Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Summary

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Abstract

Hücre-matriks etkileşimleri, biyokimyasal, mekanik ve geometrik ipuçları yoluyla karmaşık fizyolojik süreçlere aracılık eder, patolojik değişiklikleri ve terapötik yanıtları etkiler. İlaç geliştirme boru hattında daha önce matris etkilerinin hesaba katılmasının, yeni terapötiklerin klinik başarı olasılığını artırması beklenmektedir. 3D hücre kültüründe spesifik doku mikroortamlarını özetleyen biyomateryal tabanlı stratejiler mevcuttur, ancak bunları öncelikle ilaç taraması için kullanılan 2D kültür yöntemleriyle bütünleştirmek zor olmuştur. Bu nedenle, burada sunulan protokol, mevcut ilaç tarama boru hatları ve hücre canlılığı için geleneksel analizlerle entegrasyonu kolaylaştırmak için minyatür biyomateryal matrisleri içinde 3D kültür yöntemlerinin çok kuyucuklu bir plaka formatında geliştirilmesini detaylandırmaktadır. Kültürlenmiş hücrelerde klinik olarak ilgili fenotiplerin korunması için kritik öneme sahip matris özelliklerinin yüksek doku ve hastalığa özgü olması beklendiğinden, spesifik uygulamalar için uygun koşulları belirlemek için matris parametrelerinin kombinatoryal taraması gerekli olacaktır. Burada açıklanan yöntemler, matris mekaniğinin ortogonal varyasyonuna ve ligand sunumuna kanser hücresi yanıtlarını değerlendirmek için minyatür bir kültür formatı kullanmaktadır. Spesifik olarak, bu çalışma, matriks parametrelerinin hasta kaynaklı glioblastoma (GBM) hücrelerinin kemoterapiye verdiği yanıtlar üzerindeki etkilerini araştırmak için bu platformun kullanımını göstermektedir.

Introduction

Yeni bir ilaç geliştirmenin beklenen maliyeti, son on yılda istikrarlı bir şekilde artmıştır ve mevcut tahminlerde 1 milyar doların üzerinde 1 milyar dolardan fazladır¹. Bu masrafın bir kısmı, klinik çalışmalara giren ilaçların yüksek başarısızlık oranıdır. İlaç adaylarının yaklaşık% 12'si nihayetinde 2019 yılında Amerika Birleşik Devletleri (ABD) Gıda ve İlaç İdaresi'nden (FDA) onay almaktadır. Birçok ilaç, beklenmedik toksisite² nedeniyle Faz I'de başarısız olurken, güvenlik denemelerini geçen diğerleri etkinlik eksikliği nedeniyle başarısız olabilir³. Etkinliksizlikten kaynaklanan bu yıpranma, kısmen, ilaç geliştirme sırasında kullanılan kanser modellerinin klinik etkinliğin öngörücü olmadığı gerçeğiyle açıklanabilir⁴.

İn vitro ve in vivo modeller arasındaki fonksiyonel eşitsizlikler, tümör dışı hücreler ve fiziksel ECM ^5,6 dahil olmak üzere kanser hücrelerinin doğal mikro ortamlarından çıkarılmasına bağlanabilir. Yaygın olarak, araştırma grupları, kültürlenmiş tümör hücrelerine 3D matris mikro ortamı sağlamak için Matrigel (fare sarkomlarından türetilen proteinli bir bazal membran matrisi) gibi ticari olarak temin edilebilen kültür matrislerini kullanır. 2D kültür ile karşılaştırıldığında, membran matrisindeki 3D kültür, in vitro sonuçların klinik alaka düzeyini geliştirmiştir ^7,8. Bununla birlikte, membran matrisi de dahil olmak üzere hücresellikten arındırılmış dokulardan elde edilen kültür biyomateryalleri, tipik olarak, tekrarlanabilirliği tehlikeye atabilecek partiden partiye değişkenlik sergiler⁹. Ayrıca, incelenenlerden farklı doku kökenlerine sahip tümörlerden türetilen matrisler, uygun fizyolojik ipuçlarını sağlamayabilir¹⁰. Son olarak, yüksek derecede intratümöral heterojenliğe sahip kanserler, mikron altı boyuttaki bir ölçekte değişen ve membran matrisinin^11'i özetlemek üzere ayarlanamadığı mikroçevresel özelliklere sahiptir.

