Koyun gözünde intravitreal enjeksiyonlar, retinaya viral aracılı gen tedavisi vermek amacıyla yapıldı.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Küçükbaş Gözde İntravitreal Enjeksiyonlar
Bu makalede
Özet
Özet
Terapötik ajanların retinaya verilmesi için intravitreal (IVT), subretinal, suprakoroidal, perioküler veya topikal uygulama dahil olmak üzere çeşitli yöntemler vardır. IVT ilaç dağıtımı, gözün arka odasını dolduran ve göz küresinin şeklini koruyan jelatinimsi bir madde olan gözün vitreus mizahına bir enjeksiyon içerir. IVT yolu subretinal doğumdan daha az spesifik olarak hedeflenmiş olmasına rağmen, çok daha az invazivdir ve bir dizi oküler hastalık için klinik ortamlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.
Daha önce adeno ilişkili virüs (AAV) aracılı bir gen terapisi ürününün (AAV9) intravitreal olarak verilmesinin etkinliğini göstermiştik. CLN5), doğal olarak oluşan CLN5 nöronal seroid lipofuscinosis (NCL) formuna sahip koyunlarda. Etkilenen koyunların bir gözünde IVT gen terapisi verilirken, diğer tedavi edilmeyen göz iç kontrol görevi gördü. Tedavi edilen gözde tedaviden 15 ay sonrasına kadar retinal yapı ve fonksiyon korunurken, tedavi edilmeyen gözde postmortem muayene sırasında giderek azalan fonksiyon ve ciddi atrofi görüldü. Koyun çalışmalarına dayanarak, CLN5 gen terapisi ürünü, Eylül 2021'de Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından aday bir araştırma yeni ilacı (IND) olarak temizlendi. Bu yazıda IVT'nin küçükbaş göze terapötik viral vektör verilmesi için cerrahi protokol detaylandırılmıştır.
Giriş
Retinaya terapötik ajanlar vermek için intravitreal (IVT), subretinal, suprakoroidal, perioküler veya topikal uygulama dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılabilir. Her uygulama yolu, kan-retina bariyeri veya iç ve dış sınırlayıcı membranlar gibi engellerin aşılmasını içerir ve verilen ilaca ve spesifik retinal hedefe bağlı olarak değişen etkinlik oranlarına sahiptir 1,2.
IVT ilaç dağıtımı, gözün arka odasını kaplayan jelatinimsi bir madde olan gözün vitreus mizahına enjeksiyonu içerir. Vitröz mizahın birincil işlevi, göz küresinin şeklini korumak ve lens ve retina gibi oküler....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneysel protokoller Lincoln Üniversitesi Hayvan Etiği komitesi tarafından onaylanmıştır ve araştırmalarda hayvanların bakımı ve kullanımı için ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzları ve Yeni Zelanda Hayvan Refahı Yasası (1999) ile uyumludur. Borderdale koyunlarıdoğum 14'te teşhis edildi ve Lincoln Üniversitesi araştırma çiftliklerinde tutuldu. 3 aylık üç homozigot (CLN5-/-) koyun, sol göze tek bir IVT enjeksiyonu yapıldı ve tedavi edilmeyen sağ göz iç kontrol görevi gördü. Elektroretinografi ve patoloji verileri tarihsel sağlıklı ve etkilenmiş kontrol verileriyle karşılaştırıldı. Bu çalışmada kullanılan viral vektör, tavuk bet....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
CLN5 NCL'li koyunlarda retinal disfonksiyon ve dejenerasyonun azaltılmasında bir CLN5 gen terapisi vektörünün IVT verilmesinin etkinliği daha önce bu araştırma grubu15 tarafından gösterilmiştir. Etkilenen koyunlara, bir AAV serotip 9 (AAV9) vektöründe (AAV9) paketlenmiş tek bir 100 μL IVT CLN5 enjeksiyonu yapıldı. CLN5) bir göze, kontralateral göz tedavi edilmemiş bir iç kontrol görevi görür. Görme, enjeksiyon yaşından (3 ay) son dönem hastalığına (18 ay) kadar aylık olarak değerlendirildi. Retina.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İntravitreal enjeksiyonlar, insan oftalmolojisinde en yaygın cerrahi prosedürlerden biridir ve koyunların retinasına AAV aracılı gen terapilerinin uygulanmasında etkili olduğu kanıtlanmıştır. Daha önce AAV9'un etkinliğini göstermiştik. CLN5 gen tedavisi, CLN5 NCL15 ile koyunlarda retinal disfonksiyon ve dejenerasyonun azaltılmasında intravitreal olarak sağlandı. Bu uygulama yolunun insan NCL hastalarına çevrilmesinin de faydalı olacağı umulmaktadır.
