Yöntem makalesi

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

7.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63776

⸱

23 Mart 2022

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS), The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Dermatology, The Pennsylvania State University College of Medicine

Bu makalede

Özet

Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC'ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.

Özet

Bu protokol, cildin hızlı enzimatik ayrışmasını kullanarak izolasyon yöntemlerini, kültürleme koşullarını ve insan birincil hücrelerinin yüksek verim ve canlılığa sahip karakterizasyonunu açıklar. Birincil keratinositler, fibroblastlar ve Schwann hücreleri, standart bakım prosedürlerini takiben mevcut olan insan yenidoğan sünnet derisinden toplanır. Çıkarılan cilt dezenfekte edilir ve deri altı yağ ve kas bir neşter kullanılarak çıkarılır. Yöntem, epidermal ve dermal tabakaların enzimatik ve mekanik olarak ayrılmasından ve ardından bu cilt katmanlarının her birinden tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için ek enzimatik sindirimden oluşur. Son olarak, tek hücreler, haftalar boyunca büyümeyi ve canlılığı korumak için standart hücre kültürü protokollerini izleyerek uygun hücre kültürü ortamında yetiştirilir. Birlikte, bu basit protokol, cilt-sinir modellerinin in vitro değerlendirmesi için üç hücre tipinin de tek bir deri parçasından izolasyonuna, kültürlenmesine ve karakterizasyonuna izin verir. Ek olarak, bu hücreler birbirleri üzerindeki etkilerini ve in vitro travmaya verdikleri tepkileri, yara iyileşmesi ile ilişkili kültürde robotik olarak gerçekleştirilen çizikler şeklinde ölçmek için ortak kültürlerde birlikte kullanılabilir.

Giriş

Canlı dokudan türetilen ve in vitro koşullar altında kültürlenen birincil hücreler, fizyolojik durum1'e çok benzer, bu da onları fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri araştırmak için ideal bir model haline getirir. Deri, keratinositler, fibroblastlar, sebositler, melanositler ve in vitro deneyler için izole edilebilen ve kültürlenebilen Schwann hücreleri (SC'ler) dahil olmak üzere çoklu hücre tipleri içerir. Keratinositleri, fibroblastları ve SC'leri tek bir deri parçasından izole etme ve kültürleme yöntemleri tanımlanmamıştır. Bu protokolün amacı iki yönlüdür: 1) dermal SC'lerin izolasyonu ve kültürlenmesi için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmak ve 2) keratinositlerin, fibroblastların ve SC'lerin tek bir insan sünnet derisinden izolasyonu için etkili, sağlam bir yöntem kullanmak.

Şu anda, deri keratinositleri 2,3,4 ve fibroblastları 5,6'yı izole etmek için belirlenmiş protokoller vardır. Bu çalışmalar, keratinositlerin, fibroblastların veya her ikisinin deriden izolasyonunu tanımlamaktadır, ancak hiçbir protokol, birincil SC'lerin kültürlerinin insan derisinden nasıl oluşturulacağını ele almamaktadır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nöronal SC'lerin keratinosit ve fibroblast hücresel süreçlerini modüle ettiğini ve normal cilt fizyolojik fonksiyonlarını düzenlediğini göstermektedir7. SC'ler bu nedenle cilt homeostazı için kritik öneme sahiptir ve mevcut komşu cilt hücresi tiplerinin davranışını etkileyen düzenleyici fizyolojiye önemli ölçüde katkıda bulunur8. Bu nedenle, bu hücre tiplerinin her birinin izolasyonuna izin veren bir protokol, hücre-hücre iletişimi veya hücre tipleri arasında çapraz konuşmayı içeren in vitro deneyler için idealdir.

