Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme

Patojenler tarafından hücre dışı vezikül (EV) salınımı, bulaşıcı hastalıkları kontrol etmek için yeni teknolojilerin kilidini açmanın anahtarı olabilir¹. Mycobacterium tuberculosis (Mtb), dünya nüfusunun yaklaşık üçte birini enfekte eden ve her yıl milyonlarca insanın hayatına mal olan yüksek sonuçlu bir patojendir². Mtb tarafından EV üretimi, enfeksiyon^bağlamında bu EV'lerin biyogenezinde ve çeşitli rollerinde (yani, immünostimülatör, immünosüpresif, demir ve besin edinimi) iyi belgelenmiştir, ancak zordur ^3,4,5. Mtb EV'lerin bileşimini anlama çabaları, immünolojik öneme sahip lipitler ve proteinler içeren plazma zarından türetilen 50-150 nm lipid membranı ile kaplı küreleri ortaya çıkardı ^3,6. Mtb EV'lerin bakteriyel fizyolojideki rolünün araştırılması, hayatta kalma için çevresel strese yanıt olarak bakteriyel EV modülasyonunun önemini ortaya koymuştur⁵. Konakçı-patojen etkileşim çalışmalarının yorumlanması daha karmaşık olmuştur, ancak kanıtlar Mtb EV'lerin konakçının bağışıklık tepkisini etkileyebileceğini ve potansiyel olarak etkili bir aşılama bileşeni^olarak hizmet edebileceğini göstermektedir ^3,4,7.

Mtb EV'ler üzerinde şimdiye kadar yapılan çalışmaların çoğu, vezikül zenginleştirme⁸ için yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemesine dayanmaktadır. Bu, küçük ölçekli çalışmalar için etkili olmuştur; Bununla birlikte, bu tekniğin çeşitli teknik ve lojistik zorlukları vardır. Alternatif iş akışları, tüm hücrelerin ve büyük kalıntıların giderilmesi için çok adımlı santrifüjlemeyi, pelet EV'lere son bir ultrasantrifüjleme adımıyla birleştirir. Bu metodoloji verimlilikte değişebilir ve genellikle düşük verim ve vezikül ile ilişkili olmayan biyomoleküllerin birlikte saflaştırılması ile sonuçlanırken, aynı zamanda vezikül bütünlüğünü de etkiler⁹. Ek olarak, bu işlem zaman alıcıdır, manuel olarak yoğundur ve ekipman kısıtlamaları nedeniyle verim açısından çok sınırlıdır.

Mevcut protokol, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemeye alternatif bir teknik tanımlamaktadır: boyut dışlama kromatografisi (SEC). Bu yöntem çevresel mikobakteriler için gösterilmiştir ve mevcut çalışmada Mtb^10'a ekstrapolasyon yapılmıştır. Ticari olarak temin edilebilen bir kolon ve otomatik fraksiyon toplayıcı, vezikal preparatta tutarlılığı artırabilir ve spesifik, pahalı ekipman ihtiyacını azaltabilir. Bu protokolü, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ile karşılaştırıldığında zamanın bir kısmında tamamlamak ve verimi artırmak da mümkündür. Bu teknik teknik olarak daha az zordur, ustalaşmayı kolaylaştırır ve laboratuvarlar arası / laboratuvar içi tekrarlanabilirliği artırabilir. Son olarak, SEC yüksek ayırma verimliliğine sahiptir ve veziküllerin bütünlüğünü koruyan naziktir.

Colorado Eyalet Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi bu çalışmayı onayladı (19-046B). Mycobacterium tuberculosis yetiştiriciliği ve EV bakımından zengin kültür süpernatantlarının toplanması, yüksek muhafazalı bir laboratuvarda eğitimli personel tarafından gerçekleştirildi. Malzemeler, geçerli bir inaktivasyon yöntemi uygulandıktan sonra, kurumsal biyogüvenlik politikaları tarafından onaylandıktan ve onaylandıktan sonra yüksek muhafazalı alandan çıkarıldı. Protokolün çoğaltılması sırasında, doğrulanmış inaktivasyon veya steril filtrasyon yöntemi mümkün değilse, aşağıdaki prosedürlerin yüksek muhafazalı bir laboratuvarda gerçekleştirilmesi gerekir.

