Method Article

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

DOI:

10.3791/63791

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre-matriks etkileşimleri, biyokimyasal, mekanik ve geometrik ipuçları yoluyla karmaşık fizyolojik süreçlere aracılık eder, patolojik değişiklikleri ve terapötik yanıtları etkiler. İlaç geliştirme boru hattında daha önce matris etkilerinin hesaba katılmasının, yeni terapötiklerin klinik başarı olasılığını artırması beklenmektedir. 3D hücre kültüründe spesifik doku mikroortamlarını özetleyen biyomateryal tabanlı stratejiler mevcuttur, ancak bunları öncelikle ilaç taraması için kullanılan 2D kültür yöntemleriyle bütünleştirmek zor olmuştur. Bu nedenle, burada sunulan protokol, mevcut ilaç tarama boru hatları ve hücre canlılığı için geleneksel analizlerle entegrasyonu kolaylaştırmak için minyatür biyomateryal matrisleri içinde 3D kültür yöntemlerinin çok kuyucuklu bir plaka formatında geliştirilmesini detaylandırmaktadır. Kültürlenmiş hücrelerde klinik olarak ilgili fenotiplerin korunması için kritik öneme sahip matris özelliklerinin yüksek doku ve hastalığa özgü olması beklendiğinden, spesifik uygulamalar için uygun koşulları belirlemek için matris parametrelerinin kombinatoryal taraması gerekli olacaktır. Burada açıklanan yöntemler, matris mekaniğinin ortogonal varyasyonuna ve ligand sunumuna kanser hücresi yanıtlarını değerlendirmek için minyatür bir kültür formatı kullanmaktadır. Spesifik olarak, bu çalışma, matriks parametrelerinin hasta kaynaklı glioblastoma (GBM) hücrelerinin kemoterapiye verdiği yanıtlar üzerindeki etkilerini araştırmak için bu platformun kullanımını göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni bir ilaç geliştirmenin beklenen maliyeti, son on yılda istikrarlı bir şekilde artmıştır ve mevcut tahminlerde 1 milyar doların üzerinde 1 milyar dolardan fazladır1. Bu masrafın bir kısmı, klinik çalışmalara giren ilaçların yüksek başarısızlık oranıdır. İlaç adaylarının yaklaşık% 12'si nihayetinde 2019 yılında Amerika Birleşik Devletleri (ABD) Gıda ve İlaç İdaresi'nden (FDA) onay almaktadır. Birçok ilaç, beklenmedik toksisite2 nedeniyle Faz I'de başarısız olurken, güvenlik denemelerini geçen diğerleri etkinlik eksikliği nedeniyle başarısız olabilir3. Etkinliksizlikten kaynaklanan bu yıpranma, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hasta kaynaklı GBM hücre hatları (GS122 ve GS304), bu hatları UCLA Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB # 10-000655) tarafından onaylanan bir protokol altında geliştiren Profesör David Nathanson (ortak çalışanımız) tarafından sağlanmıştır. Hücreler, hücre hatlarının bireysel hastalara geri bağlanamaması için kimliksizleştirilmiş olarak sağlandı.

