Hücresiz Sulandırma için Rekombinant Septin Komplekslerinin Saflaştırılması ve Kalite Kontrolü

Özet

Hücre iskeleti proteinlerinin in vitro resusyonu, bu proteinlerin temel fonksiyonel özelliklerini anlamak için hayati bir araçtır. Bu yazıda, hücre bölünmesi ve göçünde merkezi bir rol oynayan rekombinant septin komplekslerinin saflaştırılması ve kalitesinin değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

Septinler, hetero-oligomerik komplekslerden sitoiskelet filamentleri ve yüksek dereceli yapılar oluşturabilen korunmuş ökaryotik GTP bağlayıcı proteinlerin bir ailesidir. Göç ve hücre bölünmesi gibi önemli hücresel fonksiyonlara katılmak için diğer sitoiskelet bileşenleri ve hücre zarı ile etkileşime girerler. Septinlerin birçok etkileşiminin karmaşıklığı, çok sayıda septin geni (insanlarda 13) ve septinlerin farklı alt birim bileşimlerine sahip hetero-oligomerik kompleksler oluşturma kabiliyeti nedeniyle, hücresiz sulandırma, septin biyolojisinin temellerini anlamak için hayati bir stratejidir. Bu yazıda ilk olarak rekombinant septinlerin hetero-oligomerik formlarında iki aşamalı bir afinite kromatografisi yaklaşımı kullanılarak saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Daha sonra, septin komplekslerinin saflığını ve bütünlüğünü kontrol etmek için kullanılan kalite kontrol süreci detaylandırılmıştır. Bu işlem, doğal ve denatüre edici jel elektroforezi, negatif leke elektron mikroskobu ve interferometrik saçılma mikroskobunu birleştirir. Son olarak, negatif leke elektron mikroskobu ve floresan mikroskobu kullanılarak septin komplekslerinin polimerizasyon kabiliyetini kontrol etme işleminin bir açıklaması verilmiştir. Bu, Drosophila septin heksameerlerinin yanı sıra farklı septin_9 izoformlarını içeren yüksek kaliteli insan septin heksamerleri ve oktamerleri üretmenin mümkün olduğunu göstermektedir.

Giriş

Hücre iskeleti klasik olarak aktin filamentleri, mikrotübüller ve ara filamentlerden oluşan üç bileşenli bir sistem olarak tanımlanmıştır 1, ancak son zamanlarda septinler sitoiskelet^1'in dördüncü bir bileşeni olarak kabul edilmiştir. Septinler, ökaryotlar^2'de korunan GTP bağlayıcı proteinlerin bir ailesidir. Septinler, hücre bölünmesi³, hücre-hücre adezyonu⁴, hücre motilitesi⁵, morfogenez⁶, hücresel enfeksiyon⁷ ve hücre polaritesinin kurulması ve sürdürülmesi⁸ gibi birçok hücresel fonksiyonda rol oynar. Önemli işlevlerine rağmen, septinlerin bu tür süreçlere nasıl dahil oldukları tam olarak anlaşılamamıştır.

Septin protein ailesi, protein dizisi benzerliği^2'ye bağlı olarak birkaç alt gruba (sınıflandırmaya bağlı olarak dört veya yedi) ayrılır. Farklı alt ailelerin üyeleri, filamentlerin yapı taşları olan ve sırayla demetler, halkalar ve örgüler 1,9,10,11,12 gibi daha yüksek dereceli yapılara monte edilen palindromik hetero-oligomerik kompleksler oluşturabilir. Daha fazla moleküler karmaşıklık, farklı ekleme varyantlarının varlığından kaynaklanmaktadır; bir örnek, farklı ekleme varyantlarının spesifik işlevleri için kanıtların bulunduğu insan ^{SEPT9'dur 13,14,15}. Ek olarak, hetero-oligomerlerin uzunluğu türlere ve hücre tipine bağlıdır. Örneğin, Caenorhabditis elegans septinleri tetramerler 16'yı, Drosophila melanogaster septinleri hexamers^{17'yi (Şekil 1A}), Saccharomyces cerevisiae septinleri oktamerler^18'i ve insan septinleri hem hexamers hem de octamers^19'u oluşturur (Şekil ^1A). Septin izoformlarının, ekleme varyantlarının ve aynı alt aileden translasyonel olarak modifiye edilmiş septinlerin komplekste birbirlerinin yerine geçme kabiliyeti ve farklı büyüklükteki hetero-oligomerlerin (birlikte) varlığı, farklı hetero-oligomerik komplekslerin hücresel fonksiyonlarını tanımlamayı zorlaştırmıştır¹².

Septinlerin bir başka ilginç yeteneği, hücredeki birçok bağlayıcı ortakla etkileşime girme yetenekleridir. Septinler plazma zarını ve membranöz organelleri interfaz ve hücre bölünmesi sırasında bağlar^20,21,22. Bölünen hücrelerde, septinler sitokinez 26,27 sırasında anilin^23,24,25 ve aktin ve miyozin ile işbirliği ^yapar. Sitokinezinin geç evrelerinde, septinler orta vücut absiszyonu için taşıma (ESCRT) sistemi için gerekli endozomal sıralama komplekslerini düzenlemektedir²⁸. Ek olarak, fazlar arası hücrelerdeki hücrelerin aktin korteksi ve aktin stres lifleri üzerinde bulunan septin kanıtı da vardır 29,30,31. Spesifik hücre tiplerinde, septinler ayrıca mikrotübül sitoiskeletini bağlar ve düzenler^32,33.