Bir koyun gözüne küç.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, bu protokolün oluşturulmasında ve Murray ve ark.15 tarafından tanımlanan enjeksiyonların gerçekleştirilmesinde Dr. Steve Heap'e (BVSc, CertVOphthal) verdiği yardım için teşekkür etmek ister. Yazarlar ayrıca CureKids New Zealand, Canterbury Tıbbi Araştırma Vakfı, Neurogene Inc ve Batten Hastalığı Destek ve Araştırma Derneği'nden gelen fonları da kabul ediyorlar.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kalıcı olarak takılmış 0,5 inç iğneli 1 mL düşük ölü alan güvenlik şırıngası | Fisher Scientific, Auckland, Yeni Zelanda | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Güvenlik şırıngası veya benzeri |
| 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü | Sigma Aldrich | HS4323 | Kullanmadan önce sterilize etmek için otoklav tüpleri |
| Gaz tezgahlı ve monitörlü anestezi makinesi | Hyvet Anestezi, Christchurch, Yeni Zelanda | ||
| Antibiyotikli göz damlası | Teva Pharma Ltd, Auckland, Yeni Zelanda | Ticari adı: Chlorafast (% 0.5 kloramfenikol) | |
| BrightMount artı solma önleyici montaj ortamı | Abcam, Cambridge, Birleşik Krallık | ab103748 | |
| DAPI (4 & prime; , 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri | 10236276001 | |
| Diazepam yatıştırıcı | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, Yeni Zelanda | 5 mg / mL | |
| Endotrakeal tüpler | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, Birleşik Krallık | Standart, manşetli. Koyun boyutuna bağlı olarak 7, 7.5 veya 8 bedenler | |
| Göz spekulumu | Capes Medical Ltd, Tauranga, Yeni Zelanda | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated cerrahi örtü | Amtech Medical Ltd, Whanganui, Yeni Zelanda | DI583 | Veya benzeri |
| Filtre Uçları | Interlab, Auckland, Yeni Zelanda | 10, 200 ve 1.000 &mikro; L | |
| Formaldehit çözeltisi (%37) | Fisher Scientific, Auckland, Yeni Zelanda | AJA809-2.5PL | %0,9 NaCl ile damıtılmış suda %10'a kadar oluşturun |
| Keçi tavşan karşıtı Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, ABD& | nbsp; A-11012 | 1:500 |
| İzofluran | Attane, Bayer Hayvan Sağlığı, Auckland, Yeni Zelanda | ||
| Ketamin HCl anestezik/analjezik | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, Yeni Zelanda | 100 mg/mL | |
| Laringoskop (veteriner) | KaWe Medical, Danimarka | Miller C bıçak, boyut 2 | |
| İğneler | Capes Medical Ltd, Tauranga, Yeni Zelanda | 302025 | BD Hipodermik İğneler veya benzeri |
| Steroid olmayan antienflamatuar | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, Yeni Zelanda | 49402/008 | Ticari adı: Metacam 20 (20 mg / mL meloksikam) |
| Dişli olmayan forseps | Capes Medical Ltd, Tauranga, Yeni Zelanda | AB864 / 16 | Veya benzeri |
| Dişsiz hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, Yeni Zelanda | AA150 / 12 | Veya benzeri |
| Normal keçi serumu | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Yeni Zelanda | 16210072 | |
| Oksijen (tıbbi) | BOC Gazı, Christchurch, Yeni Zelanda | D2 silindiri, gaz kodu 180 | |
| Fosfat tamponlu salin | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Yeni Zelanda | 10010023 | Steril, filtrelenmiş |
| Povidon-İyot çözeltisi | Capes Medical Ltd, Tauranga, Yeni Zelanda | 005835 | Ticari adı: Betadine (%10 povidon-iyot) |
| Tavşan önleyici glial fibriler asidik protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Danimarka | Z0334 | 1:2.500 |
| seyreltmede kullanınTavuk beta etki (CBh) promotörü ve kodon için optimize edilmiş küçükbaş hayvan içeren kendi kendini tamamlayan adeno-ilişkili virüs serotipi 9 CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, ABD. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodyum Klorür %0.9 IV Çözelti | Capes Medical Ltd, Tauranga, Yeni Zelanda | AHB1322 | Ticari adı: Salin solüsyonu |
| Subkutan antibiyotikler | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, Yeni Zelanda | Ticari adı: Duplocillin LA (150.000 IU/mL prokain penisilin ve 115.000 IU/mL benzatin penisilin) | |
| Cerrahi keskin künt kavisli makas | Capes Medical Ltd, Tauranga, Yeni Zelanda | SSSHBLC130 | |
| Terumo Şırınga Luer Kilidi | Amtech Medical Ltd, Whanganui, Yeni Zelanda | SH159/SH160 | Steril şırıngalar; İndüksiyon ilaçlarının hazırlanması için 10 mL, salin hazırlamak için 20 mL |
| Virkon Dezenfektan Tozu | EBOS Group Ltd, Christchurch, Yeni Zelanda | 28461115 |
Kaynaklar
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