Bu protokol, tek bir deri parçasından birincil hücrelerin bireysel hücre kültürlerinin kurulmasını tanımlar. Bu protokol, mevcut doku miktarı sınırlı olduğunda özellikle yararlıdır. Ayrıca, üç hücre tipinin de tek bir donörden izole edilmesi, istenen deney sırasında genetiğin etkisini azaltırken, hücre tipleri veya ko-kültür deneyleri arasında sağlam karşılaştırmalara izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tanımlanmamış insan sünnet derisi dokusunun araştırma amacıyla edinilmesi ve kullanılması gözden geçirilmiş ve Penn State College of Medicine Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB #17574) tarafından "insan araştırması değil" tespiti alınmıştır.

NOT: Aşağıdaki protokol izlenerek tek bir sünnet derisinden 2.4 x 10 6 keratinosit, 4.4 x 106 fibroblast ve 1.1 x 106 SC elde edilir. Genel olarak, bu birincil hücreler deneysel koşullara bağlı olarak 3 pasaj için kullanılabilir.

1. Primer hücrelerin izolasyonu ve kültür koşulları

  1. Epidermis ve dermis ayırma prosedürü
    1. Yenidoğan sünnet derisini, onaylanmış hastane düzenleyici protokolleri kapsamında bir doktor tarafından standart bakım prosedürlerini izleyerek edinin. Doğumdan sonra sünnetin zamanlamasını ve çıkarılan deri miktarını hekim belirler.
    2. Eksize edilen sünnet derisini, 8-10 mL buz gibi soğuk Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) bazal ortamını içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve sünnet derisini derhal hücre izolasyonu için hücre kültürü laboratuvarına taşıyın. 1x antibiyotik/antimikotik içeren 20-25 mL 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile cildi iki kez durulayın.
      NOT: Maksimum hücre canlılığı için, eksize edilen sünnet derisi işlenene kadar 4 ° C'ye yerleştirilmeli ve hücreler 24 saat içinde toplanmalıdır.
    3. DPBS / antibiyotiklerde duruladıktan sonra, sünnet derisini 10 cm'lik bir doku kültürü kabında 10-15 dakika boyunca 25-30 mL buz gibi soğuk DMEM bazal ortamında ıslatın. Steril teknik kullanarak bir doku kültürü davlumbazındaki tüm işleme adımlarını gerçekleştirin.
    4. Bir neşter kullanarak, sünnet derisini dikkatlice dilimleyin ve dermis ve deri altı yağ dokusunu açığa çıkarın.
    5. Deri altı yağ dokusunu forseps, neşter bıçağı ve makas kullanarak gerektiği gibi çıkarın. Yağ dokusunu atın. Temizlenmiş sünnet derisini üç ila beş küçük parçaya bölün.
    6. Cilt parçalarını 16-20 mL dispase-I/DMEM ortamı (DMEM bazal ortamında 4 mg/mL) içeren steril bir konik tüpe aktarın.
    7. Konik tüpteki cilt parçalarını, dispase-I ile inkübasyonun ilk 30 dakikası boyunca aralıklı olarak ters çevirerek karıştırın. Daha sonra konik tüpü 16-18 saat boyunca 4 ° C'ye yerleştirin, cilt parçalarını dispase-I / media'ya batırmaya dikkat edin.
      NOT: Dispase-I çözeltisi, soğuk DMEM bazal ortamı kullanılarak eklemeden hemen önce hazırlanmalı, 0,22 μm süzgeç ile filtrelenmeli ve 4 °C'de tutulmalıdır.
    8. Dispase-I ile gece boyunca sindirimden sonra, cilt parçalarını çıkarın ve kuru, steril, kültür kabına yerleştirin. Dış epidermal tabakanın kültür kabına dokunması için her bir cilt parçasını açın.
    9. İki forseps seti kullanarak, epidermisi dermisten dikkatlice ayırın. Dokunun kenarından başlayın ve epidermisi dermisten uzaklaştırın.