Tüm bu özellikler, septinleri çalışmak için çok ilginç bir protein sistemi haline getirir, aynı zamanda zorlu bir sistemdir. Çok sayıda septin alt biriminin (insanlarda ekleme varyantlarını saymadan 13 gen²) aynı alt aileden septin alt birimlerinin birbirlerinin yerine geçme ve farklı büyüklükteki hetero-oligomerler oluşturma potansiyeli ile kombinasyonu, genetik manipülasyon yoluyla belirli bir septinin hücresel fonksiyonu hakkında bir sonuç çıkarmayı zorlaştırmaktadır. Ayrıca, septinlerin çoklu etkileşimleri, sitoiskelet veya membran bileşenlerine yönelik ilaçlar³⁴ gibi yaygın araştırma araçlarının etkilerini yorumlamayı zor bir görev haline getirmektedir.

Bu durumun üstesinden gelmenin bir yolu, hücrelerdeki araştırmayı septinlerin in vitro (hücresiz) yeniden sulandırılmasıyla tamamlamaktır. In vitro sulandırma, belirli bir alt birim bileşimi ve uzunluğu^18,35,36,37 olan tek tip septin hetero-oligomerlerin izolasyonuna izin verir. Bu kompleks daha sonra,^{septinlerin 38,39,40} septinlerinin temel yapısal ve fizikokimyasal özelliklerini keşfetmek için tek başına veya model biyomembranlar ^11,41,42, aktin filamentleri ^10,27 veya mikrotübüller ^32,36 gibi istenen ortaklarla kombinasyon halinde kontrollü bir ortamda incelenebilir. Etkileşim.

Bu nedenle, farklı septin komplekslerini verimli bir şekilde saflaştırmak için güvenilir bir yöntem, septin araştırması için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, aynı protokolü kullanarak bile, farklı saflaştırmalar proteinlere farklı aktivite / işlevsellik ve hatta bütünlük sağlayabilir. Enzimler gibi ticari olarak temin edilebilen proteinler için, işlevsellik ve enzimatik aktivite dikkatlice doğrulanmıştır⁴³. Sitoiskelet veya septinler gibi yapısal proteinler için dikkatli bir kalite kontrolü uygulamak zor olabilir, ancak laboratuvarlar arasında deneylerin karşılaştırılabilir hale getirilmesi önemlidir.

Bu yazıda, Escherichia coli hücrelerinde mono- veya bi-sistronik yapılar içeren iki vektörün eşzamanlı ekspresyonuna dayanarak yüksek kaliteli rekombinant septinleri hetero-oligomerik formlarında saflaştırmak için sağlam bir yöntem açıklanmaktadır (Tablo 1). Yöntem, hem₆ etiketli septin hem de Strep-II etiketli septin içeren septin hetero-oligomerlerini yakalamak için iki aşamalı bir afinite kromatografisi yaklaşımından oluşur (Şekil 1B, C). İlk olarak Iv ve ark.10'da tanımlanan bu protokol, Drosophila septin hexamers 11,27,35, human septin hexamers¹⁰ ve farklı doğal (izoform 1, 3 ve 5)^10,32 veya mutasyona uğramış SEPT9 izoformları ³² içeren birkaç insan septin oktamerini saflaştırmak için kullanılmıştır. . Ayrıca, saflaştırılmış septinlerin kalitesini değerlendirmek için bir dizi tekniğin tanımı verilmiştir. İlk olarak, septin alt birimlerinin bütünlüğü ve doğru stokiyometrisi, denatüre elektroforez ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak kontrol edilir. Daha sonra, doğru moleküler kütleye sahip hetero-oligomerlerin varlığı ve karmaşık instabilitenin göstergesi olan monomerlerin veya daha küçük oligomerlerin varlığı, interferometrik saçılma mikroskobu (iSCAT) yoluyla doğal elektroforez ve kütle fotometrisi ile incelenir. Son olarak, son adım, floresan mikroskobu ve TEM kullanılarak septinlerin polimerizasyon aktivitesinin değerlendirilmesinden oluşur.

Şekil 1: Saflaştırma stratejisi . (A) İnsan (solda) ve Drosophila (sağda) hücrelerinde bulunan septin hetero-oligomerlerinin şemaları. Sayılar belirtilen gruplardan septin alt birimlerini, P ise Fıstık'ı gösterir. İnsan SEPT9, izoformlarından herhangi biri olabilir. Septin alt birimleri asimetrik bir şekle sahiptir ve insan heksamerinin üstünde sırasıyla NC ve G ile gösterildiği gibi, NC: NC ve G: G arayüzü olmak üzere iki ayrı arayüzle uzunlamasına ilişkilidir. (B,C) İki aşamalı kromatografi stratejisinin şematik gösterimi, (B) insan septin heksamserleri ve (C) oktamerler için gösterilmiştir. H his-etiketlerini gösterirken, S Strep-II-etiketlerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