1. Ham Mtb EV konsantresinin hazırlanması

NOT: Mtb yetiştiriciliği ve kültür filtrat proteininin (CFP) hazırlanması ile ilgili ayrıntılı prosedürler için bakınız Referans^11,12. Bakteriyel kültür ortamının, Oleik Albümin Dekstroz Katalaz (OADC) gibi EV içeren veya proteinli bileşenlere sahip büyüme takviyelerinden ve Tween gibi deterjanlardan arındırılmış olması önerilir. Ayrıca, sınırlı hücre ölümü ve lizis^13,14 sağlamak için bakteri kültürünün kalitesinin ve hasat edilen CFP'nin taranması önerilir.

1. Fosfat tamponlu salinin (1x PBS) tam hacim kapasitesini ekleyerek 100 kDa moleküler ağırlıklı kesme (MWCO) santrifüj filtre hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). 4 °C'de 2.800 x g'de 5 dakika santrifüj.
   NOT: Ölü durdurma hacmi olmayan bir filtre kullanılıyorsa, numune hacminin filtre seviyesinin altına düşmemesine dikkat edilmelidir, bu da santrifüjleme sırasında filtrenin tamamen kurumasına neden olur.
2. Numune haznesini Mtb CFP ile maksimum kapasitesine doldurmadan önce akışı ve kalan PBS'yi atın. 4 °C'de 2.800 x g'de santrifüj, ultrafiltrasyon cihazının minimum hacmine düşene kadar. Gerektiğinde tekrarlayın, numunenin tamamı yeterince azaltılana kadar üniteye daha fazla CFP ekleyin.
   NOT: İsterseniz aşağı akış kalifikasyonu için 100 kDa akış (100F) malzemesinin bir kısmını saklayın. 4 °C'de saklayın.
3. Toplam cihaz kapasitesine kadar konsantreyi içeren filtre ünitesine 1x PBS ekleyin. Ses düzeyini 1.2'de açıklandığı gibi azaltın. Tam yıkama ve tampon değişimini sağlamak için bu adımı beş kez tekrarlayın.
4. 100 kDa konsantre CFP retentatını (100R) ultrafiltrasyon cihazı spesifikasyonlarına göre geri kazanın (bkz. 100R geri kazanıldıktan sonra, filtreyi en az üç kez minimum 1x PBS hacmiyle yıkayın ve geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için yıkamayı 100R ile birleştirin.
5. 100R malzemeyi, üreticinin talimatlarını izleyerek bikinkoninik bir tahlil (BCA) ile kantitatlandırın (bkz. Testi gerçekleştirmek için, PBS'de 1:2, 1:5 ve 1:10 örneklerinin birkaç seyreltilmesini kullanın. Numuneyi üçlü olarak test edin.
   NOT: İsterseniz aşağı akış kalifikasyonu için 100R malzemenin bir kısmını saklayın. 4 °C'de saklayın.

2. CFP'den Mtb EV'lerin zenginleştirilmesi için boyut hariç tutma kromatografisi

NOT: Aşağıdaki prosedür, SEC sütunu ve otomatik fraksiyon toplayıcı ile 3 mg 100R Mtb CFP kullanımı için özeldir (AFC , bkz. Üreticinin spesifikasyonlarına uyarak diğer başlangıç konsantrasyonları ve kolon tipleri için uyarlanabilir. Ek olarak, kullanıcıların otomatik kesir toplayıcı kullanım kılavuzunu okumaları ve anlamaları önerilir.

