Mikoheterotrofik Bitki Dokularında Mantar Kolonizasyonunu Yorumlamak ve Tohumların Simbiyotik Çimlenmesi için Mikroskopi Teknikleri

Özet

Bu protokol, mikoheterotrofik bitki örneklerinin toplanması, sabitlenmesi ve sürdürülmesi için ayrıntılı prosedürler sağlamayı, mikorizal mantarlarla çimlenmiş bitki dokularında ve tohumlarda mantar kolonizasyonunu incelemek için tarama ve iletim elektron mikroskobu, ışık, konfokal ve floresan mikroskobu gibi farklı mikroskopi tekniklerini uygulamayı amaçlamaktadır.

Özet

Yapısal botanik, bitkilerin ekolojisini, fizyolojisini, gelişimini ve evrimini tam olarak anlamak için vazgeçilmez bir bakış açısıdır. Mikoheterotrofik bitkileri (yani, mantarlardan karbon elde eden bitkileri) araştırırken, yapısal adaptasyonlarının dikkat çekici yönleri, mantarlar tarafından doku kolonizasyonu kalıpları ve yeraltı organlarının morfoanatomisi, gelişim stratejilerini ve besin kaynağı olan hiflerle ilişkilerini aydınlatabilir. Simbiyotik mantarların bir diğer önemli rolü orkide tohumlarının çimlenmesi ile ilgilidir; Tüm Orchidaceae türleri, çimlenme ve fide aşamasında (ilk mikoheterotrofi), hatta yetişkin aşamalarında fotosentez yapanlar bile mikoheterotrofiktir. Orkide tohumlarında besin rezervlerinin bulunmaması nedeniyle, mantar simbiyontları substratlar sağlamak ve çimlenmeyi sağlamak için gereklidir. Çimlenme aşamalarını yapısal perspektiflerle analiz etmek, mantarların tohumlarla etkileşimi ile ilgili önemli soruları da cevaplayabilir. Bu makalede önerildiği gibi, bitki dokularındaki mantar endofitlerini ortaya çıkarmak için farklı görüntüleme teknikleri uygulanabilir. Bitki organlarının serbest ve ince bölümleri boyanabilir ve daha sonra ışık mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir. Buğday tohumu aglutininine konjuge edilmiş bir florokrom, mantarlara uygulanabilir ve konfokal mikroskopide bitki hücre duvarlarını vurgulamak için Calcofluor White ile birlikte inkübe edilebilir. Ek olarak, tarama ve iletim elektron mikroskobu metodolojileri mikoheterotrofik orkideler için detaylandırılmıştır ve bu protokollerin ilgili bitkilerde uygulanması olanakları araştırılmaktadır. Orkide tohumlarının simbiyotik çimlenmesi (yani, mikorizal mantarların varlığında), protokolde, çimlenmenin farklı aşamalarından elde edilen yapıların ışık, konfokal ve elektron mikroskobu ile analizler için hazırlanması olanakları ile birlikte ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Giriş

Bitki morfolojisi ve anatomisini kapsayan botanik alanındaki yapısal araştırmalar, tüm organizmayı anlamada temeldir^1,2 ve bitkilerin ekolojisi, fizyolojisi^, gelişimi ve evrimi ile ilgili bilgileri bütünleştirmek ve katkıda bulunmak için vazgeçilmez perspektifler sağlar³. Bitki morfolojisi ve anatomisindeki yöntemler şu anda yakın zamanda ve bir asırdan fazla bir süre önce geliştirilen protokolleri, ekipmanları ve bilgileri içermektedir². Klasik yöntemlerin (örneğin, ışık mikroskobu) ve daha yeni tekniklerin (örneğin, konfokal mikroskopi, X-ışını mikrotomografisi) sürekli olarak uygulanması ve uyarlanması aynı temel temele sahiptir: bir metodolojinin geliştirilmesini sağlayan teorik bilgi.

