In Situ Yüzey Geliştirilmiş Raman Spektroskopisi Karakterizasyonları için Plazmonik Nanopartiküllerin Optik Yakalanması

Yüzey ile güçlendirilmiş Raman spektroskopisi (SERS), hedef moleküllerin kimyasal yapısını ultra düşük konsantrasyonlarda veya hatta tek molekül seviyesi 1,2,3,4'te doğrudan tespit etmek için hassas bir analitik tekniktir. Lazer ışınlaması, hedef moleküllerin Raman sinyallerini yükseltmek için SERS substratları olarak kullanılan metalik nanoyapılarda lokalize yüzey plazmon rezonansını indükler. Tuz kaynaklı nanopartikül agregaları, kolloidal süspansiyon sıvılarında kendiliğinden Brownian hareketine uğrayan yaygın olarak kullanılan SERS substratlarıdır ^5,6. Daha fazla kurutma, kararlı SERS ölçümlerine izin verir; Bununla birlikte, arka plan gürültüsüne neden olan ve biyolojik numunelerde geri dönüşü olmayan hasara neden olan safsızlık konsantrasyonu oluşabilir⁷. Bu nedenle, tuzsuz nanopartikül agregasyonları geliştirmek, çözeltideki hareketlerini kontrol etmek ve ölçüm verimliliğini korurken biyouyumluluğu geliştirmek uygundur.

Çeşitli metalik substratları kontrol etmek ve SERS algılamalarını kolaylaştırmak için optik yakalama benimsenmiştir 8,9,10,11,12,13,14. Bir optik tuzak, küçük nesneleri odak^15,16 etrafındaki en yüksek yoğunluklu bölgeye çeken bir optik kuvvet alanı oluşturmak için bir lazer ışınını sıkıca odaklayarak oluşturulur. Son zamanlarda, optik tuzaklar, çeşitli uygulamalar için tekrarlanabilir ve hassas plazmonik algılama platformları geliştirmek için kullanılmaya başlanmış ve SERS-aktif metalik nanoyapıların ^{17,18,19,20,21,22,23,24} numaralı çözeltilerdeki konumunu bulma ve kontrol etmede benzersiz avantajlarını göstermiştir. . Mevcut protokol, gümüş nanopartikülleri (AgNP'ler) dinamik olarak birleştirmek ve verimli SERS ölçümleri için çözeltide Brownian hareketine karşı stabilize etmek için optik cımbız ve Raman spektro-mikroskopisini birleştirmek için bir yaklaşım sunmaktadır. AgNP montaj bölgesinde, AgNP'lerin yüzeyinde kaplanmış analit molekülleri olan 3,3'-dithiobis [6-nitrobenzoik asit] bis(süksinimid) esterin (DSNB) sinyali yaklaşık 50 kat arttırılabilir. Bu yaklaşım, kimyasal kapak ajanları^25,26,27 ile uyumlu olmayan hassas biyomoleküllerin analizi için uygundur. Ayrıca, SERS-aktif AgNP derlemesini oluşturmak için uzamsal ve zamansal kontrol sağlar. Bu, sulu ortamlarda in situ algılamayı mümkün kılar, bu da AgNP'lerin kullanımını azaltabilir ve in vivo analiz ^28,29,30 için bozulmayı en aza indirebilir. Ek olarak, optik yakalama kaynaklı AgNP grubu kararlı, tekrarlanabilir ve geri dönüşümlüdür^31,32. Bu nedenle, çözeltilerdeki ve tuz kaynaklı agregasyonun uygulanamadığı fizyolojik koşullar altında analit moleküllerini tespit etmek için umut verici bir platformdur.

Bu çalışmada, 1064 nm yakalama lazeri, kuvvet algılama modülü ve parlak alan aydınlatma kaynağı, optik manipülasyon ve parçacıkların görselleştirilmesi için optik cımbız mikroskopi sistemine entegre edilmiştir. 532 nm Raman prob lazeri de mikroskopa dahil edildi ve numune odasındaki yakalama lazeri ile hizalandı. Spektral edinim için, geri saçılan ışık toplandı ve bir spektrometreye yönlendirildi (Şekil 1).