1. SEC sütununun oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
2. Kule ünitesinin arkasındaki güç düğmesini kullanarak AFC'yi açın ve gerekirse ana menü dokunmatik ekranında AYARLAR düğmesine basarak yük hücresinin ayarlarını yapın. Yük hücresi yalnızca ilk kullanımda, her yazılım güncellemesinden sonra ve kesir toplama hacimlerinde tutarsızlık fark edilirse kalibre edilmelidir.
3. KURULUM ekranından, CAROUSEL > CALIBRATE'i seçerek döngüyü hizalayın. Atlıkarınca 13 küçük delik AFC kulesine bakacak şekilde yerleştirin ve - ve/veya + düğmelerine basarak karuseli sıvı nozulu doğrudan yıkama konumunun üzerinde olacak şekilde ayarlayın.
4. Dengelenmiş SEC sütunundan kapakları kaldırın. SEC sütununu uygun sütun yuvasına kaydırın ve AFC kulesine dikkatlice takın. AFC'ye bakan sütundaki radyo frekansı tanımlama (RFID) etiketinin bulunduğundan emin olun ve sütun ile valf arasındaki bağlantının sağlam olup olmadığını kontrol edin. Atık çıkış borusunu bir toplama kabına yerleştirin.
5. KURULUM ekranından Koleksiyon Programı'nı seçin ve - ve/veya + düğmelerine basarak sayıyı 13'e, boyutu ise 0,5 mL'ye ayarlayın. "Arabellek Birimi" ayarını varsayılan 2,7 mL olarak bırakın ve ardından X tuşuna basarak "Toplama Programı" penceresini kapatın.
6. Giriş ekranından COLLECT'i BAŞLAT'ı seçin ve EVET'i seçerek koleksiyon parametrelerini onaylayın. 13 etiketli 1,7 mL mikrosantrifüj tüplerini, kapakları açık ve atlıkarınca merkezine doğru işaret edecek şekilde yükleyin.
7. Tamam'ı seçerek AFC'yi ilerletin, ardından sütun rezervuarını takın ve Tamam tuşuna basarak tekrar ilerleyin. EVET tuşuna basarak sütunu temizleme seçeneğini belirleyin ve depolama arabelleğini kaldırmak için 0,2 μm filtrelenmiş PBS'lik bir sütun hacmi ekleyin. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, Tamam düğmesine basarak AFC'yi ilerletin.
8. Dönen kapağı AFC'nin üzerine yerleştirin ve Tamam'a basın. 0,2 μm filtrelenmiş PBS'lik bir sütun hacmi hazırlayın. Sütundaki fazla tamponu çıkarmak için pipet kullanın.
9. 1x PBS ile adım 1.5 ila 500 μL'de ölçülen 3 mg 100R numune getirin. 3 mg'lık örneği sütunun en üstüne ekleyin. AFC'yi ilerletin ve numunenin frit'e girmesine izin verin. Örnek sütuna tamamen girdikten sonra, adım 2.6'da hazırlanan PBS'yi rezervuara ekleyin.
10. AFC'nin çalışmasını izlerken önce boşluk hacmini ve ardından belirtilen kesirleri toplar. Çalıştırma tamamlandıktan ve atlıkarınca atık konumuna döndükten sonra, kapağı çıkarın ve fraksiyon tüplerini döngüden çıkarın. Kesirleri nicelleştirme (adım 3) ve kalifikasyondan (adım 4) önce 4 ° C'de saklayın.
11. Sütun yeniden kullanılacaksa, EVET tuşuna basarak sütunu temizleme seçeneğini belirleyin; aksi takdirde, HAYIR tuşuna basın. AFC'deki yönergeleri izleyin.
    NOT: Sütun yıkandıktan ve depolama arabelleği geçtikten sonra, 4 °C'de çıkarılabilir, kapatılabilir ve saklanabilir.

3. Mtb EV'lerin nicelleştirilmesi

1. BCA ve mikro BCA¹² kullanarak her fraksiyon için protein konsantrasyonunu ölçün.
   1. 3 mg 100R Mtb CFP'den toplanan 0,5 mL fraksiyonlar için, her bir numunenin 1-7'sini üçlü olarak numaralandırılan fraksiyonlar için 1: 3 seyreltme ile mikro BCA'yı kullanın.
   2. 5-13 olarak numaralandırılmış 0,5 mL fraksiyonlar için, üçlü olarak her numune için seyreltme olmadan BCA'yı kullanın.
      NOT: 5-7 kesirleri için tahlillerin üst üste binmesi, tüm kesirlerin okunabilir bir çıktıya sahip olmasını sağlamaya yardımcı olacaktır.
2. Nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanarak her fraksiyon için partikül konsantrasyonunu sayısallaştırın.
   1. Aşağıdaki önerilen başlangıç oranlarını kullanarak numuneleri 1 mL 1x PBS içinde seyreltin; 1-3 kesirleri için 1:100 kullanın ve ardından kalan kesirler için 1:10 seyreltme kullanın.
   2. Seyreltilmiş çözeltileri vorteksleyin ve ardından numuneyi 1 mL'lik tek kullanımlık bir şırıngaya çekin. Şırıngayı varsa otomatik bir şırınga pompasına yerleştirin.
   3. Şırınga pompasını 30 μL / dak'ya ayarlayın ve video yakalama ayarlarını 10-12 ekran kazancı ve 10-12 kamera seviyesi ile kullanın. Her örnek için odağı ayarlayın.
   4. Sabit bir akış kullanarak her biri 30 sn'de en az üç video toplayın.
   5. Yazılım algılama eşiği beş olarak ayarlanmış olarak analizi gerçekleştirin.
      NOT: Önemli numune hacminden ödün vermeden en son fraksiyonlar (>7) için NTA verileri elde etmek mümkün olmayabilir.