Bitki anatomisi ve morfolojisinde ana araç görüntüdür. Bu tür analizlerin basit gözlemler olduğu yanılgısına rağmen, öznel yorumlara yer vermek², bu alandaki görüntüleri analiz etmek ve anlamak, uygulanan yöntemler (ekipman, analiz türü, metodolojik prosedürler), hücre bileşenleri, histokimya ve bitki gövdesi (doku organizasyonu ve fonksiyonu, ontojeni, morfolojik adaptasyonlar) hakkında bilgi gerektirir. Çeşitli yöntemlerle elde edilen görüntülerin yorumlanması, form ve fonksiyonun ilişkilendirilmesine, bir yapının kimyasal bileşiminin deşifre edilmesine, taksonların tanımlanmasında doğrulanmasına, fitopatojenlerin enfeksiyonlarının anlaşılmasına ve diğer bu tür değerlendirmelere yol açabilir.

Mikoheterotrofik (MH) bitkileri (yani, mikorizal mantarlardan karbon elde eden fotosentetik olmayan bitkiler^4,5) araştırırken, yapısal adaptasyonlarının dikkat çekici yönleri, mantarlar tarafından doku kolonizasyonu kalıpları ve yeraltı organlarının morfoanatomisi^, gelişim stratejilerini ve besin kaynağı olan hiflerle ilişkilerini aydınlatabilir. MH bitkilerinin yeraltı organları genellikle toprak mantarları ile olan ilişkileriyle ilgili önemli adaptasyonlar gösterir, bu nedenle bu anatomik ve morfolojik araştırmaların yapılması esastır⁶. MH türlerinin hava organları göz ardı edilmemelidir, çünkü endofitler mikorizal mantar olmasalar bile bu dokularda da bulunabilir (kişisel gözlemler, henüz yayınlanmamıştır).

Mikorizal mantarların MH türleri ile tüm yaşam döngüleri^boyunca 7 olan ilişkisinin köklü özünün yanı sıra, her orkide türü, ototrofik olanlar bile, doğal ortamlarda başlangıçta zorunlu bir mikoheterotrofik aşamaya sahiptir. Orkidelerin embriyosunun farklılaşmamış olması ve endosperm veya kotiledonlardan yoksun olması, dolayısıyla mantar ortaklarının beslenme desteği olmadan doğal ortamlarda kendini geliştirememesi ve kuramamasıdır ^4,8. Simbiyotik çimlenme protokollerinin sadece MH türlerine değil, aynı zamanda fotosentez yapan orkidelere de uygulanabileceği göz önüne alındığında, çimlenme ve protocorm gelişiminde orkide-mantar özgüllüğünü araştırmayı amaçlayan, tehdit altındaki türlerin korunmasına yönelik girişimlerde çok uygulanan bir metodoloji ^9,10,11.

Bu yöntem derlemesinde, anatomik çalışmalar için MH bitki örneklerinin toplanması, sabitlenmesi ve depolanması (bölüm 1), yüzey analizi ve numune seçimi (bölüm 2), bölümleme yöntemleri (serbest: bölüm 3, mikrotomi: bölüm 4, kriyomikrotomi: bölüm 5), boyama ve montaj (bölüm 6), mantar endofitlerinin floresan ve konfokal mikroskopisi (bölüm 7), taramalı elektron mikroskobu (bölüm 8), ve transmisyon elektron mikroskobu (bölüm 9). Ek olarak, orkide tohumları için simbiyotik çimlenme yöntemini (MH ve ototrofik, bölüm 10) tanımlamaktayız, çünkü daha önce bahsedilen görüntüleme yöntemleri, çimlenme sürecinde tohumların, protokormların ve fidelerin mantar kolonizasyonunu analiz etmek için başarıyla uygulanabilir.