1. Optik kurulum

1. 532 nm lazer ışınını (Raman uyarma kaynağı) optik cımbız mikroskobunun esnek portuna yönlendirin (bkz.
2. 532 nm lazer ışınını, numune odasına odaklanmak üzere orijinal yakalama lazer ışınlarıyla birleştirmek için 750 nm uzun geçişli dikroik ayna ile optik cımbız mikroskobun stereo çift katmanlı yollarına hizalayın.
3. 750 nm uzun geçişli dikroik ayna kullanarak numune odasından geriye saçılan ışığı toplayın ve sıvı-azot soğutmalı yük bağlantılı cihaz (CCD) kamerası içeren bir spektrometreye yönlendirin (bkz. Spektral edinimden önce spektrometrenin giriş yarığının önüne 532 nm çentik filtresi yerleştirin.
   NOT: Lazer açıldığında göz koruması kullanılmalı ve lazer ışını güvenli bir alanda tutulmalıdır.

2. AgNP'lerin Üretimi

1. 50 mL'lik 1 mM AgNO₃ sulu çözeltiyi kaynatırken yuvarlak tabanlı bir şişede ısıtın.
2. Kaynamış AgNO₃ sulu çözeltisine damla damla 1.0 mL 0.1 M trisodyum sitrat çözeltisi ekleyin.
3. Karışımı sürekli karıştırarak 16 dakika kaynatın.
4. Karışımı oda sıcaklığına soğutun. Sarımsı renk gözlenir.
5. AgNP kolloidlerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 × g'da santrifüj edin ve ardından bir pipet kullanarak süpernatantı çıkarın.
6. AgNP kolloidlerini 1 mL deiyonize su ile yeniden askıya alın (18.2 MΩ cm direnç).
7. Artık indirgeyici maddeyi çıkarmak için 2,5 ve 2,6 numaralı adımları üç kez yineleyin.
8. AgNP'lerin homojenliğini doğrulamak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve dinamik ışık saçılması (DLS)³³ kullanarak AgNP'lerin boyut dağılımını karakterize edin (Şekil 2). AgNP konsantrasyonu, UV absorbansı³⁴ ile 0.1 nM olarak tahmin edildi.
   NOTLAR: Düşük konsantrasyon nedeniyle, AgNP stok çözeltisi 2-3 hafta boyunca kümelenmeden muhafaza edilebilir. Stabilize edici ajanlara gerek yoktur. AgNP stok çözeltisinde bir çökelti gözlenirse, yukarıdaki protokolü izleyerek yeni bir AgNP çözeltisi hazırlanmıştır.

3. DSNB analit molekülü ve AgNP etkileşimi

1. 1 mL AgNP kolloidine 200 μL 2 mM DSNB ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve AgNP ile DSNB³⁵ arasında Ag-S bağının oluşmasıyla AgNP yüzeyinde bir DSNB tabakası kaplamak için oda sıcaklığında 3 saat inkübe edin. Bu etkileşimin şematik bir temsili Şekil 3'te gösterilmiştir.
2. AgNP'yi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.000 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
3. AgNP-DSNB'yi 1 mL deiyonize su ile yeniden askıya alın.
4. Fazla DSNB'yi kaldırmak için 3.2 ve 3.3 adımlarını üç kez yineleyin.
5. AgNP kolloid ve AgNP-DSNB çözeltisinin UV tarafından görülebilen spektrumlarını kaydedin.
   NOT: Bu spektrum, AgNP yüzeyinde DSNB'nin başarılı bir şekilde kaplandığını gösteren yaklaşık 420 nm'den 450 nm'ye bir absorpsiyon tepe kayması göstermektedir (Şekil 3).

