Hücre duvarı biyomekaniği çalışmaları, bitki büyümesini ve morfogenezini anlamak için gereklidir. Aşağıdaki protokol, atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak genç bitki organlarının iç dokularındaki ince primer hücre duvarlarının araştırılması için önerilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Bitki Organlarında Primer Hücre Duvarının Mekanik Özelliklerinin Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karakterize Edilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Birincil hücre duvarlarının mekanik özellikleri, bitki hücresi büyümesinin yönünü ve hızını ve dolayısıyla bitkinin gelecekteki boyutunu ve şeklini belirler. Bu özellikleri ölçmek için birçok sofistike teknik geliştirilmiştir; Bununla birlikte, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), hücresel düzeyde hücre duvarı elastikiyetini incelemek için en uygun olanı olmaya devam etmektedir. Bu tekniğin en önemli sınırlamalarından biri, sadece yüzeysel veya izole canlı hücrelerin incelenebilmesidir. Burada, bir bitki gövdesinin iç dokularına ait birincil hücre duvarlarının mekanik özelliklerini araştırmak için atomik kuvvet mikroskobunun kullanımı sunulmaktadır. Bu protokol, köklerdeki görünür Young'ın hücre duvarları modülünün ölçümlerini açıklar, ancak yöntem diğer bitki organlarına da uygulanabilir. Ölçümler, (i) plazmolize edici çözeltilerin veya balmumu veya reçine ile numune emprenye edilmesinin önlenmesine, (ii) deneylerin hızlı hale getirilmesine ve (iii) numunenin dehidrasyonunun önlenmesine izin veren sıvı bir hücredeki bitki materyalinin vibratom türevi bölümleri üzerinde gerçekleştirilir. Hem antiklinal hem de periklinal hücre duvarları, numunenin nasıl kesitlendiğine bağlı olarak incelenebilir. Farklı dokuların mekanik özelliklerindeki farklılıklar tek bir bölümde incelenebilir. Protokol, çalışma planlamasının ilkelerini, numune hazırlama ve ölçümlerle ilgili konuları ve ayrıca topografyanın elastik modülün elde edilen değerleri üzerindeki etkisini önlemek için kuvvet-deformasyon eğrilerini seçme yöntemini açıklar. Yöntem, örneklem büyüklüğü ile sınırlı değildir, ancak hücre boyutuna duyarlıdır (yani, büyük lümenli hücrelerin incelenmesi zordur).
Giriş
Bitki hücre duvarının mekanik özellikleri, hücrenin şeklini ve büyüme yeteneğini belirler. Örneğin, polen tüpünün büyüyen ucu, aynı tüpün büyümeyen kısımlarından daha yumuşaktır1. Arabidopsis meristemindeki primordia oluşumundan önce, gelecekteki primordium 2,3 bölgesinde hücre duvarı sertliğinde lokal bir azalma vardır. Arabidopsis hipokotilinin ana büyüme eksenine paralel olan ve daha hızlı büyüyen hücre duvarları, bu eksene dik olanlardan daha yumuşaktır ve 4,5 daha yavaş büyür. Mısır kökünde, hücrelerin böl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. AFM ölçümleri için numune hazırlama
- Bitki materyali: Mısır (Zea mays L.) ve çavdar (Secale tahıl gevrek L.) tohumlarını 10 dakika boyunca% 0.35'lik bir NaOCl çözeltisi ile sterilize edin, 3x'i damıtılmış suyla yıkayın ve daha sonra sırasıyla 4 gün ve 2 gün boyunca 27 ° C'de karanlıkta hidroponik olarak büyüyün. Deney için birincil kökler kullanıldı.
- Vibratom kesitleme için çözeltilerin ve numunelerin hazırlanması
- Bir mikrodalga fırın kullanarak% 3 (w / w) düşük erime noktalı agarozu suda çözerek kök gömme için agaroz çözeltisi hazırlayın.
NOT: Tüm deneyler suda yapılmıştır. Çalışma için tampon veya ba....
- Bir mikrodalga fırın kullanarak% 3 (w / w) düşük erime noktalı agarozu suda çözerek kök gömme için agaroz çözeltisi hazırlayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tipik elastik modül ve DFL haritalarının yanı sıra çavdar ve mısır köklerinde açıklanan yöntemle elde edilen kuvvet eğrileri Şekil 2'de sunulmuştur. Şekil 2A, çavdar birincil kökünün enine kesitinde elde edilen elastik modül ve DFL haritalarını göstermektedir. Modül haritasındaki beyaz alanlar (Şekil 2A, sol), tarayıcının z yönünde sınırına ulaşması nedeniyle Young modülünün hatalı bir şekilde abartılmasına karşılık gelir. Bu görünt.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Birincil hücre duvarlarının mekanik özellikleri, bitki hücresi büyümesinin yönünü ve hızını ve dolayısıyla bitkinin gelecekteki boyutunu ve şeklini belirler. Burada sunulan AFM tabanlı yöntem, bitki hücre duvarlarının özelliklerini incelemek için kullanılan mevcut teknikleri tamamlamaktadır. Bitkinin iç dokularına ait olan hücre duvarlarının elastikiyetinin araştırılmasını sağlar. Sunulan yöntem kullanılarak, büyüyen mısır kökünün farklı dokularındaki hücre duvarlarının mekanik özellikleri haritalandırıldı ve bu özellikl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Dr. Dmitry Suslov'a (Saint Petersburg Devlet Üniversitesi, Saint Petersburg, Rusya) ve Prof. Mira Ponomareva'ya (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Rusya) sırasıyla mısır ve çavdar tohumu sağladıkları için teşekkür ederiz. Sunulan yöntem, LK'ya verilen 18-14-00168 sayılı Rus Bilim Vakfı Projesi çerçevesinde geliştirilmiştir. Çalışmanın bir kısmı (sunulan sonuçların elde edilmesi), RAS FRC Kazan Bilim Merkezi için hükümet görevinin mali desteğiyle AP tarafından gerçekleştirildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Numune fiksasyonu için | agaroz, düşük erime noktası | Helicon | B-5000-0.1 |
| Fırça | - | bölüm hareketli | |
| Konsollar | için NanoTools, Almanya | NT_B150_v0020-5 | Model: Biyosfer B150-FM |
| Konsollar | NT-MDT, Rusya | FMG01 / 50 | Model: FMG01 |
| Siyanoakrilat yapıştırıcı | - | için vibratomi | |
| Vibratomi ve AFM kalibrasyonu için | cam slaytlar | Heinz Herenz | 1042000 |
| ImageAnalysis P9 Yazılımı | NT-MDT, | Rusya-veri | analizi için |
| Leica DM1000 epifloresan mikroskobu | Leica Biosystems, Almanya | Bölüm kontrolü için | 11591301 |
| NaOCl | - | tohum sterilizasyonu için | |
| Nova PX 3.4.1 Yazılımı | NT-MDT, | Rusya-HD | |
| denetleyicili NTEGRA Prima mikroskobu | NT-MDT, | Rusya-AFM | ve veri toplama için |
| Petri kabı 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | numune fiksasyonu için |
| Uçlu pipet 1000 ve mikro; L | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | |
| uçlu pipet 2-20 ve mikro; L | Thermo Fisher Scientific | 4642062-Ultra | |
| saf su | - | ||
| Vibratom Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Almanya | numune | kesitleme için 1404723512 |
Kaynaklar
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
