Plazmid DNA'sının Fare İskelet Kasına Elektroporasyonu

İskelet kası içine plazmid DNA elektroporasyonu in vivo olarak iskelet kası fizyolojisindeki değişiklikleri ve moleküler sinyallemeyi değerlendirmek için çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda gen ekspresyonunu modüle ederek önemli bir araçtır 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . İskelet kasına deneysel gen transferi, Wolff ve ark. tarafından 1990 gibi erken bir tarihte gösterilmiştir; burada hem RNA hem de DNA elektroporasyon olmadan başarılı bir şekilde aktarılmış ve lusiferaz ekspresyonu en az 2 ay boyunca korunmuştur¹⁰. Sadece enjeksiyonla nispeten düşük transfeksiyon etkinliği sorunludur ve Aihara ve Miyazaki, 1998 yılında bir pCAGGS-IL-5 yapısını tibialis anterior (TA) kasına elektroporasyon yaparak ve serum IL-5 ekspresyonu^11'i ölçerek elektroporasyon ile artan gen transferini göstermiştir. O zamandan beri, birçok çalışma, maksimum gen transfer verimliliğini sağlamak için farklı DNA konsantrasyonlarının, hacimlerinin ve elektroporasyon parametrelerinin etkinliğini araştırmıştır. Mir ve ark. voltaj, darbe sayısı, nabız süresi ve frekansın yanı sıra DNA konsantrasyonu da dahil olmak üzere farklı elektroporasyon parametrelerini test ettiler ve daha fazla voltaj, darbe sayısı ve DNA konsantrasyonunun hepsinin elektroporasyon verimliliğinin artmasına katkıda bulunduğunu belirlediler¹². Yüksek elektroporasyon voltajına yapılan önemli bir uyarı, miyoliflere artan DNA alımını kolaylaştırırken, aynı zamanda sonuçları karıştırabilecek kas hasarına neden olmasıdır. Schertzer ve ark., 200 V'ta elektroporasyonun, elektroporasyondan 3 gün sonra miyoliflerin yaklaşık% 50'sinde hasara neden olduğunu, oysa miyoliflerin sadece% 10'unun 50 V^13'te hasar gördüğünü göstermiştir. Etkili DNA transferini etkileyen değişkenleri kas hasarına karşı dikkate aldık ve etkili gen transferini gerçekleştirmek için santimetre kaliper genişliğinde 125 V'luk bir voltajın yeterli olduğunu bulduk.

Elektroporasyon sonrası kas lifi kesit alanının ve tüm kas kontraktilitesinin analizi, gen modülasyonuna bağlı kas büyüklüğü ve fonksiyonundaki değişiklikleri ölçme yönteminin önemli yönleridir. Biz ve diğerleri daha önce kontrol vektörlerinin elektroporasyonunun tek başına miyofiber alanda bir azalmaya neden olmadığını göstermiştir. Yeşil floresan protein (EGFP) yapısı, bu çalışmalarda DNA transfeksiyonunun yararlı bir floresan göstergesiydi^13,14. Bir dizi çalışma, elektroporasyon sonrası TA'nın in situ kontraktilitesini araştırmış ve değişen sonuçlar bulmuştur. Bir çalışma, 75 V / cm elektroporasyonun, elektroporasyondan 3 gün sonra tetanik kuvvette yaklaşık% 30'luk bir azalmaya neden olduğunu ve elektroporasyondan 7 gün sonra, tetanik kuvvetin kontrol seviyesine geri döndüğünü, 50 V / cm elektroporasyonun ise kuvvet ^13,15'ten ödün vermediğini göstermiştir. Başka bir çalışma, 180 V / cm elektroporasyondan 3 saat sonra% 30'luk bir tetanik kuvvet kaybı olduğunu ve 7 gün^16'dan sonra sahte kuvvet seviyelerine geri döndüğünü göstermiştir.