4. SERS ölçümü için numune odasının hazırlanması ve AgNP tertibatının oluşturulması

1. Cam sürgüyü ve kapağı su ve etanol ile temizleyin.
2. Bir bölme oluşturmak için çerçeve bandını (0,25 mm kalınlık, bkz. Malzeme Tablosu) cam slayta takın (1,0 cm uzunluk × 1,0 cm genişlik × 0,25 mm yükseklik).
3. Çerçeveye birkaç damla AgNP-DSNB çözeltisi (yaklaşık 25 μL) ekleyin.
4. Kapak fişini çerçeve bandına yerleştirin ve kapatın (Şekil 4).
5. Sıcaklık -120 °C'ye ulaşana kadar sıvı azot soğutmalı CCD kameranın kabına sıvı azot ekleyin.
6. Manyetik lazer güvenlik ekranı kullanarak Raman probu ışın yolunu engelleyin (bkz. Malzeme Tablosu), ardından 532 nm Raman uyarma kaynağı lazerini açın.
7. AgNP-DSNB çözeltisi ile numune haznesini hazne tutucusuna sabitleyin. Suya batırılmış hedefe (1,2 sayısal açıklık A ile 60x büyütme) Şekil 1'de gösterildiği gibi su ekleyin. Ardından, hazne tutucuyu hemen hedefin üzerindeki mikro sahneye yerleştirin.
8. Daldırma yağını kapak kapağının üzerine bırakın ve mikroskop kamerasındaki parçacıkları görselleştirmek için yağa batırılmış kondenseri konumlandırın.
9. 532 nm Raman prob ışını odanın alt cam yüzeyine odaklanana ve mikroskop kamerasında beyaz bir nokta gösterene kadar mikroskop topuzunu çevirerek hedefin Z konumunu ayarlayın (Şekil 5).
   1. Odayı hareket ettirmek için mikro aşamanın X ve Y konumlarını ayarlayın ve odanın merkezi bölgesini beyaz noktaya yerleştirin. Optik cımbız kontrol yazılımını açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 1064 nm yakalama lazerini (optik cımbız sisteminde kırmızı bir daire ile gösterilir) beyaz nokta ile üst üste binecek şekilde hareket ettirmek için donanımlı joystick kontrolünü kullanın (Şekil 5).
   2. Ardından, hedefin Z konumunu yukarı taşımak için mikroskopun düğmesini ayarlayın.
      NOT: Mikroskop kamerası görüntüsündeki beyaz noktanın kaybolması, 532 nm Raman prob ışınının odanın içine odaklandığını gösterir.
10. Numune odasındaki AgNP'leri çekmek ve plazmonik bir AgNP tertibatı oluşturmak için 1064 nm yakalama lazerini açın.
    NOT: AgNP'lerin toplanması örnek odasında karanlık bir noktaya neden olur (Şekil 6B).
    1. Gerektiğinde aşırı ısınmayı veya kabarcık oluşumunu önlemek için tutucu lazer ışınını aşağı çevirin.
       NOT: AgNP tertibatında belirgin bir oluşum yoksa, yakalama lazer gücünü ve ışınlama süresini artırın.
11. Plazmonik AgNP tertibatının karanlık noktasını spektroskopik ölçümler için 532 nm Raman prob ışınının odağının altına yerleştirmek için numune mikro aşamasının konumunu ayarlayın.
12. Gücü 10 mW'a ayarlamak için nötr yoğunluklu (ND) filtreleri 532 nm Raman lazer prizinin önüne yerleştirin. Spektrum yazılımındaki ayar paneline edinme süresini (bu çalışma için 10 sn, Şekil 6) girin (bkz. Malzeme Tablosu) ve spektral edinimi başlatmak için Al düğmesine tıklayın.
    NOT: Bu, analit moleküllerinin SERS spektrumunu oluşturur (temsili sonuçtaki DSNB ve Şekil 6).

Kavramın kanıtı olarak, DSNB analit molekülü olarak seçildi ve AgNP'lerin yüzeyine kaplandı. Plazmonik AgNP tertibatı ve dağılmış AgNP ile güçlendirilmiş DSNB'nin tipik SERS spektrumları Şekil 6'da gösterilmiştir. Yakalama lazeri olmadan, numune odasındaki dağınık AgNP'ler, Raman prob lazeri tarafından uyarılması üzerine siyah bir spektrum (Şekil 6A) üretti. Yaklaşık 1380-1450 cm-1'de, DSNB'nin simetrik NO 2 gerilmesinden karakteristik zirvesi olan ve literatür raporları35,36 ile tutarlı olan zayıf ve geniş bir SERS sinyali gözlenmiştir. Dağılmış AgNP'ler Brownian hareketi altında olduğundan, parçacıklar arası kavşaklar Şekil 6C'de gösterildiği gibi büyük ve kararsızdı. Bu nedenle, DSNB'nin SERS sinyal amplifikasyonu, dağınık AgNP'ler için düşüktü.