Glioblastoma (GBM), medyan sağkalım süresi yaklaşık 15 ay olan düzgün ölümcül bir beyin tümörüdür, tedavi gelişiminin özellikle zor olduğu bir kanserdir^12,13. GBM için mevcut bakım standardı, primer tümör rezeksiyonu, ardından radyoterapi ve ardından temozolamid (TMZ) kullanılarak kemoterapiden oluşmaktadır ¹⁴. Ancak klinik GBM tümörlerinin yarısından fazlası çeşitli mekanizmalarla tedavi direnci göstermektedir^15,16,17. Bireysel bir hasta için bir tedavi rejiminin etkinliğini tahmin etmek son derece zordur. Bireysel sonuçları tahmin etmek için kullanılan standart klinik öncesi modeller, immün sistemi baskılanmış farelere ortopik olarak ksenograflanmış hasta kaynaklı tümör hücrelerinden oluşur. Hasta kaynaklı ksenogreftler klinik GBM tümörlerinin birçok yönünü özetleyebilse ve klinik öncesi modeller için değerli olsa da¹⁸, doğası gereği pahalı, düşük verimli, zaman alıcı ve etik kaygılar içerir¹⁹. Hasta kaynaklı hücrelerin kültürleri, 2D plastik yüzeylerde veya sferoidler olarak, çoğunlukla bu sorunlardan kaçınır. Hasta kaynaklı hücreler genetik anormallikleri korurken, kültürleri 2D veya askıya alınmış sferoidler olarak kemirgenlerde ve orijinal hasta tümörlerinde hasta kaynaklı ksenogreftlerin büyük ölçüde zayıf temsilleri olmuştur²⁰. Daha önce, biz ve diğerleri, beyin dokusunun mekanik ve biyokimyasal özelliklerini taklit eden bir 3D ECM'de kültürlenen GBM hücrelerinin, ilaç direnci fenotipleri^{10,21,22,23'ü} koruyabileceğini göstermiştir.

Beyin ECM'sinde bol miktarda bulunan ve GBM tümörlerinde aşırı eksprese edilen bir polisakkarit olan hyaluronik asit (HA) ile CD44 reseptörü arasındaki etkileşimler, in vitro^{21,24,25,26,27} ilaç direncinin kazanılmasını modüle eder. Örneğin, HA'nın yumuşak, 3D kültürlere dahil edilmesi, hasta kaynaklı GBM hücrelerinin terapötik direnç kazanma yeteneğini arttırdı. Bu mekano-sorumluluk, GBM hücreleri²¹ üzerindeki CD44 reseptörlerine HA bağlanmasına bağlıydı. Ek olarak, 3D kültür matrislerine dahil edilen RGD taşıyan peptitlere integrin bağlanması, CD44 aracılı kemodirenci sertliğe bağlı bir şekilde yükseltti²¹. HA'nın ötesinde, birçoğu RGD bölgeleri içeren birkaç ECM proteininin ekspresyonu, normal beyin ve GBM tümörleri arasında değişir²⁸. Örneğin, bir çalışma, GBM tümörleri^29'da 28 farklı ECM proteininin yukarı regüle edildiğini bildirmiştir. Bu karmaşık tümör matriksi mikro ortamında, kanser hücreleri, Young'ın modülünde veya integrin bağlayıcı peptitlerin yoğunluğunda nispeten küçük farklılıklara (örneğin, bir büyüklük sırasından daha az) bağlı olan belirli bir direnç fenotipi üretmek için mekanik ve biyokimyasal ipuçlarını bütünleştirir^28,29,30.

Mevcut protokol, tümör hücrelerinin matris ipuçlarının benzersiz kombinasyonlarını nasıl yorumladığını ve tedavi direncini destekleyen karmaşık, hastaya özgü matris mikro ortamlarını nasıl tanımladığını karakterize etmektedir (Şekil 1A). 3B kültür için minyatürleştirilmiş, hassas bir şekilde ayarlanmış matrisler oluşturmak için fotokimyasal bir yöntem, geniş, ortogonal değişken bir alan sağlar. Bir mikrodenetleyici tarafından çalıştırılan özel yapım bir LED dizisi, otomasyonu ve tekrarlanabilirliği artırmak için 384 delikli bir plaka formatında fotoçapraz bağlantı hidrojellerine dahil edildi. Maruz kalma yoğunluğu, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak değerlendirildiği gibi, ortaya çıkan hidrojellerin mikro-mekanik özelliklerini değiştirmek için kuyu boyunca değiştirildi. Bu el yazması aydınlatma dizisinin kendisinin oluşturulmasına odaklanmamakla birlikte, cihaz çoğaltmasına yardımcı olarak bir devre şeması (Şekil 1B) ve parça listesi (Malzeme Tablosu) sağlanmıştır.