1. Septin hetero-oligomerlerin saflaştırılması

1. Bakteri hücrelerinin ekspresyon vektörleri ile birlikte dönüşümü
   1. İfade için kullanılacak bir pnEA ve bir pnCS plazmid⁴⁴ kombinasyonunu seçin. Septin hetero-oligomer 10,35'in istenen alt birim bileşimine ve floresan etiketlemenin gerekli olup olmadığına bağlı olarak kombinasyonu seçin.
      NOT: C-terminal etiketli monomerik süper klasör GFP (msfGFP)-etiketli SEPT2 (insan septinleri için) veya msfGFP- veya monomerik geliştirilmiş GFP (mEGFP)-DSep2 ( Drosophila septinleri için) burada kullanılmıştır (Tablo 1).
   2. Her plazmidin 1 μL'sini (~1 ng/μL) 100 μL yetkin BL21 Escherichia coli hücresine pipet edin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   3. Hücreleri 40 s boyunca 42 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin ve ardından hemen buz üzerinde 3 dakika boyunca inkübe edin.
   4. Hücre süspansiyonuna 0.9 mL lizojen et suyu (LB) ortamı ekleyin ve hücrelerin 37 ° C'de 1 saat büyümesine izin verin. 100 μg / mL ampisilin ve 100 μg / mL spektinomisin içeren sıcak LB-agar plakaları üzerindeki hücrelerin 100 μL'lik plakası ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
2. Bakteri ön kültürü yetiştirin
   1. 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesini, 100 μg/mL ampisilin ve 100 μg/mL spektinomisin içeren 100 mL Müthiş et suyu (TB) veya LB ortamı ile doldurun.
   2. Steril bir aşılama döngüsüne sahip LB-agar plakasından tek bir koloni seçin ve adım 1.2.1'den itibaren taze ortama aktarın.
   3. Döner çalkalayıcı inkübatörde 37 °C'de gece boyunca veya en az 6 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Bu kültürden, bakteriyel süspansiyon 1: 1'in gliserol ile karıştırılmasıyla bir gliserol stoğu hazırlanabilir ve -80 ° C'de saklanabilir. Bu hisse senedi adım 1.2.2'de kullanılabilir. yeni dönüştürülmüş bir koloni yerine.
3. Bakteri kültürü ve protein ekspresyon indüksiyonu
   1. 100 mL yetiştirilen bakteriyi, 50 μg / mL ampisilin ve 50 μg / mL spektinomisin içeren 5 L TB veya LB'ye aktarın.
   2. Bu kültürü, etiketlenmemiş septinler için 2-3 aralığında 600 nm dalga boyunda veya msfGFP / mEGFP etiketli septinler için 0.6-0.8 aralığında ölçülen bir optik yoğunluğa (OD) ulaşana kadar bir çalkalayıcı inkübatörde 37 ° C'de büyütün ve 0.5 mM IPTG'lik bir son konsantrasyon ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. Etiketli septinler için alt OD, bir sonraki adımda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, daha uzun ekspresyon sürelerinde ölüm fazına ulaşmaktan kaçınmaktır.
   3. Etiketlenmemiş septin hetero-oligomerlerini eksprese eden hücreleri 37 ° C'de 3 saat boyunca veya msfGFP etiketli hetero-oligomerleri eksprese eden hücreleri 17 ° C'de bir gecede inkübe edin.
      NOT: Daha zengin TB ortamının kullanılmasıyla kolaylaştırılan etiketsiz kompleksler için kısa protein ekspresyon süresi, protein bozulmasını önlemek için seçilir. Etiketli kompleksler için daha düşük sıcaklıkla birleştirilen daha uzun ifade süresi, msfGFP etiketinin doğru katlanmasına izin vermek için seçilir.
4. Bakteriyel lizis ve lizat berraklaştırma
   NOT: Saflaştırma prosedüründe bu noktadan itibaren, proteolitik protein bozulmasını veya aktivite kaybını önlemek için protein içeren çözeltiyi buz üzerinde veya her zaman 4 ° C'de tutun.
   1. Kültürlenmiş hücreleri, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüj yaparak toplayın. Süper natantı atın.
      1. İsteğe bağlı olarak, peleti bu adımda çıtçıtlayın ve maksimum 6 ay boyunca -80 ° C'de saklayın. Bu seçenek seçilirse, devam etmeden önce peleti buz üzerinde çözdüğünüzden emin olun.
   2. Peleti 100 mL lizis tamponunda çözün (Tablo 2) ve hücreleri lize edin. Aşağıdaki iki seçenekten birini belirleyin
      1. 30 s AÇIK ve 59 s KAPALI 7 döngülerinde% 30 genlik kullanan bir uç sonicator ile sonicate (ayarların sonicator-bağımlı olduğunu unutmayın).
      2. Fransız basınındaki hücreleri en az 3 kat geçirerek parçalayın.
   3. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüj yaparak hücre lizatını netleştirin ve süpernatant tutun. Adım 1.5.1 ile başlamanız önerilir. bu santrifüj adımı sırasında.
   4. İsteğe bağlı olarak, bölüm 2'de açıklandığı gibi elektroforezi denatüre etmek için bir örnek alın.
5. His etiketli proteinler için afinite kromatografisi
   NOT: Bu adım, bir nikel sütunu kullanarak insan SEPT2 veya Drosophila Sep1 içeren kompleksleri verir (Şekil 1B).
   1. Önceden paketlenmiş bir nikel sefarozun yüksek performanslı kromatografi kolonunu septin tamponu ile dengeleyin (Tablo 2).
   2. Arıtılmış süpernatantı kolona 1 mL / dak'da yükleyin ve bağlı proteini en az üç kolon hacmi septin tamponu ile yıkayın.
   3. Septin komplekslerini 1 mL/dk'da %50 HisTrap elüsyon tamponu (Tablo 2) ile süzün ve 250 mM'lik bir imidazol konsantrasyonu elde etmek için 0,5 mL fraksiyonları toplayın.
   4. Hızlı bir protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi ile çevrimiçi olarak izlenen 280 nm'de veya bir mikro hacimli spektrofotometre ile saflaştırmadan sonra 280 nm'de elüatın optik emilimi ile belirtildiği gibi, septin kompleksleri içeren fraksiyonları seçin.
      NOT: İmidazol ışığı 280 nm'de emer. Bu muhtemelen protein zirvesinin septin elüsyonundan sonra neden sıfır emilime geri dönmediğini açıklar (Şekil 2A).
6. Strep-II etiketli proteinler için afinite kromatografisi
   NOT: Bu adım, bir Strep-Tactin sütunu kullanarak insan SEPT7 (heksamer), insan SEPT9 (oktamerler) veya Drosophila yer fıstığı içeren kompleksler verir (Şekil 1B). Kromatografi kolonu, modifiye edilmiş bir biyotin-streptavidin sistemine dayanmaktadır. Protein, modifiye biyotin (Strep-II-etiketi) ile etiketlenir ve sütun, mühendislik ürünü bir streptavidin (Strep-Tactin) içerir. Biotin-streptavidin sisteminden modifiye edilmesine rağmen, Strep-Tactin-Strep-II-tag sistemi ile biotin-streptavidin sistemi arasında herhangi bir girişim yoktur. Tanımlanan sistem, biyotin ve streptavidin kullanılarak sulandırma tahlillerine müdahale edilmesini önlemek için kullanılır.
   1. Önceden paketlenmiş bir StrepTactin sefarozu yüksek performanslı kromatografi kolonunu septin tamponu ile dengeleyin (Tablo 2). Nikel kolonundan geri kazanılan septin içeren fraksiyonları 1 mL / dak'da yükleyin ve bağlı proteini en az üç kolon hacmi septin tamponu ile yıkayın.
   2. Septin komplekslerini %100 StrepTrap elüsyon tamponu (Tablo 2) ile 1 mL/dk'da süzün ve 2,5 mM desthiobiotin konsantrasyonu elde etmek için 0,5 mL fraksiyonları toplayın.
      NOT: StrepTrap elüsyon tamponundaki desthiobiotin taze olarak çözülmelidir.
   3. Bir FPLC sistemi ile çevrimiçi olarak izlenen 280 nm'de veya bir mikro hacimli spektrofotometre ile saflaştırmadan sonra 280 nm'de elüatın optik emilimi ile belirtildiği gibi, septin kompleksleri içeren fraksiyonları seçin.
      NOT: Denatüre edici elektroforez genellikle bu noktada kolon yıkama ve septin fraksiyonlarının örnekleri ile yapılır. Sütunların sırası, ayırt edilemez sonuçlarla, yani adım 1.4'ten sonra açıklığa kavuşturulmuş lizat ile tersine çevrilebilir. Strep-Tactin afinite kromatografisine ve ardından nikel afinite kromatografisine tabi tutulabilir.
7. Diyaliz ve depolama
   1. Dethiobiotin'i nihai depolama çözeltisinden çıkarmak için, septin komplekslerini, 30 kDa MWCO diyaliz membranı kullanarak gece boyunca 1 mM DTT ile desteklenmiş septin tamponuna karşı ~ 1:300 numune-tampon hacim oranında çevirin (Tablo 2) veya en az 4 saat boyunca 4 °C'de.
   2. İsteğe bağlı olarak, septinleri 30 kDa MWCO santrifüj konsantrasyon sütunu kullanarak istenen konsantrasyona kadar konsantre edin. 280 nm'de çözelti optik absorbansı ile ölçülen ve ProtParam ile hesaplanan teorik bir yok olma katsayısı kullanılarak 5-7 μM'lik bir konsantrasyonu hedefleyin (Tablo 3).
   3. Aliquot, protein komplekslerini istenen aliquot boyutuna getirir, aliquot'u çırpın-dondurur ve -80 ° C'de saklar.
      NOT: Proteinin 6 aydan fazla saklanmaması önerilir. Ek olarak, özellikle protein önerilen süreden daha uzun süre saklanırsa, düzenli kalite kontrol deneyleri yapılması önerilir.