4. Mtb EV'lerin Yeterliliği

1. Gümüş lekeli bir protein jeli kullanarak her fraksiyonun genel protein profilini görselleştirin.
   NOT: SDS-PAGE ve gümüş lekesi için ayrıntılı prosedürler Referans^15'te bulunabilir.
   1. SDS numune tamponunu her fraksiyonun 10 μL'sine ve 5 μg CFP, 100R ve 100F'ye ekleyin. 100 °C'de 5 dakika kaynatın, ardından poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) için moleküler ağırlıklı bir merdivenle% 4 -% 12'lik bir Bis-Tris Jeli üzerine yükleyin (bkz.
   2. Jeli 1x 2-[N-morfolino] etansülfonik asit (MES) çalışan tampon (bkz. Malzeme Tablosu) ve 35 dakika boyunca 200 V akım kullanarak çalıştırın.
   3. Jeli kasetten çıkarın ve gümüş boyama¹⁵ ile devam edin.
2. Her fraksiyondaki EV belirteçlerinin varlığını veya yokluğunu Western blot ile değerlendirin.
   NOT: Batı lekelemesi için ayrıntılı prosedürler Referans^15'te bulunabilir.
   1. 4.1.1-4.1.2 adımlarında açıklandığı gibi bir SDS-PAGE jeli çalıştırın.
   2. Jeli kasetten çıkarın ve çözünmüş proteinleri en az 1 saat boyunca 50 V'luk bir akım uygulayarak 0.2 μm'lik bir nitroselüloz membrana aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   3. İlgilenilen proteinleri değerlendirmek için Batı leke analizi yapın. LpqH, lipoarabinomannan (LAM) ve GroES'e karşı birincil antikorlar (bakınız Malzeme Tablosu) önerilir.
   4. Havuz fraksiyonları, aşağı akış uygulaması için geçerli olan işaretleyicilerin varlığına veya yokluğuna dayanır.
3. İletim elektron mikroskobu (TEM) ile sağlam veziküllerin varlığını doğrulayın.
   1. Vezikül numunesinin 15 μL'sini, 15 μL% 4 EM dereceli paraformaldehit ekleyerek sabitleyin ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
   2. Yüzeyi temizleyerek ve hidrofilik bir substrat yaparak 200 örgülü formvar-karbon kaplı bakır TEM ızgarası hazırlayın.
      NOT: 1 dakika boyunca %95 argon, %5 oksijen ve %30 plazma gücü ile plazma temizliği önerilir.
   3. Sabit numunenin 10 μL'sini ızgaraya bırakın ve numunenin 10 dakika boyunca yapışmasını bekleyin, ardından fazla sıvıyı filtre kağıdıyla temizleyin.
   4. Izgarayı 30 saniye boyunca bir damla ultra saf su üzerinde yüzdürün, ardından fazla sıvıyı temizleyin.
   5. Izgarayı 2 dakika boyunca% d% EM dereceli uranil asetat damlası üzerinde yüzdürün, ardından fazla sıvıyı temizleyin.
   6. Izgaranın tamamen kurumasını bekleyin.
   7. 100 kV veya benzeri bir TEM (bkz. Malzeme Tablosu) kullanan görüntü.
      NOT: Aşağı akış uygulamalarına dayalı olarak diğer EV kantitasyon ve karakterizasyon yöntemleri kullanılmalıdır. Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi^18, tüm EV çalışmalarının titizliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için kılavuzlar için başvurulmalıdır.

Mycobacterium tuberculosis'ten (Mtb) kültür filtrat proteini (CFP) konsantre edildi, nicelleştirildi ve daha sonra bir boyut dışlama kromatografisi (SEC) kolonuna 3 mg materyal uygulandı. Protein ve parçacık konsantrasyonları sırasıyla BCA ve NTA ile numaralandırıldı. Protein ve partikül geri kazanımı için beklenen aralıklar ve bu sonuçlar için elde edilen kesin değerler Tablo 1'de bildirilmiştir. Bu aralıklardan çok daha yüksek değerler kontaminasyon veya kolon bütünlüğü sorunlarını gösterebilir. Önemli ölçüde daha düşük değerler, ultrafiltrasyon adımlarındaki sorunlara işaret eder ve bu nedenle, başarılı bir konsantrasyonun oluşup oluşmadığını belirlemek için akışın başlangıç CFP ve 100R ile karşılaştırılması gerekir. Spesifik olmayan bir protein gümüş boyası, daha sonraki fraksiyonların daha fazla protein içerdiğini ve 100R materyaline benzediğini göstermektedir (Şekil 1).