Bu rapor, Young modülünün (tek bir büyüklük sırasına göre dört seviye) ve integrin bağlayıcı peptit içeriğinin (dört farklı ECM proteininden türetilmiş) ortogonal olarak değiştirildiği benzersiz, 3D mikro ortamlarda kültürlenmiş bir dizi GBM hücresinin hızlı bir şekilde üretildiğini göstermektedir. Bu yaklaşım daha sonra hidrojel mekaniğinin ve ECM-spesifik integrin katılımının, temozolamid (TMZ) kemoterapisine direnç kazandıkça hasta kaynaklı GBM hücrelerinin yaşayabilirliği ve proliferasyonu üzerindeki göreceli katkılarını araştırmak için kullanıldı.

Protocol

Hasta kaynaklı GBM hücre hatları (GS122 ve GS304), bu hatları UCLA Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB # 10-000655) tarafından onaylanan bir protokol altında geliştiren Profesör David Nathanson (ortak çalışanımız) tarafından sağlanmıştır. Hücreler, hücre hatlarının bireysel hastalara geri bağlanamaması için kimliksizleştirilmiş olarak sağlandı.

1. Hidrojel çözeltisinin hazırlanması

1. HEPES tozunu Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) 20 mM'de çözerek HEPES-tamponlu çözelti hazırlayın. Tam çözmeyi takiben pH'ı 7'ye ayarlayın.
2. HEPES-tamponlu çözeltide, önceki rapor^31'i takiben hazırlanan tiyollenmiş HA'yı (700 kDa nominal moleküler ağırlık, bakınız Malzeme Tablosu) çözün, böylece her bir glukuronik asit üzerindeki karboksilik asit kalıntılarının% 6-8'i, tampon çözeltisinde 10 mg / mL'lik bir konsantrasyonda bir tiol ile modifiye edilir.
   NOT: Ortam ışığı ile tiol oksidasyonunu önlemek için amber şişe önerilir.
   1. Tamamen çözünene kadar, tipik olarak yaklaşık 45 dakika oda sıcaklığında manyetik bir karıştırma plakası (<1.000 rpm) kullanarak karıştırın.
3. HA çözünürken, (1) 100 mg / mL 8-kol-PEG-Norbornen (20 kDa), (2) 100 mg / mL 4 kollu-PEG-Thiol (20 kDa), (3) 4 mM sistein veya sistein içeren peptid (örneğin, GCGYGRGDSPG) ve (4) mikrosantrifüj tüplerinde 4 mg / mL LAP ayrı çözeltiler hazırlayın (bkz.
   1. Bu dört çözeltinin her birini, adım 1.1'de hazırlanan HEPES tamponlu çözeltide hazırlayın. 4. adımı gerçekleştirmeden önce her bir reaktifin tamamen çözünmesini sağlamak için çözümleri vorteksleyin.
      NOT: Birden fazla farklı peptit test ediliyorsa, her biri bu konjugasyon kimyası için bir sistein veya başka bir tiol moiety kaynağı içermelidir.
   2. Bu noktada tek bir hidrojel içine bağlanacak tüm peptitlerin çözeltilerini (4 mM mevcut tiol) hazırlayın.
      NOT: Bu çalışmada türetildikleri ve kullanıldıkları peptid dizileri ve ECM proteinleri Tablo 1'de listelenmiştir. Hücrelerin bağlanmadığı N-asetil sistein (bakınız Malzeme Tablosu), yapışkan bir peptidin konsantrasyonunu titre etmek veya negatif bir kontrol görevi görmek için biyoaktif, tiol içeren bir peptid ile ikame edilebilir³¹.
4. Tablo 2'de listelenen nihai hidrojel matrisleri için nihai konsantrasyonları elde etmek için HA, PEG-Norbornen, PEG-tiol ve sistein / tiol içeren peptitlerin bireysel çözeltilerini karıştırın (Malzeme Tablosuna bakınız). Tamamen karıştırmak için manyetik karıştırma plakası üzerinde en az 30 dakika boyunca karıştırın (<1.000 rpm).
   NOT: HA çözümleri son derece viskozitelidir ve pozitif yer değiştirmeli pipet kullanılarak en iyi şekilde işlenir (bkz. Pozitif deplasmanlı pipet mevcut değilse, geniş delikli uçlar kullanılarak yavaşça pipetleme yapılarak viskoz çözeltiler standart bir mikropipetle de dağıtılabilir.

