Bu protokol, insan dışı primat ileumundan izole edilen üç boyutlu (3B) enteroidlerden türetilen iki boyutlu (2B) tek katmanlı tabakalar üzerinde bir çizik yara testi oluşturmak ve gerçekleştirmek için bir yöntem açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hyaluronik Asit 35 kDa'nın Enteroid Kaynaklı Tek Katmanlı Erken İnce Bağırsak Hasarı ve İyileşmesinin In Vitro Modeline Etkisi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
In vitro çizik yara testleri, çeşitli doku tiplerinde epitel iyileşmesinin mekanizmalarını ve özelliklerini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, terminal ileumun bağırsak kriptlerinden türetilen üç boyutlu (3B) insan dışı primat enteroidlerinden iki boyutlu (2B) bir tek katman oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Bu enteroid türevi monokatmanlar daha sonra, bir insan sütü HA taklidi olan hyaluronan 35 kDa'nın (HA35) epitel yara kenarı boyunca hücre göçünü ve proliferasyonunu teşvik etme yeteneğini test etmek için in vitro çizik yara testinde kullanıldı. Tek katmanlar akıcılığa yükseltildikten sonra, manuel olarak çizildi ve HA35 (50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL) veya kontrol (PBS) ile muamele edildi. Hücre göçü ve boşluğa proliferasyon, canlı hücre görüntüleme için donatılmış bir iletilmiş ışık mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Yara kapanması, ImageJ'deki Yara İyileştirme Boyutu Eklentisi kullanılarak yara iyileşmesinin yüzdesi olarak ölçüldü. HA35 in vitro , ince bağırsak enteroid tek katmanlarında, muhtemelen yara kenarındaki hücre proliferasyonu ve yara bölgesine göçün bir kombinasyonu yoluyla, yara iyileşmesini hızlandırır. Bu yöntemler potansiyel olarak erken insan ince bağırsağında bağırsak yenilenmesini keşfetmek için bir model olarak kullanılabilir.
Giriş
Nekrotizan enterokolit (NEC) preterm bebeklerde en sık görülen gastrointestinal acillerden biridir1. Hastalık, bağırsak nekrozu, sepsis ve potansiyel olarak ölüme hızla bozulabilen şiddetli bağırsak iltihabı ile karakterizedir. Etiyolojisi belirsiz olmasına rağmen, kanıtlar NEC'nin multifaktöriyel olduğunu ve beslenmenin karmaşık bir etkileşiminin, anormal bakteriyel kolonizasyonun ve olgunlaşmamış bir bağırsak epitelinin sonucu olduğunu düşündürmektedir 2,3. Preterm bebeklerde bağırsak geçirgenliği, anormal bakteriyel kolonizasyon ve düşük enterosit rejeneratif kapasitesi
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Kurumsal onayı takiben, ayrı bir çalışma için ötenaziyi takiben, preterm insan dışı primattan (NHP,% 90 gebelik, zeytin babunu, Papio anubis) fetal ince bağırsak kolaylık örnekleri alındı (Protokol # 101523-16-039-I)20.
1. Preterm insan dışı primat 3D intestinal enteroidlerin kurulması
- Medya hazırlama
NOT: Medya, standart aseptik tekniği izleyerek kript izolasyonundan 1 hafta öncesine kadar hazırlanabilir. İstenirse primer ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
HA'nın çeşitli doku ve organlarda doku onarımı ve yara iyileşmesi üzerindeki etkileri iyi belgelenmiştir; Bununla birlikte, moleküler ağırlığı 35 kDa'lık olan HA'nın fetal veya yenidoğan ince bağırsak iyileşmesi ve rejenerasyonu üzerindeki spesifik etkileri şu anda bilinmemektedir. HA35'in fetal veya yenidoğan ince bağırsağının bir modelinde yara iyileşmesini destekleme yeteneğini test etmek için, NHP ileal dokusundan 3D bağırsak enteroidleri ürettik ve 2D enteroid türevi tek katmanlar oluşturmak için bu dokuyu tek hücre.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Preterm bir bebeğin gastrointestinal sistemi, dysbiosis, inflamatuar bakteriyel metabolitler ve toksinler ve aralıklı hipoksi23,24 ile ilişkili çevresel hakaretlere tekrar tekrar maruz kalmaktan kaynaklanan sürekli rejeneratif baskı altındadır. Ne yazık ki, preterm bebeğin bağırsak epiteli, fonksiyonel bütünlüğü hızlı bir şekilde oluşturamamaktadır23, bariyer disfonksiyonu, artmış bağırsak geçirgenliği ve ciddi vakalarda yaygın bağırsak il.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri ve çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. HC, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden P20GM134973 hibesi ile desteklenmektedir. KB, Çocuk Hastanesi Vakfı (CHF) ve Presbiteryen Sağlık Vakfı (PHF) hibesi ile desteklenmektedir. Kanser Fonksiyonel Genomik çekirdeği tarafından sağlanan canlı hücre görüntüleme hizmetleri kısmen Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Stephenson Kanser Merkezi'ne verilen Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü Hibe P20GM103639 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü Hibe P30CA225520 tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 mL Serolojik Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Çanak, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Konik tüp | VWR | 89039-666 | |
| 24 kuyulu, TC ile işlenmiş, düz tabanlı plaka | Corning | 3524 | |
| 37 & mikro; M Tersinir Hücre Süzgeci | STEMCELL Teknolojileri | 27215 | |
| 50 mL Konik tüp | VWR | 89039-658 | |
| 70 & m Steril Hücre Süzgeçleri | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albümin, Sığır (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Hücre Canlılık Testi | Promega | G9681 | |
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium/Nutrient Jambon Karışımı F-12 (DMEM-F12) 15 mM HEPES tamponu ile | STEMCELL Teknolojileri | 36254 | |
| Nazik Hücre Dissosiyasyon Reaktifi | STEMCELL Teknolojileri | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Canlı Hücre Analiz Cihazı | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Çizik Yara Analiz Yazılım Modülü | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Büyüme Ortamı (İnsan) | STEMCELL Teknolojileri | 06010 | Bu HOGMY, ancak Y-27632 veya antibiyotikler olmadan. Ayrıca HOGM için baz olarak kullanılır, ancak daha sonra sadece antibiyotikler eksiktir. |
| Escherichia coli O111:B4'ten elde edilen lipopolisakkaritler, jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılmıştır | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matrisi, Fenol Kırmızısı İçermeyen | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta İşlemli, Düz Tabanlı Mikroplaka | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Fosfat Tamponlu Salin), 1X [-] Kalsiyum, Magnezyum, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Bu geniş spektrumlu antibiyotiklerdir |
| Sodyum Hyaluronat, Araştırma Sınıfı, HA20K | Lifecore Biyomedikal | HA20K-1 | |
| TC20 Otomatik Hücre Sayacı | Şirket: Bio-Rad | 1450102 | |
| Tripsin-EDTA 1X,% 0.25 Tripsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ | 72302 |
Kaynaklar
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1(2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
