Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC'ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Bu protokol, cildin hızlı enzimatik ayrışmasını kullanarak izolasyon yöntemlerini, kültürleme koşullarını ve insan birincil hücrelerinin yüksek verim ve canlılığa sahip karakterizasyonunu açıklar. Birincil keratinositler, fibroblastlar ve Schwann hücreleri, standart bakım prosedürlerini takiben mevcut olan insan yenidoğan sünnet derisinden toplanır. Çıkarılan cilt dezenfekte edilir ve deri altı yağ ve kas bir neşter kullanılarak çıkarılır. Yöntem, epidermal ve dermal tabakaların enzimatik ve mekanik olarak ayrılmasından ve ardından bu cilt katmanlarının her birinden tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için ek enzimatik sindirimden oluşur. Son olarak, tek hücreler, haftalar boyunca büyümeyi ve canlılığı korumak için standart hücre kültürü protokollerini izleyerek uygun hücre kültürü ortamında yetiştirilir. Birlikte, bu basit protokol, cilt-sinir modellerinin in vitro değerlendirmesi için üç hücre tipinin de tek bir deri parçasından izolasyonuna, kültürlenmesine ve karakterizasyonuna izin verir. Ek olarak, bu hücreler birbirleri üzerindeki etkilerini ve in vitro travmaya verdikleri tepkileri, yara iyileşmesi ile ilişkili kültürde robotik olarak gerçekleştirilen çizikler şeklinde ölçmek için ortak kültürlerde birlikte kullanılabilir.
Giriş
Canlı dokudan türetilen ve in vitro koşullar altında kültürlenen birincil hücreler, fizyolojik durum1'e çok benzer, bu da onları fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri araştırmak için ideal bir model haline getirir. Deri, keratinositler, fibroblastlar, sebositler, melanositler ve in vitro deneyler için izole edilebilen ve kültürlenebilen Schwann hücreleri (SC'ler) dahil olmak üzere çoklu hücre tipleri içerir. Keratinositleri, fibroblastları ve SC'leri tek bir deri parçasından izole etme ve kültürleme yöntemleri tanımlanmamıştır. Bu protokolün amacı iki yönlüdür: 1) dermal SC'lerin izolasyonu ve kültürlenmesi için güvenilir ve ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tanımlanmamış insan sünnet derisi dokusunun araştırma amacıyla edinilmesi ve kullanılması gözden geçirilmiş ve Penn State College of Medicine Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB #17574) tarafından "insan araştırması değil" tespiti alınmıştır.
NOT: Aşağıdaki protokol izlenerek tek bir sünnet derisinden 2.4 x 10 6 keratinosit, 4.4 x 106 fibroblast ve 1.1 x 106 SC elde edilir. Genel olarak, bu birincil hücreler deneysel koşullara bağlı olarak 3 pasaj için kullanılabilir.
1. Primer hücrelerin izolasyonu ve kültür koşulları
- Epidermis ve dermis ayırma prosedürü
-
....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, üç farklı hücre popülasyonunu sünnet derisinin tek bir parçasından, yani keratinositlerden, fibroblastlardan ve Schwann hücrelerinden izole etmek için bir yöntemi tanımlar. Keratinositleri ve fibroblastları 2,3,5,6 izole etmek için birkaç izolasyon protokolü vardır, ancak hiçbiri SC izolasyonunu tanımlamaz. Derideki anahtar yapısal hücreler, keratinositler ve fibroblastların yanı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Diğer tüm yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Dr. Fadia Kamal ve Dr. Reyad Elbarbary'ye laboratuvar araçlarını ve teknik desteği kullanmamıza izin verdikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Pennsylvania Eyalet Üniversitesi Hershey Tıp Merkezi'nden kurumsal desteğe ek olarak, NIH (K08 AR060164-01A) ve DOD'dan (W81XWH-16-1-0725) JC E.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.22 ve mikro; M steril filtreler (Millex-GP Şırınga Filtre Ünitesi, polietersülfon), | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 & mikro; M hücreli süzgeçler | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 & M hücre süzgeçleri | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL tek kullanımlık şırıngalar | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL tek kullanımlık şırıngalar (Şırınga steril, tek kullanımlık) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL tek kullanımlık şırıngalar | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| %1 TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Kullanım sırasında hazırlanan |
| %4 paraformaldehit çözeltisi | ThermoFisher Scientific | J19943. K2 | Kullanıma ve 4 ° C'de saklanmaya hazır; C |
| % 5 BSA | Sigma | A7906-100G | Kullanım sırasında hazırlanan |
| 70 etanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiyotik | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Flakon 1-Kaset | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Kollajenaz | Gibco | 17018-029 | |
| Lamel | Fisherbrand | 12544D 22 * 50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM bazal ortam | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco'nun Ca < sup>2 + < / sup> ve Mg < sup> 2 + < / sup> (DPBS) içermeyen fosfat tamponlu salin (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj Tüpleri | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj Tüpleri | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL mikro santrifüj tüpleri | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast tam ortam | ScienCell Research | 2331 | |
| Keçi anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Seyreltme (1:500) |
| Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Seyreltme (1:500) |
| Hanks'in Tamponlu Salin Çözeltisi (HBSS tamponu) | Lonza | CC-5022 | |
| İnsan sünnet derisi | Araştırma amaçlı tanımlanmamış insan sünnet derisi dokusu (Kurumsal İnceleme Kurulu- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinosit ortamı (KGM altın ve takviyeleri) | Lonza | 00192151 ve 00192152 | |
| Fare alfa-düz kas aktin antikoru | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Seyreltme (1:200) |
| Fare Sitokeratin14 antikoru | Abcam | ab7800 | Seyreltme (1:100) |
| Fare S100 antikoru | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Seyreltme (1:200) |
| Çok odacıklı (4 kuyulu cam slayt) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Kaset | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| Invitrogen | ile Altın Solma Önleyici Mountant | P36935 | |
| Tavşan K10 antikoru | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Seyreltme (1:100) |
| Tavşan p75-NTR antikoru | Millipore | AB1554 | Seyreltme (1:500) |
| Tavşan vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Seyreltme (1:200) |
| Schwann hücre kültürü ortamı | ScienCell Research | 1701 | |
| Ekstra ince uçlu hassas cımbız DUMONT düz Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Kullanmadan |
| önce %70 alkol ile sterilize edinIRIS Makas, keskin/keskin. Uzunluk 4– 3/8 "(111mm) | Codman | 54-6500 | Kullanmadan önce %70 alkolle sterilize edin |
| Sterilize cerrahi - keskin bıçak (Duro Edge Economy Tek Kenar Bıçakları) | Tıraş bıçağı şirketi | 94-0120 | Kullanmadan önce% 70 alkolle sterilize edin |
| T25 kültür şişesi | Corning | 353109 | |
| Tripsin nötralizasyon tamponu (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Tripsin / EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Ters mikroskop | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 mikroskobu | Lekeli hücreler içeren oda lamının immünofloresanı için |
| Ters mikroskop | ZEISS | Primovert | Hücre bağlanmasını veya ayrılmasını görselleştirmek/gözlemlemek için |
Kaynaklar
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