2. Bir LED dizisi aracılığıyla hidrojellerin aydınlatılması ve fotoçapraz bağlanması

DİKKAT: UV koruyucu gözlük takın ve aydınlatma alanını UV emici malzeme ile örtün.

NOT: Bu protokolde açıklanan LED dizisi, sağlanan devre şemasında gösterildiği gibi, seri olarak yerleştirilmiş sekiz LED'den oluşan altı setten oluşur (Şekil 1A). Her LED seti bağımsız olarak çalıştırılabilir, bu da çalışma başına altı farklı ışımaya izin verir. Ek Dosya 1, daha fazla rehberlik için aşağıdaki talimatlara karşılık gelen ekran görüntüleri içerir.

1. Aydınlatma Cihazı.zip dosyasını Ek Kodlama Dosyalarından indirin. Bu dizin aşağıdaki dosyaları içerir: Arduino.zip (Ek Kodlama Dosyası 1), Sürücüler.zip (Ek Kodlama Dosyası 2), GUI.zip (Ek Kodlama Dosyası 3) ve Holder.zip (Ek Kodlama Dosyası 4).
   NOT: 3D Devre kartını yerinde tutmak için üst ve alt kısımları yazdırın (ayrıntılar için Ek Kodlama Dosyalarına bakın).
2. Mikrodenetleyici yazılımını indirin ve yükleyin (bkz.
3. GUI yazılımını indirin ve yükleyin (bkz. Yazılım çalıştırma talimatları için Ek Dosya 1'e bakın.
4. İşleme'yi açın ve Çizim > Kitaplığı İçe Aktar > Kitaplık Ekle'ye tıklayarak controlIP5 kitaplığını kurun. Ardından, kütüphanelerde controlIP5'i arayın ve Yükle'ye tıklayın. Bunu ilk kez gerçekleştirin.
5. 36 Volt güç kaynağını kullanarak aydınlatma cihazına güç verin (Malzeme Tablosuna bakın) ve bir mikro USB kablosu kullanarak bir PC'ye bağlayın.
   NOT: Bazı aygıtlar çeşitli Arduino nano kartları için sürücüleri otomatik olarak yüklemez. Aygıt zip dosyasında bir sürücü kümesi sağlanır.
6. Arduino IDE kullanarak Adruino.zip klasöründe bulunan Arduino.ino dosyasını açın.
7. Arduino.ino dosyasını Onay İşareti düğmesine tıklayarak derleyin. Derlenen kodu Ok düğmesine tıklayarak yükleyin.
8. GUI.zip klasöründe bulunan GUI.pde dosyasını İşleme'yi kullanarak açın.
9. Aydınlatma cihazını kontrol etmek için grafik kullanıcı arayüzünü başlatmak için işleme programında Çalıştır'a tıklayın.
10. Grafik kullanıcı arayüzü penceresinde, hidrojel öncü çözeltisini içeren sütunun çapraz bağlanması ve istenen yoğunluğu girmesi için Yoğunluk'a tıklayın. Saat kutusuna tıklayın ve istediğiniz saati girin. Tablo 2'de sağlanan çözüm için bu 15 s olacaktır.
    NOT: Son kullanıcıların bir radyometre kullanarak dijital yoğunluk değerlerini ışımaya kalibre etmeleri gerekir. Tipik yoğunluklara örnekler Şekil 2A'da verilmiştir.
11. Numuneleri aydınlatma cihazıyla (Şekil 2B) silikon kalıpların tek bir sütunundaki diğer tüm LED'lerle hizalayın (bkz. Malzeme Tablosu) veya 384 delikli plaka. Aydınlatmaya başlamak için Son'a tıklayın. Birden fazla slaytın veya 384 delikli bir plakanın diğer kuyularının aydınlatılması için bu işlemi gerektiği gibi tekrarlayın.
    NOT: Tutucu, 384 delikli plaka, aydınlatma sırasında iç haznenin bir köşesiyle aynı hizada oturacak şekilde tasarlanmıştır.
    1. Aydınlatmayı takiben, bir köşeye yerleştirildiğinde, kuyu plakasını bir sonraki köşeye taşıyın ve tekrarlayın. Plakanın diğer yarısındaki kuyuları aydınlatmak için, plakayı tutucudan kaldırın ve 180 ° döndürün.
12. Aşağıdaki adımları izleyerek mekanik karakterizasyon için farklı mekaniklere sahip hidrojeller üretin.
    1. Cam slaytları ve silikon kalıpları, kalıntıları temizlemek için bant kullanarak temizleyin. Silikon kalıpları cam kızağa yapıştırın, iyi bir sızdırmazlık sağlamak için aşağı bastırın ve hava kabarcıklarının yerini alın.
    2. Pipet, adım 1.4'te hazırlandığı gibi 80 μL hidrojel öncü çözeltisini, cam slayt üzerindeki her silikon kalıba dönüştürür.
    3. Cam kaydırağı, tek bir sütundaki diğer tüm LED'lerle hizalanmış aydınlatma cihazına yerleştirin. Hidrojel öncüllerini, adım 2'de açıklandığı gibi, fotoçapraz bağlantıya 15 s boyunca UV ışığına maruz bırakın.
    4. Aydınlatma durduktan sonra, slaytları alın ve kalıbın iç çevresini ince bir uçla (10 μL pipet ucu, 30 G iğne, vb.) İzleyerek jelleri kalıplardan gevşetin. Silikon kalıpları cımbız/forseps ile çıkarın.
    5. Çapraz bağlı hidrojelleri, bir spatulayı ıslatarak ve yavaşça cam slayttan iterek 12 delikli bir plakanın ayrı ayrı kuyucuklarına taşıyın. Hidrojeli eklemeden önce her bir kuyucuğu 2 mL DPBS ile doldurun ( Malzeme Tablosuna bakınız). DPBS çözeltisindeki jelleri oda sıcaklığında (ertesi günün mekanik karakterizasyonu için) en az 12 saat (tipik olarak gece boyunca) şişirin.

3. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) ölçümleri

1. Atomik kuvvet mikroskobunu (AFM) üreticinin talimatlarına göre açın (bkz. Bu protokol, cihazın ve ilgili yazılımın kullanımı için kısa talimatlar sağlar.
2. AFM probunu takın (bkz.
   NOT: Bu çalışmada, nominal yay sabiti 0.01 N/m olan üçgen silikon nitrür konsol, küresel 2.5 μm silikon dioksit parçacığı ile modifiye edilmiştir.
3. Kurulumdan sonra, lazeri üçgen probun tepesine hizalayın ve ardından sinyal toplamını en üst düzeye çıkarmak için aynayı ve lazer sapmasını ayarlayın (tipik olarak 1,5-2,2 Volt arasında).
4. Probu DPBS'ye batırın ve termal dengeyi elde etmek için 15 dakikaya kadar bekleyin. Kalibrasyon düğmesine tıklayın ve Kontaka Bağlı kalibrasyon'u seçin. Termal Ayar Topla düğmesine tıklayın ve veri toplamayı takiben, kalibrasyon için 3 kHz civarında zirveyi seçin.
   NOT: Kırılma indisi değişiklikleri nedeniyle bir sıvıya daldırıldıktan sonra aynanın ve lazer deflektörlerin hafifçe ayarlanması gerekebilir.
5. Yaklaşım Parametrelerini Sabit Hıza, hedef yüksekliği 7,5 μm'ye ve yaklaşma hızını 15 μm/s'ye ayarlayarak Petri kabının (plastik) yüzeyine yaklaşın. Yaklaşımın sürekli çalışması ve deflektördeki sapma nedeniyle erken durmaması için Yaklaşım için Çalıştırma Başına Temel Ölçüm'ü etkinleştirin.
6. Yaklaştıktan sonra, kuvvet haritalama için alım parametrelerini 4 nN geri dönüş, 2 μm girinti mesafesi, 1 μm / s hız ve 0 s temas süresine ayarlayın. Plastik yüzeyde bir kuvvet eğrisi toplamaya başlamak için Başlat düğmesine basın (örneğin, bir kuyu plakası).
7. Kalibrasyon penceresine dönün ve kuvvet eğrisinin plastiğin temas ve girintisine karşılık gelen kısmını seçin. Probun kalibrasyonu tamamlaması için hesaplanan hassasiyet ve sertlik değerlerini kabul edin.
8. Kalibrasyonu takiben, AFM probunu kaldırın ve sorgulama için hidrojel numunesini yerleştirin. 5. adımda verilen ayarları izleyerek hidrojele yaklaşın.
   NOT: Hidrojel yüzeyine doğru yaklaşım prosedürü sırasında, ünite yanlışlıkla yaklaşan durumu tetikleyebilir. Gerçek yaklaşımı doğrulamak için, adım 4.6'daki gibi bir kuvvet eğrisi elde edin. Ortaya çıkan eğri teması ve sonuçta girinti göstermiyorsa yaklaşım prosedürünü tekrarlayın.
9. Yüzey yaklaşımı başarılı olduğunda, Kuvvet Eşleme moduna geçin ve alma parametrelerini eksen başına 40 μm uzunluğa sahip 8 x 8 boyutunda bir haritaya ayarlayın. Sertlik ölçümlerinin homojenliğini değerlendirmek için çeşitli bölgelerde kuvvet haritaları elde edin.
   1. JPK SPM Veri İşleme yazılım programını kullanarak kuvvet eğrilerini bir Hertz/Sneddon model uyumu (Denklem 1 ve 2, tüm değişkenlerin tanımı için Tablo 3'e bakınız) ile küresel geometri^{32,33,3 4} seçilerek yorumlayın.
      Denklem 1³²
      Denklem 2³²