1. Hidrojel çözeltisinin hazırlanması

  1. HEPES tozunu Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) 20 mM'de çözerek HEPES-tamponlu çözelti hazırlayın. Tam çözmeyi takiben pH'ı 7'ye ayarlayın.
  2. HEPES-tamponlu çözeltide, önceki rapor31'i takiben hazırlanan ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AFM ölçümleri, özel yapım, Arduino kontrollü bir LED dizisi kullanılarak foto-çapraz bağlama sırasında UV ışınımının (mW /cm2) bir fonksiyonu olarak hidrojel mekaniğinin hassas kontrolünü doğruladı (Şekil 2A). Bu protokolde kullanılan hidrojel formülasyonu Tablo 2'de bulunabilir. Sağlanan şablondaki LED'lerin aralığı, 384 delikli bir plakanın diğer her bir kuyucuğunun aralığıyla eşleşir ve plakanın içinde jellerin oluşmasına izin verir (Şekil .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut çalışma, HA tabanlı 3D, minyatür kültürler üretmek için yöntemler sunarken, aynı zamanda integrin katılımı için mevcut matris sertliğini ve peptitleri değiştirmektedir. Bu teknik, matris parametrelerinin hücresel fenotipleri (örneğin, kemoterapiye maruz kalan kanser hücrelerinin yaşayabilirliği) artan verimle nasıl etkilediğinin sistematik olarak incelenmesini sağlar. Burada sunulanlar da dahil olmak üzere önceki yaklaşımlar, daha sert hidrojellerin daha yüksek polimer içeriğine sahip olduğu nihai formülasyondaki .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore ve Itay Solomon'a fotojelasyon şemasının önceki yinelemelerine katkılarından dolayı özellikle teşekkür etmek istiyor. GS122 ve GS304 hücre hatları David Nathanson tarafından cömertçe sağlandı. Tüm figürler BioRender.com ile yaratılmıştır. UCLA çekirdek tesisleri, Moleküler Tarama Ortak Kaynakları ve Nano ve Pico Karakterizasyon Laboratuvarı çalışmaya yardımcı oldu. Chen Chia-Chun, UCLA Eli ve Edythe Geniş Rejeneratif Tıp Merkezi ve Kök Hücre Araştırma Eğitim Programı tarafından desteklendi. Grigor Varuzhanyan, Tümör Hücresi Biyolojisi Eğitim Programı NIH Grant (T32 CA 009056) tarafından desteklendi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.1 kOhm dirençler, 6 WDigikey35601k1ft
1.7 mL mikrosantrifüj tüpüGenesse Scientific21-108
15 mL konik tüpFisher Scientific14-959-70C
365 nm LEDDigikeyltpl-c034uvh365
384 kuyu plakasıBio Greiner One781090
40 &mikro; m hücre süzgeciMTC bioC4040
4 kollu tiyol sonlu polietilen glikol (20 kDa)Laysan Bio4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJT'lerDigikey2n5550ta
80 Ohm dirençler, 0.125 WDigikeyerjj-6enf80r6v
8-Kollu norbornen sonlu polietilen glikol (20 kDa)Jenkem TechnologyA7025-1
AccutaseYenilikçi Hücre TeknolojileriAT104500  hücre ayrışması  reaktif
AFM ProblarıNovascan0,01 N/m Nominal yay sabiti, 2,5 & m SiO2 parçacık
Arduino IDEArduino1.8.19
Arduino NanoMakerfireMini Nano V3.0 ATmega328P Mikrodenetleyici Kartı
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CCK8Abcamab228554
SantrifüjTermobilimselsorvall efsanesi xtr
CP100STGilsonF148415Pozitif deplasmanlı pipet için pipet uçları
Cubis Yarı Mikro TeraziSartoriusMSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)Yaşam Teknolojileri113300571x
DMSOFisher ScientificBP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)Genesse Scientific25-508
EGFPeprotechAF100-1550 ng/mL
Etanol, SusuzFisher ScientificA405P%70'e kadar seyreltmek için DI su
ekleyinFisherbrand Sınıf B Amber Cam dişli şişeler FisherScientific03-339-23C
Fisherbrand Tartı KağıdıFisher Scientific09-898-12B
G21 TakviyesiGemini Bio400-16050x
Hanks Dengeli TuzÇözeltisi Thermo Fisher Scientific14175095
HCl, ACS, 12MSigma AldrichS25838Aseyreltmek için DI suyu ekleyin
Sigma AldrichH3149-100Ku25 &; g/mL
HEPESSigma AldrichH7006-100G
Sıcak Hava TabancasıWagnerHT1000
İntegrin bağlayıcı sialoprotein (IBSP) peptitGenscriptÖzel SiparişGCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lityum fenil-2,4,6 trimetilbenzoilfosfinat (LAP), %>95Sigma Aldrich900889-1G
Manyetik karıştırma plakasıTermo ScientificSP194715
MikrosantrifüjTermo BilimselSorvall efsanesi mikro 21R
Microman E tek Kanallı PipetleyiciGilsonFD10004Pozitif deplasmanlı pipet
MikropipetUçları Çeşitli ÜreticilerÇeşitli boyutlar
mLine mikropipetSartorious
N-asetil SisteinSigma AldrichA7250-10G
Nanowizard 4BrukerAFM mikroskobu
NaOHFisher Scientificss255-11 M'ye seyreltmek için DI suyu ekleyin
NormoicinInvivogenant-nr-1500x
Osteopontin PeptitGenscriptÖzel SiparişGCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet YardımıDrummond4000102
Düz Mikroskop SlaytlarıGlobe Scientific1301
Bas-Mühür silikon İzolatör, 12-4,5 mm çap x 2 mm derinlikGrace Bio Labs664201-ATek bir tabakadan 8 ayrı kalıp yapılacak şekilde kesin
İşlemYapılıyor3.5.4
Tekrarlayıcı M4Eppendorf
Tekrarlayıcı Pipet UçlarıSartorious300894301 mL boyutları
RGD PeptidGenscriptGCGYGRGDSPG
Scoth Bant
Serolojik PipetlerGenesse Scientific12-102,12-1045,10 mL Pipetler
Lehim PastasıDigikey315-NC191LT15T5-ND
Lehim Teli
Düz diseksiyon forsepsVWR Scientific82027-408
Synergy H1 Plaka OkuyucuBiotek
T-75 Hücre Kültürü ile İşlem Görmüş ŞişeGenesee Scientific25-209
TemozolomidSigma AldrichT2577Tipik olarak 10 ve mikrodan kullanılır; M ila 100 ve mikro; M
Tenascin-C PeptidGenscriptGCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
Tiyollü Hyaluronik Asit (700 kDa), %6-8 modifiyeLifecore BiyomedikalHA700K5
VWR Spinbar, Pire MikroVWR58948-375
Domuz bağırsak mukozasından 1 M Heparin sodyum tuzuna 4982000322

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
  2. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrogel Arrays3D Tumor ModelsMatrix ComponentsDrug ScreeningCell Matrix InteractionsGlioblastoma CellsMiniaturized 3D CultureMatrix MechanicsCell Viability AssayPhoto Cross Linking

Related Articles