2. Septin hetero-oligomerin saflığının ve bütünlüğünün kalite kontrolü

NOT: Hetero-oligomer kalite kontrolü, çözeltide bulunan septin komplekslerinin kütlesinin ve bütünlüğünün tespit edilmesini sağlayan bir dizi biyokimyasal ve görüntüleme tekniğinden oluşur.

1. Doğru bileşenlerle septin hetero-oligomer oluşumunu kontrol etmek için denatüre elektroforez
   1. Seçilen fraksiyonların 10 μL'sini 10 μL 2x SDS numune tamponu ile karıştırın, bunları önceden dökülmüş %4-%15 TGX jel üzerine yükleyin ve sistemi Tris/glisin/SDS çalışan tamponla doldurun.
   2. Elektroforezi 200 V'ta 35 dakika boyunca çalıştırın ve sonuçları görselleştirmek için jeli (Malzeme Tablosu) boyayın. Bireysel septin proteinlerinin ve septin hetero-oligomerik komplekslerinin moleküler ağırlıkları Tablo 3'te bulunabilir.
   3. Kontrast ters çevrilmiş bir görüntüde saflaştırılmış septinler içeren her şeritteki her bir bandın göreceli yoğunluğunu ölçün. Bunu, her bandın etrafındaki eşit büyüklükteki dikdörtgenlerin ve aynı şeritte herhangi bir bant bulunmayan bir bölgedeki eşit büyüklükteki dikdörtgenin ortalama yoğunluğunu hesaplayarak yapın. Ardından, her bandın yoğunluğunu bantsız bölgenin yoğunluğuna bölerek değerleri normalleştirin.
      NOT: Yoğunluk doymuşsa (örneğin, kontrast ters çevrilmiş bir görüntüdeki 8 bit görüntü için 255 değerleri), şeridi atlayın.
2. Doğal elektroforez yoluyla topluluk ortalaması doğal boyut dağılımı
   1. Bir gün önce 800 mL anot tamponu ve 200 mL açık mavi katot tamponu hazırlayın ve buzdolabında saklayın. Anot tamponunu hazırlamak için, 40 mL 20x akan tamponu 760 mL tip-I deiyonize su (I-su) ile seyreltin. Açık mavi katot tamponunu hazırlamak için, 10 mL 20x çalışan tampon ve 1 mL 20x katot katkı maddesini 189 mL I-su ile seyreltin. Çalışan tampon ve katot katkı maddesi bir kit (Malzeme Tablosu) ile birlikte gelir.
   2. ~500 ng septini gerekli miktarda numune tamponu (bu durumda, 4x numune tamponunun kullanılması nedeniyle 2,5 μL; Malzeme Tablosuna bakınız) ve 10 μL'lik bir hacme ulaşmak için yeterli miktarda I-su ile karıştırarak numunenin 10 μL'sini hazırlayın.
   3. Numuneleri jel üzerine yükleyin ve sistemi buz gibi soğuk anot ve katot tamponlarıyla doldurun.
   4. Düşük akımlarda durmayan bir güç kaynağı ile elektroforezi 150 V'ta yaklaşık 115 dakika çalıştırın ve sonuçları görselleştirmek için jeli (Malzeme Tablosu) lekeleyin. Diziye göre hesaplanan tek proteinlerin ve komplekslerin moleküler ağırlıkları Tablo 3'te bulunabilir.
3. İnterferometrik saçılma mikroskobu ile kütle fotometrisi kullanılarak tek moleküllü kütle dağılımı
   1. #1.5 cam slaytları, I-suyunda 5 dakika, izopropanolde 5 dakika ve son olarak I-suda 5 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyicide sonikleştirerek yıkayın.
   2. İki cam kaydırağı yumuşak bir azot gazı akışıyla kurutun ve slaytlardan birinin ortasına 7 μL'lik %0,01'lik bir Poli-L-Lizin (PLL) çözeltisi damlası yerleştirin. Ardından, diğer slaytın merkezini PLL damlasının üzerine yerleştirin ve kolay ayırma için iki slaytı dikey olarak yönlendirin. 30 s için kuluçka makinesi.
      1. I-water 1x ile bir beherin içine daldırarak ve doğrudan I-water 2x akışı uygulayarak yıkayın. Ardından, iki slaytı azot gazı akışıyla kurulayın. Bu slaytlar daha sonra kuru koşullarda oda sıcaklığında yaklaşık 6 hafta saklanabilir.
         NOT: Denemeyi doğru şekilde çalıştırmak için slaytın PLL ile işlenen tarafını etiketleyin.
   3. Deneyden hemen önce, 2 x 2, 3 x 2 veya 3 x 3 contadan oluşan bir parçayı kesin (sırasıyla 4, 6 veya 9 görüntüleme odası / slayt verir) ve cam slaytın PLL ile işlenmiş kısmına yapıştırın, cam slayt ve contaların herhangi bir kirli yüzeye temas etmesini önler. Sürgüyü hafif hizmet tipi bir silecek mendil üzerine yerleştirin ve contaların üzerinde hala koruyucu plastik olacak şekilde yapıştırmak için contalara pipet ucuyla bastırın.
   4. Septin tamponunu (Tablo 2) oda sıcaklığına ısıtın ve eldeki proteinleri çözün (daha sonra buz üzerinde tutun).