      NOT: Epidermis tabakasının dermisten ayrılması zorsa, dispase-I sindirimi yeterli değildi. Sorun giderme seçenekleri: 1) cilt parçalarını dispase-I / DMEM çözeltisine geri döndürün ve 4 ° C'de 2-3 saat daha inkübe edin; 2) cilt parçalarını taze dispase-I / DMEM'e yerleştirin ve 4 ° C'de 2-3 saat daha inkübe edin.
    10. Keratinositleri (epidermis) ve fibroblastları ve Schwann hücrelerini (dermis) izole etmek için ayrılmış epidermis ve dermisi kullanın.
      NOT: Belirli hücre tiplerinin izolasyonu ve kültür koşulları için aşağıdaki adımları izleyin.
  2. Epidermisten keratinosit izolasyonu
    1. 10 cm'lik bir kültür kabına 5 mL HEPES tampon salin (HBS) ekleyin ve ayrılmış epidermis parçalarını ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca inkübe edin.
    2. HBS inkübasyonundan sonra, HBS çözeltisini 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın. 50 mL'lik bir konik tüpe 5 mL tripsin nötralizasyon tamponu (TNB) (Malzeme Tablosu) ekleyin ve bir kenara koyun.
    3. Epidermal fragmanlara 3 mL tripsin çözeltisi ekleyin. 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    4. Tripsin çözeltisi bulanıklaşana kadar forseps kullanarak epidermal parçaları nazikçe çalkalayın.
    5. Tripsin çözeltisini/keratinositleri adım 1.2.2'de HBS ve TNB içeren tüpe ekleyin.
    6. İlk tripsin sindiriminde çözünmemiş kalan epidermal fragmanlar için, 3 mL% 0.25 tripsin / Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin. 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve 1.2.4 ve 1.2.5 adımlarını tekrarlayın.
    7. HBS ve TNB solüsyon tüplerini içeren tripsin/EDTA çözeltisine 2 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
    8. HBS/TNB/tripsin ve keratinositleri içeren toplama tüpünü 870 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    9. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 3 mL keratinosit tam büyüme ortamında yeniden askıya alın (Malzeme Tablosu).
    10. Kalıntıları gidermek için hücre süspansiyonunu steril bir 100 μM filtre ile steril 50 mL konik bir tüpe filtreleyin.
    11. Hücre sayısını ve hücre canlılığını ölçün.
      NOT: Burada, üreticinin talimatlarını izleyerek hücre sayısını ve canlılığını ölçmek için özel bir hücre örnekleme ve boyama cihazı (Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.
    12. Deneyler için gerektiğinde tohum kültürü plakaları. Önerilen tohumlama yoğunluğu ~ 45.000 hücre /cm2'dir.
    13. Keratinositlerin yemeğe yapışmasını sağlamak için kültür plakalarını 37 ° C'de% 5 CO2'de 2 gün boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
    14. 2 gün sonra, yapışmamış hücreleri aspire edin. Keratinositler pasaj veya aşağı akış deneyleri için istenen birleşime ulaşana kadar hücre kültürü ortamını her gün yenileyin (% 50 -% 80 birleşme).
  3. Schwann hücrelerinin (SC'ler) ve fibroblastların dermisten izolasyonu
    1. 5 mL 1x DPBS kullanarak poli-L-lizin (PLL, 0,01 μg/μL) ile ön kat T25 şişeler. Önceden kaplanmış şişeleri 3 saat boyunca 37 °C'ye yerleştirin. PLL kaplama matrisini 1x DPBS (5 mL) kullanarak iki kez yıkayın.
      NOT: T25 şişeler önceden hazırlanabilir.
    2. Dermisin izole edilmiş parçalarını 5 mL DMEM bazal ortamı ile durulayın.
    3. Dermisi makas veya neşterle küçük parçalara ayırın.
    4. Kıyılmış dermisi 5 mL kollajenaz (DMEM bazal ortamında 2 mg / mL) ile 37 ° C'de 2.5 saat boyunca sindirin. Kıyılmış dermisi, dermis tamamen ayrışana kadar her 30 dakikada bir pipet ucu ile nazikçe tritüre edin.