Şekil 1: Görüntüleme yöntemlerinin şematik özeti. Şemalar, ayrıntılı olarak açıklandığı protokol adımlarının göstergelerini sağlar. Kısaltmalar: GMA = glikol metakrilat, OCT = optimal kesme sıcaklığı bileşiği, SEM = taramalı elektron mikroskobu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Burada ayrıntılı olarak açıklanan mikroskopi teknikleri (Şekil 1) aşağıdaki temel adımlardan önce gelir: numunelerin toplanması, sabitlenmesi, dehidrasyonu, gömülmesi ve bölümlenmesi. Seçilen teknik(ler)e bağlı olarak adımlar değişken olduğundan (Şekil 1), hazırlanacak ve toplama alanına taşınacak fiksatörleri, numunelerin sabitlemeden önce nasıl hazırlanması gerektiğini, kullanılacak dehidrasyon işlemlerini (bölüm 1) ve farklı gömme olanakları ve kesitleme yöntemlerini (bölüm 4, 5, ve 9). Şekil 1 , aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan her mikroskopi tekniği için gerekli tüm adımları sırayla özetlemektedir.

Protokol

1. Numunelerin toplanması, sabitlenmesi ve bakımı

NOT: Tamamen MH bitkileri genellikle 12,13 numaralı karanlık ormanda, çoğunlukla nemli ve çöp içeren alanlarda bulunabilirken, kısmen MH bitkileri daha açık ormanlarda^{bulunabilir 12,13}. MH bitkileri genellikle çeşitli şekil ve boyutlarda iyi gelişmiş yeraltı organlarına sahiptir.

1. MH türlerini toplarken, bitki tabanının etrafındaki toprağı keşfedin, yeraltı organlarına zarar vermemeye dikkat edin ve hava organlarının yeraltı organlarından ayrılmasını önlemek için bitkileri yerden çekmekten kaçının.
2. Kökler, gövdeler, rizomlar ve depolama organları gibi yeraltı organlarını bu yapılara zarar vermeden keşfederken bir bahçe mala kullanarak hava yapılarını dikkatlice kazın.
3. Kırılgan yapıları korumak için toprak parçacıklarını çıkarın ve numuneleri sabitlemeden önce kalan toprak parçacıklarını durulamak için bu organları musluk suyuyla hassas bir şekilde yıkayın.
4. Yaprak çöpü ile ilişkili MH bitkileri ekstra dikkat gerektirir; Ayrışan malzemeye hifleri aracılığıyla bağlı organları dikkatlice toplayın, bu organları bağlı yapılardan çekmekten kaçının ve bu parçalar oldukça hassas olduğu için dikkatlice toplayın. Bu tür bağlantılara sahip yapıları koruyun ve çöpü analiz için de toplayın.
5. Görüntüleme tekniklerini kullanarak taze malzemeyi analiz etmeyi tercih ediyorsanız, numuneleri yeterli neme sahip, yeterli su buharlaşan ve bitkiyi nemlendiren kapalı plastik torbalarda saklayın ve aşırı suyun numunelerle temas etmesini önleyin. Onları derhal laboratuvara taşıyın ve numuneleri toplandıkları gün analiz edin, analiz ederken numunelerin hala korunup korunmadığına dikkat edin.
6. Fiksatörleri iyi kapatılmış kaplarda toplama alanına taşıyın. Işık mikroskobu (LM) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) için toplandıktan sonra aşağıdaki fiksatörlerden herhangi birinde örnekleri hızlı bir şekilde sabitleyin: % 10 nötr tamponlu formalin (NBF¹⁴, Tablo 1) veya Karnovsky'nin çözeltisi (modifiye^{edilmiş 15}, Tablo 2). Karnovsky'nin çözeltisi, tarifi Tablo 3'te açıklanan 0.2 M fosfat tamponu¹⁵ ile hazırlanabilir.
7. İletim elektron mikroskobu (TEM) ile analiz için, bir damla glutaraldehit-sodyum kakodilat tamponu (modifiye^{edilmiş 16}, Tablo 4) içinde 4-3 mm kalınlığındaki numuneleri 1-2 mm kalınlığında daha küçük bölümlere ayırın. Damlanın dışında kesilmiş kenarları atın. Bölümleri, numunelerin hacminden 10 kat daha fazla fiksatif hacme sahip bir toplama tüpüne derhal aktarın, çünkü bu bir katkı fiksatifi (yani, molekülleri kimyasal olarak sabitlenmiş proteinlere eklenir¹⁶).
   DİKKAT: Tarif edilen üç fiksatif oldukça toksiktir. Özellikle sahada kullanımları sırasında solumaktan kaçının. Tüm fiksatörleri eldiven kullanarak bir duman davlumbazında hazırlayın. Kakodilat ve asitleri karıştırmayın, çünkü arsenik gazı oluşabilir¹⁶.
8. Sabit numuneler fiksatif içinde yüzerse, bu bitki dokularında gazın varlığını gösterir. Hava ve diğer gazlar, fiksatifin tüm numuneye nüfuz etmesini önler². Gazı, daha küçük parçalar halinde yeniden örnekleyerek ve tüm numuneler çözeltinin dibine batana kadar bir vakum pompası (-300 ila -400 inHg basınç) kullanarak dokulardan çıkarın¹⁷. Pompa tarafından uygulanan aşırı basınç numunelere zarar verebileceğinden dikkatli olun.
9. Karnovsky'nin çözeltisinde en az 48 saat veya% 10 NBF'den sonra, numuneleri 0.2 M PB'de yıkayın (Tablo 3) ve% 10,% 30,% 50 ve son olarak% 70 etanol serisi ile dehidre edin. Hassas numuneler için, her konsantrasyonda 30 dakika boyunca dehidratasyon; daha büyük numuneler için, 1 saat veya daha uzun süre dehidratasyon.
   NOT: p etanol çözeltisi, numunelerin depolanması için ideal ortamdır. p etanoldeki numuneler yıllarca oda sıcaklığında saklanabilir. Bitki materyalini fiksatörlerde uzun süre saklamayın, çünkü sabitleme maddelerinin çıkarılması sabitleme^2'den sonra önemli bir adımdır.
10. Postfiksasyona geçmeden önce örnekleri glutaraldehit-kakodilat içinde 4 ° C'de saklayın (adım 9.1).