AgNP'ler, yakalama lazeri açıkken plazmonik bir AgNP düzeneği oluşturmak için toplanır. Gücü arttırmak ve yakalama lazerinin ışınlama süresini uzatmak, Şekil 6B'de gösterildiği gibi daha fazla AgNP çekebilir ve karanlık bir nokta oluşturabilir. Burada, belirlenen bir yerde ve anda 0,05 nM DSNB kaplamalı AgNP çözeltisinde plazmonik bir AgNP tertibatı oluşturmak için 700 mM'lik bir yakalama lazer gücü ve 20 s ışınlama süresi uyguladık. DSNB'nin SERS spektrumu plazmonik AgNP grubu bölgesinde elde edildi (Şekil 6A, kırmızı). 930 cm-1'deki güçlü Raman bandı nitro makas titreşimine atanır ve 1078 cm-1, 1152 cm-1 ve 1191 cm-1'deki büyük bantlar muhtemelen DSNB 35,37'nin aromatik halka modlarıyla örtüşen süksinimidil N-C-O gerilmesine karşılık gelir. 1385 cm-1 ve 1444 cm-1'deki özellik bantları, DSNB'nin simetrik nitro gerilmesinden kaynaklanır ve AgNP35,37'nin yüzeyi ile reaksiyona bağlı olarak önemli ölçüde geliştirilmiş ve hafifçe kaydırılmıştır. DSNB35,36,37'nin daha önce bildirilen SERS parmak izlerine dayanarak, 1579 cm-1'deki bant DSNB'nin aromatik halka moduna atandı. Plazmonik AgNP düzeneğindeki DSNB'nin genel yoğunluğu, dağılmış AgNP'ninkinden daha yüksekti. 1444 cm-1'deki karakteristik zirvenin yoğunluğu göz önüne alındığında, plazmonik AgNP tertibatı, dağınık AgNP'ninkine kıyasla DSNB'nin SERS sinyalinin yaklaşık 50 kat artmasını sağlayabilir. Şekil 7'de gösterildiği gibi, DSNB'nin SERS spektrumları, deneydeki AgNP montajı için tekrar tekrar (20 kez) kaydedildi ve aynı titreşimsel özellikleri gösterdi. Bu 20 SERS spektrumu boyunca DSNB'nin 1152 cm-1, 1444 cm-1 ve 1579 cm-1'deki karakteristik zirvelerinin yoğunlukları, sırasıyla% 6.88,% 6.59 ve% 5.48'lik bağıl standart sapmalara (RSD) sahip histogramlar olarak çizildi. Bu, tekrarlanabilirliği ve kararlılığı daha da doğruladı. Bu nedenle, bu yaklaşım plazmonik nanopartiküllerin manipüle edilmesi ve çözeltideki analit moleküllerinin SERS tespiti için güvenilirdir.

Resim 1: Optik cımbız kuplajlı Raman spektroskopik platformunun şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: SERS ölçümü için AgNP'nin hazırlanması. (A) AgNP'nin SEM görüntüsü. (B) AgNP'nin DLS ile boyut dağılımı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: AgNP ve DSNB'nin etkileşimi. (A) AgNP yüzeyindeki DSNB kaplamasının şeması. (B) AgNP ve AgNP-DSNB'nin UV tarafından görülebilen spektrumları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Numune haznesi hazırlama şeması. (A) Numune haznesi hazırlama işlemi. (B) Hazırlanmış numune odası. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: 532 nm Raman lazer ve 1064 nm yakalama lazerinin üst üste binme konumu. (A) Beyaz nokta ile gösterilen 532 nm Raman lazerin konumu. (B) Kırmızı daire ile gösterilen 1064 nm yakalama lazerinin konumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Plazmonik AgNP tertibatı tarafından güçlendirilen analit moleküllerinin tipik SERS spektrumları. (A) Plazmonik AgNP düzeneğinde (kırmızı) ve dağılmış AgNP'de (siyah) DSNB'nin SERS spektrumları. (B) Yakalama lazeri açıkken plazmonik AgNP tertibatı, mikroskobik görselleştirme altında karanlık bir nokta gösterir. (C) Yakalama lazeri kapalıyken dağılmış AgNP. (D) AgNP montaj oluşum mekanizmasının gösterimi. (E) Yakalama lazerinin yokluğunda konsantrasyona bağlı SERS yoğunluğu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: DSNB'nin SERS sinyalinin tekrarlanabilirliği. (A) Deneyde tekrar tekrar kaydedilen plazmonik AgNP düzeneğinde DSNB'nin 20 SERS spektrumu. (B) Karakteristik DSNB yoğunluklarının histogramları 1152 cm-1 (RSD =% 6.88), 1444 cm-1 (RSD =% 6.59) ve 1579 cm-1'de (RSD =% 5.48) zirve yapar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Farklı deneysel parametreler altında üretilen AgNP tertibatı. (A) Farklı yakalama lazer gücü; ışınlama süresi 20 s ve AgNP konsantrasyonu 0.05 nM. (B) Farklı ışınlama süresi; yakalama lazer gücü 700 mW ve AgNP konsantrasyonu 0.05 nM. (C) Farklı AgNP konsantrasyonu; ışınlama süresi 20 s ve lazer gücü 700 mW. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: AgNP montajının mikroskop kamerası görüntüleri, yakalama lazeri kapatıldığında zaman serilerinde. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.