      NOT: iSCAT, bazı deterjanların ve protein sinyallerine benzeyen küçük moleküllerin sinyalini gösterir⁴⁵. DTT bu küçük moleküllerden biridir ve bu yüzden bu deney için kullanılmaz. Depolanan septinden sadece bir DTT izi vardır.
   5. Contalı slaytı 19 μL septin tamponu içeren ticari kütle fotometri sistemine yerleştirin ve otomatik odaklama seçeneğini kullanarak mikroskopu odaklayın. Bulunan odağın doğru olup olmadığını kontrol etmek için üreticinin talimatlarını izleyin. Kurulumun bir parçası olan standart 100x hedefi burada kullanılır.
   6. Dosya > Yeni Proje veya Dosya Yükleme Projesi kullanarak verileri depolamak için bir proje klasörü oluşturun veya > yükleyin.
   7. 19 μL septin tampon damlası (adım 2.3.5) üzerine 1 μL numune pipeti, bunu yaparken hiçbir şeye dokunmayarak kızağın hareketini en aza indirirken odaklamak ve karıştırmak için kullanılır. Ardından, Kaydet'e tıklayarak 6.000 karelik bir video kaydedin.
      1. Doğru analiz için aşağıdaki numuneleri kaydedin: septin tamponu, sinyal-kütle oranının kalibrasyonu için protein kütle standardı (yeni bir kalibrasyon varsa ve çevresel koşullar değişmediyse, bu numune atlanabilir) ve DTT olmadan septin tamponunda seyreltilmiş 250 nM septin kompleksi (bu, ~ 12.5 nM'lik bir nihai konsantrasyon verir).
   8. Protein kütle dağılımını elde etmek için üreticinin yazılımını kullanarak videoları analiz edin. Aşağıdaki gibi kaliteli veriler olup olmadığını kontrol edin.
      1. Farklı septin hetero-oligomer boyutlarının zirveleri çok fazla örtüşüyorsa veya çok fazla olay algılanırsa (normal görüş alanı 128 piksel x 34 piksel olan ve 10,8 μm x 2,9 μm boyutlarına yayılan 6.000 karelik bir video için >3.500 olay), son septin konsantrasyonunu azaltın ve tekrar ölçün.
      2. Ölçülen tek moleküllerin yeterli sayısı yoksa (normal görüş alanına sahip 6.000 karelik bir video için en az 2.500-3.500), septin konsantrasyonunu artırın ve tekrar ölçün.
4. Negatif leke geçirgenliği elektron mikroskobu ile septin komplekslerinin doğrudan görüntülenmesi
   1. Numuneleri septin tamponunda yaklaşık 50 nM'lik bir konsantrasyona kadar seyreltin ve boyama çözeltisini (I-suyunda% 2 uranil formatı veya uranil asetat) hazırlayın.
      NOT: Uranil format taze hazırlanmalıdır.
   2. Pipet, 4 μL seyreltilmiş septinleri parıltılı bir elektron mikroskobu ızgarasına yerleştirin ve 30 s boyunca inkübe edin.
   3. Bir filtre kağıdı kullanarak protein çözeltisinin çoğunu çıkarın ve gevşek adsorbe edilmiş septinleri çıkarmak için ızgarayı 2x'i septin tamponu ve 1x'i I-su ile yıkayın.
   4. 1 dakika boyunca I-water'da% 2 uranil asetat veya uranil format çözeltisi ile leke, boyama çözeltisini bir filtre kağıdı ile emilir ve ızgarayı birkaç dakika boyunca hava ile kurutur.
   5. Gelişmiş leke bölgelerini aramak ve seçilen bu alanlarda yaklaşık 100 görüntü toplamak için düzgün hizalanmış bir iletim elektron mikroskobu kullanarak ızgarayı tarayın.
   6. Yaklaşık 2 Å/piksel piksel boyutu elde etmek için görüntüleri en az 50.000x büyütmede ve -1 μm ile -2 μm arasında değişen bir bulanıklaştırma ile toplayın. 200 kV'luk bir hızlanma voltajı kullanın. Tercihen, mevcut edinme yazılımına bağlı olacak verileri toplamak için otomatik bir prosedür kullanın.
   7. Özel yazılım kullanarak 2B görüntü işleme gerçekleştirin
      1. Özel bir yazılım kullanarak en az 2.000 parçacık kutulayın⁴⁶.
      2. Daha fazla iyileştirme yapmadan sınıflar elde edilene kadar iki boyutlu hizalama ve sınıflandırmayı yinelemeli olarak gerçekleştirin. İlk hizalama ve sınıflandırma adımı, sınıflandırmada herhangi bir önyargıyı önlemek için referanssız olmalıdır.
      3. Ekstra bir sınıflandırma turu gerçekleştirmek için ilk referanssız sınıflandırmadan elde edilen ortalamaları yeni referanslar olarak kullanın. Daha fazla iyileştirme elde edilinceye kadar bu işlemi yinelemeli olarak tekrarlayın. Her sınıfın 50 ila 100 seçilmiş parçacığa dayandığından ve tek tek alt birimlerin açıkça görülebildiğinden emin olun. Farklı yazılım araçları kullanılabilir (Spider, Eman veya Relion)^46,47,48.