nötr tamponlu formalin (NBF)14
1. adım	80 mL damıtılmış suya 10 mL% 37-40 formaldehit çözeltisi ekleyin
adım 2	0.4 g sodyum fosfat monobazik monohidrat ekleyin (NaH2PO4 · H2O) çözeltiye
3. adım	0.65 g sodyum fosfat dibazik, susuz (Na2HPO4) ekleyin
adım 4	hacmi 100 mL'ye kadar oluşturur

Tablo 1:% 10 nötr tamponlu formalin tarifi 14.

Karnovsky'nin çözümü (modifiyeedilmiş 15)
1. adım	60-70 °C'de 20 mL damıtılmış suda
adım 2	0.8 g paraformaldehit ekleyin (% 4 w / v elde etmek için), karıştırın
3. adım	1-4 damla% 40 NaOH ekleyin ve çözelti netleşene kadar karıştırın
adım 4	soğutun ve 30 mL 0,2 M fosfat tamponu pH 7,2 ekleyin (Tablo 3)
adım 5	%1 glutaraldehit elde etmek için 0,1 M PB'de (pH 7,2) % glutaraldehit seyreltin (son hacim: ~60 mL)
adım 6	100 mL'ye kadar fiksatif yapana kadar adım 4'te elde edilen çözeltiye% 1 glutaraldehit (adım 5) ekleyin

Tablo 2: Karnovsky'nin çözüm tarifi (değiştirilmiş¹⁵).