Aşağıdaki ayrıntılı prosedürde, farelerin TA ve ekstansör digitorum longus (EDL) kaslarında bir pcDNA3-EGFP plazmidinin enjeksiyonunu ve elektroporasyonunu gösteriyoruz. Ayrıca bu yöntemin EDL tüm kas kontraktilitesini etkilemediğini de gösteriyoruz. Amaç, fonksiyon kaybına neden olmadan miyoliflere etkili plazmid alımını göstermektir.

Hayvanları kullanan tüm deneyler, Penn State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan Penn State College of Medicine'de gerçekleştirildi ve 1964 Helsinki Deklarasyonu'nda ve daha sonraki değişikliklerinde belirtilen etik standartlara uygun olarak gerçekleştirildi. Bu işlem için 12 haftalık dişi C57BL/6 fareler kullanıldı. Tüm cerrahi aletler deneyden önce sterilite için otoklavlandı.

1. TA ve EDL enjeksiyon / elektroporasyon hazırlığı

NOT: Bu adımlar TA ve EDL enjeksiyon/elektroporasyon hazırlığı için aynıdır.

1. Deneyden önce steril PBS'de seyreltilmiş 1 μg / μL konsantrasyonuna ekspresyon plazmidi yapılarını saflaştırın. Bu prosedür için, pcDNA3-EGFP (GFP) veya pcDNA3 boş vektörünü (kontrol) saflaştırmak için ticari olarak temin edilebilen bir endotoksin içermeyen saflaştırma kiti kullanıldı.
2. Yeterli enjeksiyon hacmini sağlamak için plazmid konsantrasyonunu hesaplayın (50 μL steril PBS'de TA 50 μg DNA; 10 μL steril PBS) ve aliquot örneklerinde EDL 10 μg DNA.
3. Elektroporatör ayarlarını, seçilen tekerleği kullanarak ve aşağıdaki parametreleri seçmek için tekerleğe basarak programlayın: Mod - LV, Voltaj - 12,5 V / mm (enjeksiyon sırasında ayarlanacak), darbe uzunluğu - 20 ms, darbe sayısı - 5, aralık - 200 ms, polarite - tek kutuplu.
4. İzofluran gazı kullanarak fareleri anestezi altına alın. Fareleri% 5 izofluran içeren bir indüksiyon kutusuna yerleştirin. Forseps kullanarak ayak parmağı sıkışma refleksinin yokluğunda anestezinin cerrahi düzlemini onaylayın ve izofluranı% 2 bakım dozuna düşürün. Fareleri, prosedürün geri kalanı için 37 ° C'de dolaşımdaki bir su plakasına dayanan uygun bir burun konisine aktarın.
5. Küçük saç kesme makineleri kullanarak her iki arka bacaktan da saçları çıkarın. Enjeksiyon bölgesini sterilize etmek için alt ekstremiteleri alternatif% 70 etanol / betadin ile ovalayın.

2. TA enjeksiyon / elektroporasyon

1. Fare sırtüstü pozisyondayken, alt bacağın yan tarafındaki deriden görülebilen TA tendonunu bulun. Çıkarılabilir 30 G iğneli 50 μL'lik bir mikro şırınga kullanarak, iğne kasın üst ucuna ulaşana kadar miyotendinöz kavşaktan 1-2 mm daha üstün olan iğneyi sığ bir 5° açıyla yerleştirin.
   NOT: Kasın ortasına enjeksiyon amaçtır.
2. 50 μL plazmid çözeltisi vermek için iğneyi enjeksiyon yolu boyunca yavaşça geri çekerken pistonu yavaşça bastırın. Kas şişmelidir.
3. Zamanlayıcıyı 1 dakika boyunca ayarlayın ve TA'daki bacağın kalınlığını ölçün. Farenin boyutuna bağlı olarak, bu 5-10 mm arasında olabilir. Kaliper elektrotlarını ölçülen kalınlığa ayarlayın ve elektroporatör voltajını 12,5 V / mm'ye ayarlayın.
4. 1 dakika sonra, kumpas elektrotlarını alt ekstremitenin etrafına yerleştirin. Elektrotlar rahat olmalı ancak aşırı sıkı olmamalıdır. 20 ms süreli ve 200 ms aralıklarla 5 kare dalga darbesi verin (kas her nabızla seğirmelidir).
5. Kontrol vektörünü kullanarak alternatif uzuvla tekrarlayın.
6. Fareyi anesteziden çıkarın ve 37 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin. İyileştikten sonra, fareyi kafesine geri getirin.