Fraksiyonların batı lekeleri, fraksiyonlar boyunca lipoarabinomannan (LAM) bulunduğunu ve daha sonraki fraksiyonların daha düşük yoğunluklu bantlama gösterdiğini göstermektedir (Şekil 2A, Ek Şekil 1). Mtb EVs 3,19'da mevcut olduğu bilinen 19 kDa lipoprotein LpqH, SEC'den en erken fraksiyonlarda zenginleştirilmiştir (Şekil 2B, Ek Şekil 1). 10 kDa chaperonin proteini GroES, SEC'in en erken fraksiyonlarında yoktur (Şekil 2C, Ek Şekil 1); Bu bulgu, GroES'in Mtb EV zenginleştirme12 sırasında bir kirletici olarak daha önce yayınlanmış çalışmalarla uyumludur ve Mtb EV varlığı için negatif bir kontrol görevi görür. İletim Elektron Mikroskobu (TEM) kapalı, membrana bağlı veziküllerin varlığını doğrular (Şekil 3A). Yoğunluk gradyanı ultrafiltrasyonu ile ayrılan Mtb EV'lerin ve bu SEC yönteminin karşılaştırılması Tablo 2'de bildirilmiştir. SEC, aynı CFP'den üç teknik kopya için daha yüksek protein ve parçacık geri kazanımı sağlar. Bu sonuçlar, birden fazla CFP partisinde tutarlı olmuştur (veriler gösterilmemiştir). Her iki yöntem de, TEM (Şekil 3) ve NTA (Şekil 4) tarafından gösterildiği gibi, beklenen boyut aralığında kapalı, membrana bağlı veziküllerle sonuçlanır.

Toplamda, bu veriler erken SEC fraksiyonlarında Mtb EV'lerin zenginleştiğini göstermektedir. En yüksek NTA değerleri 1-3 fraksiyonlarında meydana gelir ve fraksiyon sayısı arttıkça protein içeriği artar, bu da çözünür proteinlerin EV'lerden ayrıldığını gösterir (Tablo 1). Kesir 4, GroES'in kanıtlarını içerdiğinden (Şekil 2C, Ek Şekil 1), bu fraksiyon TEM için havuzlanmış materyale dahil edilmemiştir. Aşağı akış uygulamasına bağlı olarak, havuz oluşturma stratejisi için belirli kesirlerin dahil edilmesi veya hariç tutulması dikkate alınmalıdır.

Resim 1: Kesire göre gümüş lekesi. Gümüş ile boyanmış bir SDS-PAGE jel, her fraksiyon için genel protein profilini gösterir. CFP = 5 μg Mtb CFP, 100R = 5 μg 100R, 100F = 5 μg 100F, 1-11 = 10 μL SEC fraksiyonları 1-11. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kesire göre Batı lekeleri. (A) LAM, (B) LpqH ve (C) GroES'i tespit eden batı lekeleri, fraksiyonlar boyunca protein belirteci değişikliklerini gösterir. CFP = 5 μg Mtb CFP, 100R = 5 μg 100R, 100F = 5 μg 100F, 1-11 = 10 μL SEC fraksiyonları 1-11. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İletim Elektron Mikroskobu (TEM) görüntüleri. (A) Fiksasyondan önce toplanan SEC fraksiyonları 1-3. (B) Mtb EV'lerin yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlenmesi TEM görüntüleme için negatif boyandı. Ölçek çubukları = 200 nm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Nanopartikül İzleme Analizi (NTA) dağılımı. (A) SEC fraksiyonları 1-3. (B) Yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme Mtb EV'leri nanopartikül izleme analizi ile analiz edildi. Boyut dağılımı görüntülenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Fraksiyona göre protein ve partikül geri kazanımı. 3 mg başlangıç malzemesine dayanan fraksiyon başına beklenen protein ve partikül geri kazanım aralığı. Bu çalışmada kullanılan materyali elde etmek için kesin değerler en sağdaki iki sütunda yer almaktadır.

Tablo 2: Protein ve partikül geri kazanımının yöntem karşılaştırması. BCA ile ölçülen protein verimi ve aynı 100R başlangıç malzemesinin 3 mg'ından kaynaklanan Mtb EV'ler için NTA ile ölçülen toplam parçacık sayısı, referans verilen yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme yöntemi8 veya bu SEC yöntemi (üçlü) kullanılarak zenginleştirilmiştir.

Ek Şekil 1: Şekil 2'deki orijinal Batı lekeleri (kırpılmamış). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.