0,2 M fosfat tamponu (PB) pH 7,2
1. adım	400 mL damıtılmış suya 14.196 g sodyum fosfat dibazik, susuz (Na2HPO 4) ekleyin
adım 2	13.8 g sodyum fosfat monobazik monohidrat ekleyin (NaH2PO4· H2O)
3. adım	çözelti netleşene kadar karıştırın
adım 4	Damıtılmış su ile son hacmi 500 mL'ye ayarlayın
adım 5	pH'ı 7,2'ye ayarlayın
adım 6	0,1 M PB için 1:1 oranında seyreltin

Tablo 3: 0.2 M fosfat tampon tarifi.

%3 glutaraldehit 0.2 M sodyum kakodilat tamponu (modifiye16)
1. adım	0.2 M kakodilat tamponu: 100 mL damıtılmış suya 4.28 g sodyum kakodilat trihidrat ekleyin
adım 2	pH'ı 7,2'ye ayarlayın
3. adım	adım 2'de çözeltinin 25 mL'sine 12 mL% 25 glutaraldehit ekleyin (0.2 M kakodilat tamponu pH 7.2)
adım 4	hacmi damıtılmış su ile 100 mL'ye kadar yükseltin

Tablo 4: %3 glutaraldehit 0.2 M sodyum kakodilat tampon tarifi (modifiye¹⁶).

2. Sabit ve sabit olmayan malzemedeki organların yüzey analizi

1. Organlarda, özellikle yeraltı organlarında ve yaprak çöpü ile temas halinde olanlarda yüzeysel hifleri analiz etmek için, analiz edilen örneklere bağlı olarak, diseksiyon mikroskobunda (stereomikroskop) 7.5x veya daha yüksek bir büyütmede sabit veya taze materyal gözlemleyin.
   1. Fiksatif,% 70 etanol (içinde depolanmışsa) veya taze malzeme durumunda musluk suyuna batırılmış numuneleri görselleştirin. Diseksiyon mikroskobundan gelen doğrudan ışığı önleyin, çünkü numuneleri kurutabilir ve zarar verebilir.
   2. Yüzeysel hifalar ve rizomorflar tarafından yönlendirilen örneklerdeki ilgi alanlarını arayın. Yüzeysel rizomorflara sahip alanlar içeren örnekleri seçin, çünkü bunlar köklerde ve gövdelerde kortikal hücreler içindeki pelotonları ve hifa bobinlerini görselleştirmek için kesitlenebilir.
   3. Seçimden sonra, örnekler henüz düzeltilmemişse 1.6 ve 1.9 adımlarını izleyin. İstenirse, bölüm 3'te açıklandığı gibi, sabitlemeden bir ışık mikroskobu kullanarak taze örnekleri fotoğraflayın.
   4. Organ yüzeylerinden, rizomorflardan ve gözlemlenen diğer yapılardan görüntü toplamak için stereomikroskopla birleştirilmiş kamerayı kullanın. Bu gibi durumlarda, malzemeyle iyi kontrast oluşturacak yeterli bir arka plan rengi ayarlayın ve mümkünse, daha az pürüzlü bir yüzeye (örneğin, kağıt) sahip bir arka plan malzemesi seçin.

3. Bitki organlarının serbest el bölümleri

NOT: Bitki organlarının serbest bölümleri, özellikle küçük ve ince yapılar için zor olabilir. Bununla birlikte, fungal endofitli dokuların bu bölümleri, bazı durumlarda, ince bölümlere kıyasla daha iyi sonuç verebilir.

1. Taze veya sabit numuneleri keskin bir bıçakla kesitleyin, mümkün olduğunca ince kesin ve hemen su (tazeyse) veya% 70 etanol (sabitse) içeren küçük bir Petri kabına yerleştirin. Bölümleri zarar vermeden manipüle etmek için küçük bir boya fırçası kullanın.
2. Daha zorlu malzemelerin (yani küçük, ince, esnek organlar) bölümlenmesini kolaylaştırmak için, numuneyi polistiren veya Cecropia yaprak sapı gibi bir yapıda çevreleyin. Numuneyi yerleştirmek için desteği oyun ve numunenin ve desteğin ince bir bölümünü tamamen yapın.
3. Numuneleri bölüm 6'da açıklandığı gibi sabitleyin ve monte edin.