3. EDL enjeksiyonu / elektroporasyon

1. Fare sırtüstü pozisyondayken, tibia kemiği ön tepesini görsel olarak ve nazik palpasyonla bulun.
   1. Bir neşter kullanarak, tibia ön kretinin lateral tarafındaki deriden dizden 5 mm daha düşük, TA miyotendinöz bileşkekten 2 mm daha üstün sığ bir kesi yapın.
   2. Küçük makas kullanarak, künt fasyayı disseke ederek TA kasını açığa çıkarır.
   3. Yine, makasla künt diseksiyon kullanarak, kası yanal olarak çekerek EDL'yi açığa çıkararak TA kasını tibiadan yavaşça ayırın. İşlem sırasında TA'yı EDL'den uzak tutmak için küçük, kavisli forsepsler kullanılabilir.
2. Çıkarılabilir 30 G iğneli 50 μL'lik bir mikro şırınga kullanarak, iğne kasın üst ucuna ulaşana kadar iğneyi EDL'ye uzunlamasına yerleştirin.
3. Plazmid çözeltisinin 10 μL'sini enjekte etmek için iğneyi enjeksiyon yolu boyunca yavaşça geri çekerken pistonu yavaşça bastırın (kas şişmelidir).
4. 1 dakika boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın ve EDL'deki bacağın kalınlığını ölçün. Farenin boyutuna bağlı olarak, bu 5-10 mm arasında olabilir. Kaliper elektrotlarını ölçülen kalınlığa ayarlayın ve elektroporatör voltajını 12,5 V / mm'ye ayarlayın.
5. 1 dakika sonra, kumpas elektrotlarını alt ekstremitenin etrafına yerleştirin. Elektrotlar rahat olmalı ancak aşırı sıkı olmamalıdır. 20 ms süreli ve 200 ms aralıklarla 5 kare dalga darbesi verin (kas her darbede seğirmelidir).
6. Kesiyonu tek kullanımlık 4/0 emilemeyen naylon sütürler kullanarak kapatın.
7. Alternatif uzuvla tekrarlayın veya uzuvları mutlak kontrol olarak el değmeden bırakın.
8. Fareyi anesteziden çıkarın ve 37 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin. Ameliyattan hemen sonra ve ameliyattan 12-24 saat sonra uygun bir subkutan analjezik uygulayın. İyileştikten sonra, fareyi kafesine geri getirin.
   NOT: Önceki çalışmalar, elektroporasyondan hemen sonra TA'da bir kas kontraktilitesi açığı olduğunu ve kontraktil iyileşmenin 3 gün boyunca gerçekleştiğini göstermiştir^13,15. Bu nedenle, hem TA hem de EDL kaslarının histoloji, protein ekspresyonu veya kas kontraktilitesi için analizi, elektroporasyondan 3-10 gün sonra gerçekleştirilir. EGFP'nin uzun süreli ekspresyonu, prosedür 13'ü takip eden³ haftaya kadar gözlenmiştir.

İskelet kasında gen transferini kolaylaştırmak için elektroporasyon, kas fizyolojisindeki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan yararlı bir tekniktir. Hem TA hem de EDL kaslarında verimli gen transferini gerçekleştirmek için ayrıntılı, adım adım bir prosedür gösterdik. Transfeksiyon verimliliğindeki farklılıklar bir dizi değişken nedeniyle ortaya çıkar. Bu değişkenler arasında elektroporasyon parametreleri (darbeler, voltaj, nabız süresi vb.), Gen yapı boyutu ve enjekte edilen DNA'nın konsantrasyonu / hacmi bulunur. Daha önce 125 V / cm'de 5 darbenin elektroporasyon parametrelerinin, 20 ms aralıklarla ayrılmış 20 ms süresi ile, TA14'te verimli gen transferini gerçekleştirmek için yeterli olduğunu göstermiştik. Ayrıca, mevcut çalışmada, DNA'nın enjeksiyon / elektroporasyonunun, deneyden 3 gün sonra EDL'de kas kontraktilitesi kaybına neden olmadığını da gösteriyoruz.