4. 3D, matrise gömülü kültürlerin kurulması ve ilaç tedavisi

1. İstenilen hücreleri tek hücreli bir çözelti olarak hazırlayın.
   NOT: Farklı hücre tipleri farklı pasaj yöntemleri gerektirebilir. GBM sferoidlerinin süspansiyon kültürünü bir T-75 şişesinden geçirmek için tipik bir protokol referans^31'de bildirilmiştir.
2. GBM sferoidlerini (kabaca 150 μm çapında) bir T-75 şişe süspansiyon kültüründen 15 mL'lik bir konik tüpe toplayın. Artık hücreleri ve ortamları çıkarmak için kültür şişesini 5 mL DPBS ile durulayın ve bu hacmi konik tüpe ekleyin.
3. Hücreleri içeren konik tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatantı 5 mL'lik bir serolojik pipetle çıkarın, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin ve 5 mL DPBS'de yeniden askıya alın.
4. Hücreleri yıkamak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj. Süpernatantı 5 mL'lik bir serolojik pipetle aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin ve daha sonra hücreleri 2 mL hücre ayrışma reaktifinde yeniden askıya alın (bkz.
5. Oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe edin. 3 mL tam ortam ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve sferoidleri tek hücreli süspansiyona ayırmak için 3-5 kez hafifçe pipet^{yapın 31}.
6. Tek hücreli süspansiyonu 400 x g'de (tek hücreli süspansiyonlar pelet oluşumu için daha hızlı döndürülebilir) oda sıcaklığında pelet hücrelerine 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı 5 mL'lik bir serolojik pipetle aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin. Hücreleri 1 mL'lik tam ortamda yeniden askıya alın.
   NOT: Hücreler süspansiyondaki tek hücreler olarak değil, kümeler halinde kalırsa, pasajdan sonra, hücreler tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirilebilir.
7. Bir hemositometre kullanarak saymak için hücrelerin bir kısmını çıkarın. Bu kısmı, canlılığı tehlikeye giren hücrelere nüfuz eden tripan mavisi ile iki kat seyreltin. Sadece canlı, renksiz hücreleri sayın. Tipik olarak, şişe başına 800.000 hücrede tohumlanan bir T-75, kültürde bir hafta sonra 2-3 milyon hücre verir.
8. Kapsülleme için gerekli hücre sayısını belirleyin. Gerekli toplam hücre sayısını içeren bir ortam hacmini steril 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
   NOT: Örneğin, hücreleri 2,5 milyon hücre/mL'de kapsüllemek için 1 mL jel hacminde yeniden askıya alınan en az 2,5 milyon hücre gereklidir. 1 mL'lik bir jel hacmi, kullanıcıların her jel damlasının 10 μL hacimde olduğu 100 jel damlası dağıtmasına izin verir. Pipet transferi sırasındaki kaybı hesaba katmak için hidrojel çözeltisinde asılı ekstra ~% 20'lik bir hücre hacminin hazırlanması önerilir. Böylece, bu örnekte 3 milyon hücre ve 1.2 mL hidrojel öncü çözeltisi hazırlanacaktır. Minimum 500 bin hücre/mL yoğunluğu önerilir.
9. Süpernatantı bir mikropipetle aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin. Hücre peletini hidrojel öncü çözeltisinde, adım 1.4'te hazırlandığı gibi yeniden askıya alın, 1.000 μL mikropipetle 4-5 kez yukarı ve aşağı pipetle iyice karıştırın.
10. Hücreleri, 10 μL dağıtmak üzere ayarlanmış tekrarlanan bir pipetleyiciye yükleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Kabarcıkları ve düzensiz dağıtımı önlemek için, tekrarlanan pipettörü bir atık kabına 1-2 kez daha dağıtarak hazırlayın.
11. 384 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğunda, tekrarlanan pipetleyiciden hidrojel çözeltisinde asılı 10 μL hücre dağıtın. LED dizisini kullanarak, istenen mekanik özellikleri elde etmek için hücreleri içeren her bir kuyuyu (adım 2) 15 sn yoğunlukta aydınlatın (örnek olarak Şekil 2A'da 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW/^cm2 yoğunlukları kullanılmıştır).
    NOT: Deneysel koşul başına beş çoğaltma ile başlamanız ve uç nokta testinin istenen aktarım hızına ve varyansına bağlı olarak ölçeği artırmanız veya azaltmanız önerilir.
12. Hücreleri içeren her bir kuyucuğa 40 μL tam ortam ekleyin. Buharlaşmadan kaynaklanan kayıpları en aza indirmek için jelleri çevreleyen deneysel olmayan, kuru kuyucuklara 50 μL DPBS ekleyin.
13. GBM hücreleri için, istenen nihai konsantrasyonu (dimetilsülfoksit (DMSO) veya araçta (DMSO) 10 μM-100 μM) elde etmek için ortam içeren ilacın 40 μL'sini (örneğin, TMZ, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, buna göre, kapsüllemeden 3 gün sonra başlar.