    5. Hücre süspansiyonunu 70 μM hücre süzgeci ile filtreleyin. Süspansiyonu tamamen filtrelemek için 1 mL'lik bir şırınga kullanarak mekanik kuvvet uygulamak gerekir.
    6. Kollajenazın enzimatik aktivitesini durdurmak için filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 5 mL tam DMEM ortamı (DMEM bazal ortamı +% 5 FBS + 1x antibiyotik) ile seyreltin.
    7. Hücreleri peletlemek için RT'de 5 dakika boyunca 870 x g'de hücre süspansiyonunu santrifüj edin.
    8. Bu hücre peletinden hem fibroblastlar hem de SC'ler elde edilecektir. Hücreleri bölmek için hücre peletini 2 mL DMEM tam ortamında yeniden askıya alın (1 mL hücre süspansiyonu / tüpü) ve RT'de 5 dakika boyunca 870 x g'de santrifüj yapın.
    9. SC kültürü için 1.3.10-1.3.17 adımlarını izleyin ve fibroblast kültürü için 1.3.18-1.3.22 adımlarını izleyin.
    10. Adım 1.3.8'den itibaren, süpernatanı aspire edin. Hücre peletini 5 mL taze DMEM tam ortamında yeniden askıya alın.
    11. Hücre sayısını ve canlılığını ölçün.
      NOT: Burada, üreticinin talimatlarını izleyerek hücre sayısını ve canlılığını ölçmek için özel bir hücre örnekleme ve boyama cihazı (Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.
    12. Önceden kaplanmış T25 şişeleri, 4.0 x 103 hücre/mL yoğunlukta 5 mL yeniden askıya alınmış hücre ile tohumlayın. Şişeyi gece boyunca% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de inkübe edin (~ 12-16 saat inkübasyon).
    13. 16 saat sonra, 10x büyütmede mikroskopi (Malzeme Tablosu) ile hücre yapışmasını onaylayın.
    14. Yapışkan olmayan hücreleri çıkarın ve şişeyi 3x, 5 mL 1x DPBS ile yıkayın.
    15. DMEM tam ortamına 5 mL 10 μM sitozin arabinozid (antimitotik ajan, fibroblastları öldürür) ekleyin. Şişeyi 37 °C'de 24 saat boyunca% 5 CO2 varlığında inkübe edin.
    16. Sitozin arabinozid içeren ortamı şişeden aspire edin. Şişeyi 5 mL 1x DPBS ile 3x durulayın.
    17. Kültür şişesini 5 mL SC komple kültür ortamı (Malzeme Tablosu) ile doldurun ve 48 saat boyunca% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de inkübe edin. SC'ler %80 birleşime ulaşana kadar SC komple kültür ortamını her gün yenileyin.
    18. Süpernatantı ayrışmış dermal tabakadan aspire edin (adım 1.3.8) ve hücre peletini 5 mL fibroblast tam ortamı (fibroblast bazal ortamı +% 5 FBS + 1x antibiyotik) ile yeniden askıya alın.
    19. Hücre sayısını ve hücre canlılığını ölçün.
      NOT: Burada, üreticinin talimatlarını izleyerek hücre sayısını ve canlılığını ölçmek için özel bir hücre örnekleme ve boyama cihazı (Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.
    20. Fibroblastları, 5 mL fibroblast tam ortamı kullanarak T25 kültür şişelerinde (önceden kaplanmamış) 4.0 x 103 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğunda plakalayın. Gece boyunca% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de inkübe edin (~ 12-16 saat inkübasyon).
    21. 16-24 saat sonra, 10x büyütmede mikroskopi (Malzeme Tablosu) ile hücre yapışmasını onaylayın. Yapışkan olmayan hücreleri şişeden aspire edin ve şişeyi 5 mL 1x DPBS ile iki kez yıkayın.
    22. 5 mL taze fibroblast tam ortam ekleyin ve 48 saat boyunca% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de inkübe edin. Fibroblastlar pasaj veya aşağı akış tahlilleri için istenen birleşime ulaşana kadar kültür ortamını her gün yenileyin (% 50 -% 80 birleşim).