4. Bitki örneklerinin reçineye gömülmesi ve kesitlenmesi

2. 
   
6. 
   
   

12. 
    

1. 3. 
      

4. 
   

1. 
   
7. 2. 
      

6. 3. 
      
      

Sonuçlar

Bitki dokusunun sabitlenmesinin temel aşamalarını takiben, hücresel bileşenlerin ve dokuların morfolojisi, hacmi ve mekansal organizasyonu göz önüne alındığında, canlı duruma mümkün olduğunca benzer hücresel yapılar verir¹⁶. Kimyasal fiksasyondan sonra numunelerde bu özellikleri gözlemleyin (Şekil 4). Şekil 4C-F, ışık mikroskobu altında yeterince sabitlenmiş örnekleri temsil etmektedir. Açıklanan fiksasyo...

Tartışma

Bitki anatomisi ve morfolojisindeki görüntü analizleri, yeraltı organları^6,40, tohumların simbiyotik çimlenmesinin yapısal analizleri³⁹ ve hava ve üreme yapıları ⁴¹ ile gösterildiği gibi^, amaçları yerine getirmek ve mikoheterotrofik bitkiler ile vazgeçilmez mantar endofitleri arasındaki ilişkileri anlamaya yardımcı olmak için önemli bir potansiyele sahiptir. . Yapısal botanik, son on yılda bitki bilimlerinin diğer a...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Aseton	Sigma-Aldrich	179124	(SEM saplamaları montajı için)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(tohum çimlenme testleri için)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	floresan boya (selülozu algılar)
Sitrat Tampon Çözeltisi, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(toluidin mavisi O boyama için)
İletken Çift Taraflı Karbon Bant	Fisher Scientific	50-285-81	(SEM için)
Konfokal Mikroskop	Zeiss		(herhangi bir model)
Bakır Izgaralar	Sigma-Aldrich	G4776	(TEM için)
Kritik nokta kurutucu	Balzers		(herhangi bir model)
Kriyostat	Leica Biosystems		(herhangi bir model)
Diseksiyon mikroskobu	Leica Biosystems		(= stereomikroskop, herhangi bir model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	mikroskopi için hızlı montaj ortamı
Etil alkol, saf (≥ %99,5)	Sigma-Aldrich	459836	(= etanol, dehidrasyon işlemleri için)
Formaldehit çözeltisi, %		252549	(NBF çözeltisinin hazırlanması için)
Formalin çözeltisi, nötr tamponlu, %10	Sigma-Aldrich	HT501128	histolojik doku sabitleyici
Fisher	Scientific 50-248-71	için jelatin kapsüller	(TEM'de reçine polimerizasyonu için)
Jelatin çözeltisi, H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(slayt hazırlama için seyreltin - OCT uyumu)
Gluteraldehit çözeltisi, %25	Sigma-Aldrich	G6257	(Karnovsky için) s çözelti hazırlama)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glikol metakrilat (GMA) gömme kiti
İyot	Sigma-Aldrich	207772	(Lugol çözeltisinin hazırlanması için)
Kurşun (II) nitrat	Sigma-Aldrich	228621	Pb (NO < alt > 3< / alt >) < alt > 2 < / alt> (TEM kontrast boyama için)
Işık Mikroskobu	Olympus		(herhangi bir model)
LR Beyaz akrilik reçine	Sigma-Aldrich	L9774	için hidrofilik akrilik reçine
	Sigma-Aldrich	62650	(boyama için)
Numune montajları için metal saplamalar	Rave Scientific		(SEM için, farklı modeller)
Mikrotom	Leica Biosystems		manuel döner mikrotom veya başka bir model
Yulaf ezmesi agar (OMA)	Millipore	O3506	(tohum çimlenme testleri için)
OCT Bileşiği, Doku-Tek	Sakura Finetek USA	4583	donmuş dokular için gömme ortamı