5. CCK8 proliferasyon testi

1. Hücreleri içeren her bir kuyucuğa 10 μL CCK8 reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Bu tahlili ilk kez yapıyorsanız, ortama yalnızca ortam veya hücresiz hidrojel gibi negatif kontrol kuyuları ekleyin.
2. Üreticinin talimatlarına göre 1-4 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
   NOT: Bu süre, hücre tipi ve yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak değişebilir ve bu nedenle kuluçka sürelerinin her uygulama için test edilmesi gerekir, böylece absorbans değerleri doğrusal bir aralıkta kalır, bu da Bira Yasası^35'in uygulanması için bir gerekliliktir.
3. Kuluçkayı takiben tüm kuyucuklar için 450 nm'deki absorbansları okuyun.
4. Her grup için araç durumu için adım 3'te elde edilen 450 nm'deki ortalama absorbansı hesaplayın. İyi tedavi edilen her ilacı, grup başına araç kontrolünün ortalamasına bölün.
5. Yüzdelik yöntem³⁶ aracılığıyla önyükleme dağıtımları (N = 10.000) oluşturarak güven aralıklarını hesaplayın.
   

Results

AFM ölçümleri, özel yapım, Arduino kontrollü bir LED dizisi kullanılarak foto-çapraz bağlama sırasında UV ışınımının (mW /^cm2) bir fonksiyonu olarak hidrojel mekaniğinin hassas kontrolünü doğruladı (Şekil 2A). Bu protokolde kullanılan hidrojel formülasyonu Tablo 2'de bulunabilir. Sağlanan şablondaki LED'lerin aralığı, 384 delikli bir plakanın diğer her bir kuyucuğunun aralığıyla eşleşir ve plakanın içinde jellerin oluşmasına izin verir (Şekil ...

