Hücre Kültürü Sınıfı SuCorningMT25055CVSteril, Su
DMSOSigmaD2650çözücü
3KDa Dextran Cascade BlueInvitrogenD713210 mg toz
Rifampisin (RIF)SigmaCat # R3501CYP indükleyici
Testosteron hidratSigmaT1500CYP substrat
1,25-dihidroksi Vitamin D3 (VD3)SigmaCat # D1530CYP indükleyici
Asetonitril ile %0.1 (h/h) Formik asitSigma159002LCMS durdurma çözümü
IFN & gama;Peprotech300-02
%4 Paraformaldehit (PFA)EMS157-4Fiksatif
Triton-X 100SigmaT8787
Normal Eşek Serumu (NDS)Sigma566460
Anti-OklüdinThermoFisher  Scientific33-1500sıkı bağlantı işaretleyici
anti-Claudin 4ThermoFisher  Bilimsel36-4800sıkı bağlantı işaretleyici
anti-E-kaderinAbcamab1416epitelyal adherens bağlantı işaretleri
işaretleyici anti-VE-kaderinAbcamab33168endotelyal yapışık bağlantılar işaretleyici
anti-Zonula Tıkaçanlar 1 (ZO-1)Thermo Fischer339194sıkı bağlantı işaretleyici
DAPIThermoFisher  Bilimsel62248nükleer leke
2-merkaptoetanolSigmaM6250
PureLink RNA Mini Kitiİnvitrojen12183020RNA lizizi, izolasyonu ve saflaştırma kiti
SuperScript ve ticaret; IV VILO&ticaret; Master MixInvitrogen11756050ters transkriptaz kiti
TaqMan & trade; Hızlı Gelişmiş Master MixUygulamalı Biyosistemler4444557qPCR reaktifi
QuantStudio™ 5 Gerçek Zamanlı PCR SistemiUygulamalı BiyosistemlerA28573Gerçek zamanlı PCR döngüleyici
18S astarThermoFisher BilimselHs99999901_s1Ökaryotik 18S rRNA
CYP3A4 astarThermoFisher BilimselHs00604506_m1Sitokrom ve nbsp; aile 3 alt aile A üye 4
Pierce & trade; Coomassie Plus (Bradford) Test KitiThermoFisher Scientific23236Protein miktar tayin kiti
MSD Tris lizis tamponuMeso Scale DiagnosticsR60TX-3Protein lizis tamponu
Bölünmüş/Total Kaspaz-3 Tam Hücre Lizat KitiMeso Scale DiagnosticsK15140DKaspaz 3 tespit kiti
V-PLEX Vasküler Yaralanma Paneli 2 İnsan KitiMeso Scale DiagnosticsK15198D
V-PLEX İnsan Proinflamatuar Panel II (4-Plex)Mezo Ölçek TeşhisiK15053D
Zeiss LSM 880Zeiss-Konfokalmikroskop
Zeiss LD planı-Neofluar 20x/0.40 Korr M27Zeiss-20Xuzun mesafe objektif lensleri
Zeiss AXIOvert.A1Zeiss-Brightfieldmikroskobu
Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1Zeiss-10X objektif lensleri
1%

Kaynaklar

  1. Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
  2. Okumura, R., Takeda, K. Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers. Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).
  3. Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. Cell death at the intestinal epithelial front line. FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).
  4. Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  5. Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Yu, H., et al. The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology. Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  10. Durel, J. F., Nerurkar, N. L. Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis. Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).
  11. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  12. Xu, Y., et al. Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells. Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).
  13. Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS One. 8 (7), 68761(2013).
  14. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  15. Kasendra, M., et al. Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model. eLife. 9, 50135(2020).
  16. Apostolou, A., et al. A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).
  17. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583(2019).
  18. Yin, J., et al. Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).
  19. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  20. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43(2019).
  21. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
  22. Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).
  23. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  24. Sarna, S. K. Colonic motility: From bench side to bedside. Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).
  25. Basson, M. D. Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology. Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).
  26. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).
  27. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-Catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  28. Madara, J. L., Stafford, J. Interferon-γ directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers. Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).
  29. Bruewer, M., et al. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms. The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).
  30. Jones, S. C., et al. Adhesion molecules in inflammatory bowel disease. Gut. 36 (5), 724-730 (1995).
  31. Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant. European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).
  32. Pérez-González, C., Ceada, G., Matejčić, M., Trepat, X. Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium. Current Opinion in Genetics & Development. 72, 82-90 (2022).
  33. In, J., et al. Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).
  34. Grassart, A., et al. Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection. Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).
  35. Kerns, S. J., et al. Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies. eLife. 10, 67106(2021).
  36. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  37. Ingber, D. E. Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips. Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ba rsak ipiBa rsak BariyeriEpitel MonotabakaParasel ler Ge irgenlikla MetabolizmasCYP3A4 nd ksiyonuKonak Mikrop Etkile iminterferon Gama
Bağırsak Bölgesine Özgü İşlevselliği Modellemek için İnsan Organoidlerini ve Çip Üzerinde Organ Teknolojisini Birleştirme
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.