Gen transferini görselleştirmek için, bir pcDNA3-EGFP veya pcDNA3 (kontrol) yapısı, fare TA veya EDL kasına elektroporate edildi. İşlemden 3 gün sonra, TA veya EDL dikkatlice diseke edildi, optimum kesme sıcaklığı (OTC) ortamına yerleştirildi ve daha önce tarif edildiği gibi sıvı azot soğutmalı izopentan (2-metilbütan) içinde dondurulmuş donduruldu14,17,18,19. Her kasın orta göbeğinden alınan bir kriyostat kullanılarak 10 μm kas kesiti elde edildi. Kesitler daha sonra 5 dakika boyunca% 1 paraformaldehit içinde inkübe edildi, ardından PBS'de 3-5 dakika yıkandı. Bölümler daha sonra Texas Red'e konjuge edilmiş buğday tohumu aglutinininde inkübe edildi PBS'de karanlıkta 90 dakika boyunca 1:100 seyreltildi. Bölümler PBS'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez tekrar yıkandı. Kas bölümleri daha sonra sulu montaj ortamında kaplandı ve bireysel kas liflerini görselleştirmek için 594 nm dalga boyunda (kırmızı) ve GFP'yi tespit etmek için 480 nm dalga boyunda görüntülendi (Şekil 1A). PCDNA3 ile enjekte edilen kontrol kasları, potansiyel otofloresansı kontrol etmek için her iki kanalda da aynı pozlama ayarlarıyla görüntülendi. EGFP ile enjekte edilen / elektroporated edilen kaslar, pcDNA3-EGFP yapısının alımını gösteren pozitif yeşil lifler gösterirken, pcDNA3 (kontrol) ile enjekte edilen / elektroporated kaslar yeşil pozitif lif göstermedi. Biz ve diğerleri daha önce GFP pozitif liflerini (yeşil) aynı kas bölümleri 4,6,19 içindeki GFP eksprese etmeyen liflerle (siyah) karşılaştırarak miyofiber kesit alanının GFP ekspresyonundan ödün vermediğini göstermiştir. Daha düşük bir büyütmede görüntülendiğinde, EDL kas transfeksiyon verimliliği, yeşil liflerin (pozitif) siyah liflere (negatif) karşı ortaya çıkmasıyla görselleştirilir (Şekil 1B). Bu prosedürü kullanarak transfeksiyon etkinliği, 3 EDL kasında ölçüldüğü gibi% 56.6 ±% 4.7 idi. Bu veriler, TA kasının enjeksiyonu ve elektroporasyonunun etkili gen transferi için yeterli olduğunu göstermektedir. Ek olarak, EDL'nin enjeksiyonu ve elektroporasyonu, gen yapılarının verimli bir şekilde alınmasını sağlar.