2. Epidermal keratinositlerin, dermal SC'lerin ve fibroblastların protein belirteçlerinin immünofloresan ile doğrulanması

  1. 1. Gün - Kat hazneli cam kızaklar ve hücreleri ayırın
    1. Keratinositler için kollajen-I veya SC'ler için PLL veya fibroblastlar için sadece 1x DPBS (her bir kuyucuk için 0,5 mL) ile ön kaplamalı 4 delikli cam slaytlar. Tüm yüzeyi kapladığınızdan emin olun. Kuluçka odası 2 saat boyunca 37 °C'de kayar. Kuluçka sırasında hücreleri hazırlayın.
    2. Kültürlenmiş hücreler% 50 -% 80 birleşime ulaştıktan sonra, şişeleri 1x DPBS 3x (her kuyucuk için 1 mL) ile yıkayın.
    3. Yapıştırılan hücreleri, hücreler yuvarlanmaya başlayana kadar, 2 dakika boyunca% 5 CO 2 varlığında 37 ° C'de inkübe ederek%0.25 tripsin-EDTA (TE) çözeltisinin 5 mL'si ile ayırın. Hücre ayrılmasını mikroskopi (Malzeme Tablosu) ile 10x büyütmede görselleştirin.
    4. Kuluçkadan sonra, TE çözeltisini içeren hücreleri 5 mL fetal sığır serumu (FBS) içeren konik bir tüpe aktarın.
    5. Kültür şişesine 5 mL tripsin nötralizasyon tamponu (TNB) ekleyin ve ardından içeriği yukarıda belirtilen santrifüj tüpüne (TE ve FBS'li hücreler) aktarın. Hücre ayrılmasını mikroskopi (Malzeme Tablosu) ile 10x büyütmede görselleştirin.
      NOT: TNB veya FBS veya her ikisi de tripsin aktivitesini nötralize etmek için kullanılabilir.
    6. Hücreler/TE/TNB içeren konik tüpü 870 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı başka bir tüpe aktarın ve hücre peletini karşılık gelen tam kültür ortamında yeniden askıya alın. Adım 1.2.11'de belirtildiği gibi hücre canlılığını ölçün.
    7. Önceden kaplanmış hazneli cam kızakları (adım 2.1.1) 1x DPBS (her kuyucuk için 1 mL) 3x ile durulayın.
    8. Doku kültürü davlumbazının içindeki slaytları ve tohum keratinositlerini, SC'leri veya fibroblastları uygun bir yoğunlukta (30.000 hücre / 0.5 mL / oda) uygun bir tam hücre kültürü ortamında yarı kurulayın.
    9. Hücrelerin yapışmasına izin vermek için oda kızaklarını gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. 2. Gün - Sığır Serum Albümini (BSA) ve primer antikor inkübasyonu ile hazneli cam kaydırağın bloke edilmesi
    1. Hücre ortamını oda kızaklarından aspire edin ve 1 mL 1x DPBS ile 3x'i yıkayın.
    2. Yapıştırılan hücreleri 1x DPBS'de (her bir kuyucuk için 1 mL) %4 paraformaldehit ile sabitleyin ve doku kültürü başlığının içindeki RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    3. Oda slaytlarından% 4 paraformaldehit aspire edin ve oda slaytlarını 1x DPBS (her kuyucuk için 1 mL) ile 3x yıkayın.