Discussion

Mevcut çalışma, HA tabanlı 3D, minyatür kültürler üretmek için yöntemler sunarken, aynı zamanda integrin katılımı için mevcut matris sertliğini ve peptitleri değiştirmektedir. Bu teknik, matris parametrelerinin hücresel fenotipleri (örneğin, kemoterapiye maruz kalan kanser hücrelerinin yaşayabilirliği) artan verimle nasıl etkilediğinin sistematik olarak incelenmesini sağlar. Burada sunulanlar da dahil olmak üzere önceki yaklaşımlar, daha sert hidrojellerin daha yüksek polimer içeriğine sahip olduğu nihai formülasyondaki ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.1 kOhm dirençler, 6 W	Digikey	35601k1ft
1.7 mL mikrosantrifüj tüpü	Genesse Scientific	21-108
15 mL konik tüp	Fisher Scientific	14-959-70C
365 nm LED	Digikey	ltpl-c034uvh365
384 kuyu plakası	Bio Greiner One	781090
40 &mikro; m hücre süzgeci	MTC bio	C4040
4 kollu tiyol sonlu polietilen glikol (20 kDa)	Laysan Bio	4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJT'ler	Digikey	2n5550ta
80 Ohm dirençler, 0.125 W	Digikey	erjj-6enf80r6v
8-Kollu norbornen sonlu polietilen glikol (20 kDa)	Jenkem Technology	A7025-1
Accutase	Yenilikçi Hücre Teknolojileri	AT104500	hücre ayrışması  reaktif
AFM Probları	Novascan		0,01 N/m Nominal yay sabiti, 2,5 & m SiO2 parçacık
Arduino IDE	Arduino	1.8.19
Arduino Nano	Makerfire	Mini Nano V3.0 ATmega328P Mikrodenetleyici Kartı
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CCK8	Abcam	ab228554
Santrifüj	Termobilimsel	sorvall efsanesi xtr
CP100ST	Gilson	F148415	Pozitif deplasmanlı pipet için pipet uçları
Cubis Yarı Mikro Terazi	Sartorius	MSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)	Yaşam Teknolojileri	11330057	1x
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)	Genesse Scientific	25-508
EGF	Peprotech	AF100-15	50 ng/mL
Etanol, Susuz	Fisher Scientific	A405P	%70'e kadar seyreltmek için DI su
ekleyinFisherbrand Sınıf B Amber Cam dişli şişeler Fisher	Scientific	03-339-23C
Fisherbrand Tartı Kağıdı	Fisher Scientific	09-898-12B
G21 Takviyesi	Gemini Bio	400-160	50x
Hanks Dengeli Tuz	Çözeltisi Thermo Fisher Scientific	14175095
HCl, ACS, 12M	Sigma Aldrich	S25838A	seyreltmek için DI suyu ekleyin
	Sigma Aldrich	H3149-100Ku	25 &; g/mL
HEPES	Sigma Aldrich	H7006-100G
Sıcak Hava Tabancası	Wagner	HT1000
İntegrin bağlayıcı sialoprotein (IBSP) peptit	Genscript	Özel Sipariş	GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lityum fenil-2,4,6 trimetilbenzoilfosfinat (LAP), %>95	Sigma Aldrich	900889-1G
Manyetik karıştırma plakası	Termo Scientific	SP194715
Mikrosantrifüj	Termo Bilimsel	Sorvall efsanesi mikro 21R
Microman E tek Kanallı Pipetleyici	Gilson	FD10004	Pozitif deplasmanlı pipet
Mikropipet	Uçları Çeşitli Üreticiler		Çeşitli boyutlar
mLine mikropipet	Sartorious
N-asetil Sistein	Sigma Aldrich	A7250-10G
Nanowizard 4	Bruker		AFM mikroskobu
NaOH	Fisher Scientific	ss255-1	1 M'ye seyreltmek için DI suyu ekleyin
Normoicin	Invivogen	ant-nr-1	500x
Osteopontin Peptit	Genscript	Özel Sipariş	GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Yardımı	Drummond	4000102
Düz Mikroskop Slaytları	Globe Scientific	1301
Bas-Mühür silikon İzolatör, 12-4,5 mm çap x 2 mm derinlik	Grace Bio Labs	664201-A	Tek bir tabakadan 8 ayrı kalıp yapılacak şekilde kesin
İşlem	Yapılıyor	3.5.4
Tekrarlayıcı M4	Eppendorf
Tekrarlayıcı Pipet Uçları	Sartorious	30089430	1 mL boyutları
RGD Peptid	Genscript		GCGYGRGDSPG
Scoth Bant
Serolojik Pipetler	Genesse Scientific	12-102,12-104	5,10 mL Pipetler
Lehim Pastası	Digikey	315-NC191LT15T5-ND
Lehim Teli
Düz diseksiyon forseps	VWR Scientific	82027-408
Synergy H1 Plaka Okuyucu	Biotek
T-75 Hücre Kültürü ile İşlem Görmüş Şişe	Genesee Scientific	25-209
Temozolomid	Sigma Aldrich	T2577	Tipik olarak 10 ve mikrodan kullanılır; M ila 100 ve mikro; M
Tenascin-C Peptid	Genscript		GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV
Tiyollü Hyaluronik Asit (700 kDa), %6-8 modifiye	Lifecore Biyomedikal	HA700K5
VWR Spinbar, Pire Mikro	VWR	58948-375