İskelet kası fizyolojisinin değerlendirilmesinde önemli bir araç kas kontraktilitesinin ölçülmesidir. Önceki araştırmacılar, in situ olarak ölçülen TA'nın kontraktilitesinin, enjeksiyon ve arka ekstremite13'ün elektroporasyonundan sonra erken tehlikeye girebileceğini göstermiştir. Enjeksiyon ve elektroporasyondan sonra EDL kontraktilitesinin tehlikeye girip girmediğini test etmek için, EDL'yi cerrahi olarak maruz bıraktık, pcDNA3-EGFP veya yapı ile enjekte ettik ve arka bacağı elektroporate ettik. Bir kontrol olarak, alternatif uzuv karşılaştırma için dokunulmadan bırakıldı. Fareler 3 gün sonra ötenazi yapıldı ve EDL tüm kas kontraktilitesi, daha önce tarif edildiği gibi fizyolojik bir banyoda alan stimülasyonu kullanılarak ölçüldü 14,19,20,21. Kısaca, EDL diseke edildi ve tendonlar 4/0 ipek sütür ile paslanmaz çelik kancalara bağlandı ve bir kuvvet dönüştürücü ile statik taban arasında asılı kaldı. Kaslar, fizyolojik bir banyo çözeltisi (121 mM NaCl, 5.0 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2, 0.5 mM MgCl 2, 0.4 mM NaH2 PO4,24mM NaHCO3, 0.1 mM EDTA, 5.5 mM glikoz) olan Tyrode tamponunda yıkandı ve prosedür boyunca% 100 oksijen ile kabarcıklandı. Kas kasılması, supramaksimal bir uyaran vermek için platin elektrotlar kullanılarak uyarıldı. Kas optimal uzunluğu (Lo), prosedürün başlangıcında maksimum kuvveti verecek şekilde ayarlandı. Kuvvet-frekans ilişkisi, 1-150 Hz arasındaki stimülasyon frekansları kullanılarak belirlendi (supramaksimal voltajda 0.5 ms darbe). Kasın her stimülasyon arasında 3 dakika gevşemesine izin verildi. Stimülasyon prosedürü tamamlandıktan sonra, kasın ağırlığı ve uzunluğu ölçüldü. Spesifik kuvvet, mutlak kuvvetin tüm kas kesit alanına normalleştirilmesiyle hesaplandı; bu, ağırlığın uzunluğa bölünmesi olarak hesaplandı ve daha önce belirlenen kas yoğunluğu sabiti (1.056 kg / m-3) kullanılarak hesaplandı21. Temsili enjekte edilmiş ve elektroporated EDL'lerin, enjekte edilmemiş veya elektroporated kasları kontrol etmeye kıyasla 100 Hz'de benzer tetanik yanıtlara sahip olduğunu gösterdik (Şekil 2A ve Şekil 2B). Kas tetanik kuvveti, spesifik tetanik kuvvet, pik gerilime kadar geçen süre ve yarım gevşeme süresinin, enjekte edilen ve elektroporated EDL'de el değmemiş kontrole kıyasla ödün vermediğini gördük (Tablo 1). Verilerimiz, kontraktiliteyi etkileyen protein ekspresyonunun, EDL'de elektroporasyon kullanılarak olumsuz etkilere neden olmadan modüle edilebileceğini göstermektedir.

Şekil 1: PCDNA3-EGFP'nin elektroporasyonu TA ve EDL kasında DNA alımı için yeterlidir. A) TA ve EDL kontrollerinden (kontrol vektörü enjekte edilmiş ve elektroporated 125 V / cm enjekte edilmiş) ve GFP'den (pcDNA3-EGFP enjekte edilmiş ve elektroporated 125 V / cm enjekte edilmiş) temsili kesitler. Ölçek çubuğu 50 μm. B) EDL'den transfeksiyon verimliliğini gösteren temsili kesit. Ölçek çubuğu 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Enjeksiyon ve elektroporasyon kas fonksiyonunu tehlikeye atmaz. A) enjekte edilmemiş/elektroporated EDL (kontrol) ve B) enjekte edilmiş/elektroporated EDL'den (GFP) 100 Hz'de temsili tetanik kuvvet eğrileri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Elektroporatörlü EDL'lere karşı kontrolden kaynaklanan tüm kas kontraktilitesi. Enjekte edilmiş/elektroporated EDL'lerde (GFP) enjekte edilmemiş/elektroporated olmayan kontrollere kıyasla farklı kas kuvveti parametrelerinin tehlikeye girmediğini gösteren tablo. F 0 = 100 Hz'de tetanik kuvvet, sF0 = 100 Hz'de spesifik tetanik kuvvet, TTP = 1 Hz'de gerilimin zirvesine ulaşma süresi, RT1/2 = yarım gevşeme süresi. Öğrencinin t-testi; p = 0.05'teki anlamlılık. n = 3.

B.A.H. ve D.L.W. çıkar çatışması olmadığını iddia etmektedir.