    4. Hücre zarlarını 1x DPBS'de (her kuyucuk için 1 mL) %1 TritonX-100 ile geçirgenleştirin ve RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    5. Blokaj çözeltisini hazne kızaklarından aspire edin, 30 s boyunca 1x DPBS (her kuyucuk için 1 mL) ile 3x'i yıkayın ve ardından kuyudan 1x DPBS'yi aspire edin.
    6. Oda kızaklarını %5 BSA (her kuyucuk için 0,5 mL) ile bloke edin ve RT'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.
    7. Blokaj çözeltisini hazne kızaklarından aspire edin, her biri 30 s boyunca 1x DPBS (her kuyucuk için 1 mL) ile 3x'i yıkayın ve ardından kuyudan 1x DPB'yi aspire edin.
    8. Birincil antikorları% 5 BSA (her kuyucuk için 0.2 mL) ile seyreltin (Birincil antikorlar seyreltmeleri: Keratinositler: fare sitokeratin 14 antikoru (1:100) ve sitokeratin 10 antikoru (1:100); Schwann hücreleri: fare S100 antikoru (1:200) ve tavşan sinir büyüme faktörü reseptörü (p75-NTR) antikoru (1:500); Fibroblastlar: tavşan vimentin antikoru (1:200) ve fare alfa-düz kas aktini (α-SMA) antikoru (1:200)).
    9. Birincil antikorları hazneli cam slayt üzerindeki karşılık gelen hücrelere ekleyin ve nemlendirilmiş bir odada 4 ° C'de yaklaşık 15-16 saat (gecelik) inkübe edin.
    10. Birincil antikorları oda slaytlarından aspire edin, her biri 30 s için 1x DPBS (her kuyucuk için 1 mL) ile 3 kez yıkayın ve ardından kuyudan 1x DPBS'yi aspire edin.
    11. İkincil antikorları (Keçi anti-tavşan IgG Sekonder Antikor-Alexa Fluor 488 (1:500) ve Keçi anti-Fare IgG Sekonder Antikoru-Alexa Fluor 594 (1:500)) %0.5 BSA ile seyreltin. Her bir kuyucuğa uygun ikincil antikor ekleyin (her kuyucuk için 0.2 mL). RT'de 45 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
    12. Sekonder antikoru hazne slaytlarından aspire edin, her biri 30 s boyunca 1x DPBS (her kuyucuk için 1 mL) ile 3x'i yıkayın ve ardından kuyudan 1x DBPS'yi aspire edin.
    13. Conta sökücüyü kullanarak 4 delikli odacıklı sürgü üzerindeki contayı çıkarın. Slayt üzerinde herhangi bir yapıştırıcı bırakmamaya çalışın, çünkü bu kapak kaydırma uygulamasına müdahale eder. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile bir damla montaj ortamı ekleyin. Alternatif olarak, kuyucukları DAPI ile karşı lekeleyin ve etiket içermeyen bir montaj ortamı kullanın.
    14. Hava kabarcıklarından kaçınarak kapak kaymasını cam sürgü üzerine dikkatlice yerleştirin ve kapak kaymasının ucunu yapıştırıcı ile kapatın. İmmünofloresan boyama modellerini mikroskopi (Malzeme Tablosu) ile 10x ve / veya 20x büyütmede gözlemleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