3. Polimerizasyon analizi ile septin fonksiyonel kalite kontrolü

NOT: İşlevsellik kalite kontrolü, polimerize septin komplekslerinin tespitine izin veren bir dizi görüntüleme tekniğinden oluşur. Aşağıda, etiketlenmemiş septinler "karanlık" septinler olarak adlandırılır ve etiketlenmemiş septinleri polimerize etmek için kullanılan tampon "karanlık" septin polimerizasyon tamponu (SPB) olarak adlandırılır.

1. Floresan mikroskobu ile septin demeti görüntüleme
   1. 5x fluoSPB (Tablo 2) ve %90 koyu septin ve %10 msfGFP-septinden oluşan septin karışımını, septin tamponu + 1 mM DTT'de istenen nihai konsantrasyondan altı kat daha yüksek konsantrasyonda hazırlayın. Bu tahlil için tipik bir konsantrasyon 300 nM'dir ve bu nedenle konsantrasyon bu karışım için 1.800 nM'dir.
   2. Bu özel sırayla, I-suyu (istenen son hacme kadar doldurmaya yetecek kadar), %20 5xfluoSPB (1:5'lik son seyreltme), 0,05 μM PCD ve %16,67 septin karışımını (1:6'lık son seyreltme) karıştırarak septini polimerize edin. 10 μL için, 6.23 μL I-su, 2 μL 5xfluoSPB, 0.1 μL PCD (5 μM stoğu ile) ve 1.67 μL septin karışımı karıştırın. Bu karışımı oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin.
   3. Numuneleri fluoSPB ile yıkanmış bir görüntüleme odasına ekleyin (Tablo 2) ve septin demetlerini görüntüleyin. PLL-PEG pasifleştirilmiş akış kanalları, önceki araştırma^10,32'de açıklandığı gibi^, bu deney için iyi çalışır.
2. Negatif leke iletimi elektron mikroskobu ile septin demeti hayal etme
   1. 5x darkSPB (Tablo 2) ve septin tamponu + 1 mM DTT'de istenen son konsantrasyondan altı kat daha yüksek konsantrasyonda% 100 koyu septinden oluşan bir septin karışımı hazırlayın. Bu tahlil için tipik bir konsantrasyon 300 nM'dir ve bu nedenle konsantrasyon bu karışım için 1.800 nM'dir.
   2. Septin komplekslerini, bu özel sırayla, I-suyu (istenen son hacme kadar doldurmaya yetecek kadar),% 20 5xdarkSPB ve% 16.67 septin karışımını karıştırarak polimerize edin. 5 μL için, 3.16 μL I-su, 1 μL 5x darkSPB ve 0.83 μL septin karışımı karıştırın. Bu karışımı oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin.
   3. Parıltılı elektron mikroskobu ızgarasına 3-5 μL numune ekleyin ve 1 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, sıvıyı bir filtre kağıdı ile emerek ve bir damla koyu SPB tamponu ekleyerek ızgarayı 2x darkSPB ile yıkayın (Tablo 2), 1x'i I-su ile yıkayın,% 2 uranil asetat ile ~ 30 s inkübe edin, lekeyi lekeleyin ve numuneyi birkaç dakika boyunca hava ile kurutun.
   4. Septin demetlerini 120 kV'ta ve 5.000x ile 60.000x arasındaki büyütmeleri 1-2 μm arasında bir bulanıklaştırma ile görüntüleyin.

Sonuçlar

Protokolde belirtildiği gibi, iki septin eksprese eden plazmid ile birlikte dönüştürülmüş 5 L E. coli hücresi büyütüldü ve septinlerin ekspresyonu IPTG eklenerek indüklendi. 3 saat sonra, hücreler santrifüjleme ile toplandı, lizis tamponunda yeniden askıya alındı ve sonikasyon ile lize edildi. Lisat daha sonra santrifüjleme ile netleştirildi ve berraklaştırılmış çözelti bir HisTrap sütununa uygulandı (Şekil 2A). İlk saflaştırmadan sonra, septin içeren fraksiyonlar bir araya getirildi ve bir StrepTrap sütununa uygulandı (Şekil 2B). Bu tipik olarak yaklaşık 3-5 mL ~ 1 μM septin kompleksi verir. Septin içeren fraksiyonları bir araya getirmeden önce, septin alt birimlerinin bütünlüğünü ve kompleksi oluşturan farklı septin alt birimleri arasındaki equimolar stokiyometrik oranı kontrol etmek için denatüre jel elektroforezi kullanılabilir. (Şekil 3A). Jel, septin alt birimlerinin moleküler ağırlıklarına (Tablo 3) karşılık gelen benzer şekilde yoğun bantlar gösteriyorsa, protokole devam edilebilir. Değilse, protokolü yeniden başlatmanız önerilir. SEPT9_i1 sahip insan septin oktameri için gösterilen örnekte, Şekil 3A