Osmiyum tetroksit	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (TEM son fiksasyonu için)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	sızdırmazlık termoplastik filmi
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	158127	(Karnovsky için) s çözeltisinin hazırlanması
) Poli-L-lizin çözeltisi, H < alt > 2 < / alt >O içinde% 0.1	Sigma-Aldrich	P8920	(slayt hazırlama için - OCT uyumu)
Poly-Prep Slaytları	Sigma-Aldrich	P0425	poli-L-lizin kaplı cam slaytlar
Polietilen Kalıplama Kupası Tepsileri	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, numuneleri GMA reçinesine gömmek için)
Polietilen Kalıplama Bardak Tepsileri	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, numuneleri GMA reçinesine gömmek için)
Potasyum iyodür	Sigma-Aldrich	221945	(Lugol çözeltisi hazırlama için)
Patates Dekstroz Agar (PDA)	Millipore	70139	(tohum çimlenme testleri için)
Taramalı Elektron Mikroskobu	Jeol		(herhangi bir model)
Silan [(3-Aminopropil)trietoksisilan]	Sigma-Aldrich	A3648	slayt hazırlama için - OCT uyumu)
Silan-Hazırlık Slaytları	Sigma-Aldrich	S4651	silan ile kaplanmış cam slaytlar
Silika jel turuncu, granül	Supelco	10087	(kurutucu işlemler için)
Sodyum kakodilat trihidrat	Sigma-Aldrich	C0250	(glutaraldehit-sodyum kakodilat tamponu için)
Sodyum hidroksit	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (Karnovsky ' için s çözeltisi hazırlama ve TEM kontrast boyama)
Sodyum hipoklorit çözeltisi	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (tohum yüzey dezenfeksiyonu için)
Sodyum fosfat dibazik, susuz	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (NBF çözeltisi ve PB hazırlığı için)
Sodyum fosfat monobazik monohidrat	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4· H2O (NBF ve PB için)
Püskürtme kaplayıcı	Balzers		(herhangi bir model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O<>sub11 (kriyoproteksiyon ve çimlenme testi için)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(boyama için)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(boyama için)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(boyama için)
Şırınga			(3 mL, herhangi bir marka, TEM kontrast boyama için)
Şırınga Filtre Ünitesi, Millex-GV 0.22 ve mikro; m	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gama sterilize edilmiş (TEM kontrast boyama için)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	sıvı siyanoakrilat yapıştırıcı, orta viskoziteli
Toluidin Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(boyama için)
Transmisyon Elektron Mikroskobu	Jeol		(herhangi bir model)
Trifeniltetrazolyum klorür	Sigma-Aldrich	T8877	(tohum çimlenmesinde tetrazolyum testi için)
Trisodyum sitrat dihidrat	Sigma-Aldrich	S1804	Na < alt > 3 < / alt > (C < alt > 6 < / alt >H < alt > 5 < / alt >O < alt >7 < / alt >) ve orta nokta; 2H < alt > 2 < / alt > O (TEM kontrast boyama için)
Ultramikrotom	Leica Biosystems		(herhangi bir model)
Uranil asetat	Fisher Scientific	18-607-645	UO2< / sub> (CH < sub > 3 < / sub>COO) < sub>2 < / sub> (TEM kontrast boyama için)
Vakum pompası			(herhangi bir model)
Buğday Rujubu Aglütinini, Alexa Fluor 488 Konjuge	TermoFisher Scientific	W11261	floresan boya konjuge lektin (sialik asit ve N-asetilglukozaminil kalıntılarını tespit eder)