figure-results-1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, üç farklı hücre popülasyonunu sünnet derisinin tek bir parçasından, yani keratinositlerden, fibroblastlardan ve Schwann hücrelerinden izole etmek için bir yöntemi tanımlar. Keratinositleri ve fibroblastları 2,3,5,6 izole etmek için birkaç izolasyon protokolü vardır, ancak hiçbiri SC izolasyonunu tanımlamaz. Derideki anahtar yapısal hücreler, keratinositler ve fibroblastların yanı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Diğer tüm yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Dr. Fadia Kamal ve Dr. Reyad Elbarbary'ye laboratuvar araçlarını ve teknik desteği kullanmamıza izin verdikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Pennsylvania Eyalet Üniversitesi Hershey Tıp Merkezi'nden kurumsal desteğe ek olarak, NIH (K08 AR060164-01A) ve DOD'dan (W81XWH-16-1-0725) JC E.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 ve mikro; M steril filtreler (Millex-GP Şırınga Filtre Ünitesi, polietersülfon),MilliporeSigmaSLGPR33RS
70 & mikro; M hücreli süzgeçlerCELLTREAT229483
100 & M hücre süzgeçleriCELLTREAT229485
1 mL tek kullanımlık şırıngalarBD Luer-LokBD-309659
5 mL tek kullanımlık şırıngalar (Şırınga steril, tek kullanımlık)BD Luer-LokBD309646
10 mL tek kullanımlık şırıngalarBD Luer-LokBD305462
%1 TritonX-100SigmaX100-1LKullanım sırasında hazırlanan
%4 paraformaldehit çözeltisiThermoFisher ScientificJ19943. K2Kullanıma ve 4 ° C'de saklanmaya hazır; C
% 5 BSASigmaA7906-100GKullanım sırasında hazırlanan
70 etanolPharmco111000200
AntibiyotikScienCell Research503
Chemometec Flakon 1-KasetFisher ScientificNC1420193
KollajenazGibco17018-029
LamelFisherbrand12544D 22 * 50-1.5
Dispase ISigma-AldrichD46693
DMEM bazal ortamScienCell Research9221
Dulbecco'nun Ca < sup>2 + < / sup> ve Mg < sup> 2 + < / sup> (DPBS) içermeyen fosfat tamponlu salin (DPBS)Corning  21-031-CV)
Nunc 15 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj TüpleriThermoFisher Scientific339651
Nunc 50 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj TüpleriThermoFisher Scientific339653
1.5 mL mikro santrifüj tüpleriFisherbrand02-681-5
Fetal sığır serumu (FBS)ThermoFisher Scientific10082147
Fibroblast tam ortamScienCell Research2331
Keçi anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032Seyreltme (1:500)
Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488InvitrogenA11008Seyreltme (1:500)
Hanks'in Tamponlu Salin Çözeltisi (HBSS tamponu)LonzaCC-5022
İnsan sünnet derisiAraştırma amaçlı tanımlanmamış insan sünnet derisi dokusu (Kurumsal İnceleme Kurulu- IRB #17574).
KGM-GOLD keratinosit ortamı (KGM altın ve takviyeleri)Lonza00192151 ve 00192152
Fare alfa-düz kas aktin antikoruThermoFisher Scientific14-9760-82Seyreltme (1:200)
Fare Sitokeratin14 antikoruAbcamab7800Seyreltme (1:100)
Fare S100 antikoruThermoFisher ScientificMA5-12969Seyreltme (1:200)
Çok odacıklı (4 kuyulu cam slayt)Tab-Tek154526
NucleoCounter -Via1-KasetChemometec941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL)ScienCell Research32503
Invitrogenile Altın Solma Önleyici MountantP36935
Tavşan K10 antikoruSigma-AldrichSAB4501656Seyreltme (1:100)
Tavşan p75-NTR antikoruMilliporeAB1554Seyreltme (1:500)
Tavşan vimentinProteinTech10366-1-APSeyreltme (1:200)
Schwann hücre kültürü ortamıScienCell Research1701
Ekstra ince uçlu hassas cımbız DUMONT düz Dumostar, 5ROTHLH75.1Kullanmadan
önce %70 alkol ile sterilize edinIRIS Makas, keskin/keskin. Uzunluk 4– 3/8 "(111mm)Codman54-6500Kullanmadan önce %70 alkolle sterilize edin
Sterilize cerrahi - keskin bıçak (Duro Edge Economy Tek Kenar Bıçakları)Tıraş bıçağı şirketi94-0120Kullanmadan önce% 70 alkolle sterilize edin
T25 kültür şişesiCorning353109
Tripsin nötralizasyon tamponu (TNS)LonzaCC-5002
Tripsin / EDTALonzaCC-5012
Ters mikroskopZEISSAxio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 mikroskobuLekeli hücreler içeren oda lamının immünofloresanı için
Ters mikroskopZEISSPrimovertHücre bağlanmasını veya ayrılmasını görselleştirmek/gözlemlemek için
% ProLong DAPI

Kaynaklar

  1. Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
  2. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
  3. Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
  4. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  5. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033(2010).
  6. Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629(2020).
  7. Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
  8. Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
  9. Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
  10. Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487(2015).
  11. Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
  12. Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
  13. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
  14. Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442(2020).
  15. Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
  16. Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Primer KeratinositlerPrimer Fibroblastlarnsan S nnet Derisi H creleriH cre zolasyon ProtokolEnzimatik DisosyasyonH cre K lt r Y ntemlerimm nofloresan BoyamaH cre Tipi Karakterizasyonun Vitro Cilt Modelleri

İlgili makaleler