Tartışma

Burada açıklanan yöntem, önceden oluşturulmuş septin hetero-oligomerlerinin sağlam saflaştırılmasına ve kalite kontrolüne izin verir. Yöntemin doğru uygulanması için göz önünde bulundurulması gereken temel konulardan bazıları şunlardır. Kromatografik ayırmalardaki elüsyon adımları sırasında, septin komplekslerinin seyreltilmesini en aza indirmek için önerilen (veya daha düşük) akış hızını kullanmak önemlidir. Ek olarak, son konsantrasyon adımı sırasında proteinin geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için, yoğunlaştırıcı kolon, çözelti filtreye karşı itilmeyecek şekilde yönlendirilir (yalnızca bir tarafta bir filtre olduğunda). Çözelti doğrudan filtreye giderse, protein ona çok daha fazla yapışır ve nihai verimi önemli ölçüde azaltır. Konsantrasyon adımının her zaman gerekli olmadığını düşünmek de önemlidir. Fraksiyonları sadece kromatogramdaki tepe noktasının etrafındaki dar bir aralıktan toplamak, çoğu sulandırma uygulaması (genellikle 10-300 nM arasında çalışan) için genellikle yeterince yüksek bir stok konsantrasyonu (>3.000 nM) verir. Son olarak, floresan mikroskobu ile septin komplekslerinin işlevselliğinin kalite kontrolü için, septin kompleksleri cama hevesle yapıştığından, mikroskopi slaytlarının yüzeyini doğru şekilde pasifleştirmek önemlidir. Cam slaytların pasivasyonu, PLL-PEG fonksiyonelleştirmesi yoluyla veya nötr (% 100 DOPC) destekli lipit çift katmanlı^11,32 oluşumu ile yapılabilir.

İlk olarak Iv ve ^ark.10'da açıklanan orijinal saflaştırma protokolü ile karşılaştırıldığında, tampon bileşimlerinde bir değişiklik vardır (Tablo 2). MgCl 2 konsantrasyonu 5 mM'den₂ mM'ye düşürüldü ve Tris-HCl'nin konsantrasyonu ve pH'ı sırasıyla 50 mM'den 20 mM'ye ve 8.0'dan 7.4'e düşürüldü. Bu değişiklikler, tampon koşullarının, insan septinlerinin lipid çift katmanları, aktin filamentleri ve mikrotübüller ^10,11,32 ile etkileşimleri üzerine yapılan çalışmalarla uyumlu hale getirilmesi için yapılmıştır. Bunun nedeni, yazarların, F-tamponunda ATP'nin varlığının yanı sıra, bileşimi darkSPB'ninkiyle aynı olan F-tamponunda desteklenen lipit çift katmanları ve polimerize aktin oluşturmasıdır. Tampon değişimi, orijinal tamponlara kıyasla saflaştırılmış septinlerin kalitesinde veya ömründe herhangi bir değişiklik yaratmadı.

Bu saflaştırma yönteminin hala birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, farklı saflaştırma girişimleri, saflaştırılmış septin komplekslerinin demet oluşum kabiliyeti ile kontrol edildiği gibi, verim (0.5-1 mL 2-5 μM septin kompleksleri) ve fonksiyonel kalite bakımından değişebilir. Bu nedenle, bu makalede açıklanan kalite kontrollerini tutarlı bir şekilde yapmak çok önemlidir. İfade sürelerini ve bakteri kültürünün optik yoğunluğunu çok iyi kontrol etmek, verimdeki farkı azaltmaya yardımcı olabilir. İkincisi, bu arıtma boru hattı trimerler ve heksamerler veya tetramerler ve oktamerler arasında ayrım yapamaz (Şekil 1B). Bununla birlikte, kalite kontrol deneyleri, septin komplekslerinin çoğunun uzun oligomer formunda olduğunu kanıtlamak için kullanılabilir. Daha dar bir oligomer boyut dağılımının gerekli olması durumunda, adım 1.6 arasına boyut dışlama kromatografisi eklenebilir. ve adım 1.7. arıtma protokolünün. Bununla birlikte, bu isteğe bağlı adım, verimi önemli ölçüde azaltır ve kesinlikle gerekli olmadıkça önerilmez. Sonuncu, daha temel bir sınırlama, E. coli'nin rekombinant septin kompleksleri için bir ekspresyon sistemi olarak kullanılmasından kaynaklanmaktadır. Doğal olarak, bu sistem fosforilasyon, asetilasyon ve sumoilasyon 6,51,52,53 gibi hayvan hücrelerinde bildirilen post-translasyonel modifikasyonlara (PTM'ler) izin vermez. Bu posttranslasyonel modifikasyonlar, böcek veya insan hücrelerinde benzer bir saflaştırma stratejisi uygulanarak eklenebilir. Dahası, bu makale sadece septinlerin kendi başlarına yeniden yapılandırılmasını tartışmıştır, ancak hücrelerde yapılan çalışmalar, Borg ailesi 54,55 ve anilin 24,25,56'dan proteinler gibi düzenleyici proteinlerin, septinlerin montajı ve işlevleri üzerinde önemli ancak az anlaşılmış etkilere sahip olabileceğini ve bu nedenle in vitro olarak dahil edilmesinin önemli olduğunu göstermektedir. Çalışmaları. Borg proteinlerinin ve anilinin saflaştırılması için protokoller^54,57 olarak bildirilmiştir.

Burada bildirilen septin saflaştırma protokolü, septinleri oligomer formlarında doğru alt birim stokiyometri ile saflaştırmak için standartlaştırılmış bir yol sunarak, tek septin alt birimlerine dayanan daha önceki birçok in vitro çalışmaya göre önemli bir ilerleme sunmaktadır. Belirli bağlamlardaki bazı septinler tek bir alt ünite² olarak işlev görse de, mevcut literatür organı, hayvan hücrelerinde septinlerin çoğunlukla ^9,58 komplekslerinde işlev gördüğünü kuvvetle önermektedir. Bu nedenle, bu makalede ve diğerlerinde ^{10,11,18,32,35,36,37} olarak tanımlananlar gibi önceden oluşturulmuş hetero-oligomerlerin kullanımı^, septinlerin yapısal ve biyofiziksel özelliklerini in vitro yoluyla incelemek için büyük önem taşımaktadır. hücredeki işlevlerini incelemek için yeniden yapılanma. Ayrıca, septinler, membran ve sitoiskelet de dahil olmak üzere birçok etkileşim ortağına sahip kendi kendine birleşen proteinlerdir, bu da onları aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji^59,60,61 ve eğrilik^42,62,63 gibi membran biyofiziksel özelliklerinde protein kaynaklı değişikliklerin incelenmesi için büyük ilgi uyandırır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
488nm lazer birleştirici iLAS2	Gataca		TIRF mikroskobu
488nm Safir lazer çizgileri	Tutarlı		Konfokal mikroskop
4k X 4k F416 CMOS kamera	JEM-1400plus için	TVIPS
4x örnek arabelleği nativePAGE	Thermo Fisher scientific	BN2003
6-Hidroksi-2,5,7,8-tetrametilroman-2-karboksilik asit (TROLOX)	Sigma-Aldrich	238813	Yanıp sönmeyi önlemek için
AKTA saf 25 M1	GE sağlık	1680311
Ampisilin	Sigma-Aldrich	A9518-25G
Karbon Tip-B, 300 gözlü EM ızgara	Ted pella	01813-F
Karbon Tip-B, 300 gözlü EM ızgara	Elektron mikroskopi bilimleri	CF300-Cu
Kapak camı #1.5H	Thorslabs	CG15KH
CSU-X1-M1 konfokal ünite	Yokogawa		Konfokal mikroskop
Desthiobiotin	Sigma-Aldrich	D1411-1G
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779
DNAse	Sigma-Aldrich	10104159001
DOPC	Avanti Polar Lipidler	850375C
Eclipse Ti2-E	Nikon cihazları		Konfokal mikroskop
EDTA içermeyen proteaz inhibtör kokteyli	Roche	481761
HisTrap HP, 5 mL	GE healthcare	29-0588-3
iLAS2 azimut TIRF aydınlatma sistemi	Gataca		TIRF mikroskobu
İmidazol	Sigma-Aldrich	1202-1KG
InstantBlue Protein Jel Lekesi	Westburg Yaşam Bilimleri	EP ab119211
İzopropil ve beta;-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)	Thermo Fisher bilimsel	10849040
iXon Ultra 888 EMCCD kamera	Andor		Konfokal mikroskop
iXon Ultra 897 EM-CCD	Andor		TIRF mikroskobu
JEM-1400plus	JOEL		TEM mikroskobu TUDelft
kappa-cassein	Sigma-Aldrich	C0406
LB suyu	Sigma-Aldrich	L3022-6X1KG
Lizozim	Sigma-Aldrich	62971-10G-F
Magnezyum Klorür	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Magnezyum sülfat	Sigma-Aldrich	746452-1KG
Metilecllulose	Sigma-Aldrich	8074844
MilliQ sistemi (İntegral 10)	Merck-Millipore		I-su sebili
Mini protean TGX jeller	BIORAD	4561086
NativeMark lekesiz protein standardı	Invitrogen	LC0725	iSCAT ve Native jeller için
NativePAGE %4-16 JEL	Thermo Fisher bilimsel	BN1002BOX
NativePAGE Koşu Tamponu kiti	Thermo Fisher bilimsel	BN2007
Nikon Ti2-E	Nikon aletleri		TIRF mikroskobu
Nr. 1 Menzel lameller	Thermo Fisher bilimsel	11961988
parafilm	Sigma-Aldrich	P7668
Planı Apo & zamanları; 100/1.45 NA yağa daldırma objektifi	Nikon aletleri		Konfokal mikroskop
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
Poli(L-lizin)-greft-biyotinillenmiş PEG (PLL-PEG)	SuSoS	CHF560.00
Poli-L-lizin çözeltisi %0.01	Sigma-Aldrich	P4832	iSCAT cam slaytlar için
Pottassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9541-1KG
Doğal jeller için güç kaynağı	CONSORT	S/N 71638
POWERPAC UNIVERSAL	BIORAD	042BR31206
Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	oksijen tutucu - enzim
Protocatechuic asit (PCA)	Sigma-Aldrich	03930590-50MG	oksijen tutucu - reaktif
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110
Quemesa kamera	Olympus		Tecnai Spirit
Refeyn OneMP	Refeyn
için Örnek tampon, laemmli 2x konsantre	Sigma-Aldrich	S3401-10vl
Silikon contalar	Sigma-Aldrich	GBL103250-10EA
Slide-A-Lyzer Diyaliz kasetleri 30k MWCO 3mL	Thermo Fisher scientific	66381
Spektinomisin	Sigma-Aldrich	PHR1441-1G
StrepTrap HP, 1 mL	GE sağlık	28-9075-46
Tecnai Spirit mikroskobu	Thermo Scientific, FEI		TEM mikroskobu Enstitüsü Curie
Müthiş et suyu	Sigma-Aldrich	T0918-1KG
Tris/Glyine/SDS tamponu	BIORAD	1610772
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941-1KG
Ultrasonik temizleyici	Branson	CPX2800H-E
Vivaspin 6, 30.000 MWCO PES	Sartorius	VS0622