Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Plazmid DNA'sının Fare İskelet Kasına Elektroporasyonu

4.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63916

⸱

6 Nisan 2022

 , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Bu makalede

Özet

Plazmid DNA'sının iskelet kasına elektroporasyonu, farelerde kas kontraktilitesinden ödün vermeden gen ekspresyonunu modüle etmek için uygun bir yöntemdir.

Özet

Plazmid elektroporasyonu ile murin iskelet kasında geçici gen ekspresyon modülasyonu normal ve patolojik fizyolojinin değerlendirilmesinde yararlı bir araçtır. Hedef genlerin aşırı ekspresyonu veya yıkılması, araştırmacıların bireysel moleküler olayları manipüle etmelerini ve böylece kas kütlesini, kas metabolizmasını ve kontraktiliteyi etkileyen mekanizmaları daha iyi anlamalarını sağlar. Ek olarak, floresan etiketlerini kodlayan DNA plazmidlerinin elektroporasyonu, araştırmacıların iskelet kasındaki proteinlerin hücre altı lokalizasyonundaki değişiklikleri in vivo olarak ölçmelerini sağlar. İskelet kasının anahtar fonksiyonel değerlendirmesi, kas kontraktilitesinin ölçülmesini içerir. Bu protokolde, plazmid DNA enjeksiyonu, elektroporasyon ve gen ekspresyon modülasyonundan sonra tüm kas kontraktilitesi çalışmalarının hala mümkün olduğunu gösteriyoruz. Bu eğitici prosedürün amacı, tibialis anterior ve ekstansör digitorum longus kaslarının miyoliflerinde alım ve ekspresyonu kolaylaştırmak için fare iskelet kasına DNA plazmid elektroporasyonunun adım adım yöntemini göstermek ve iskelet kası kontraktilitesinin enjeksiyon ve elektroporasyon ile tehlikeye atılmadığını göstermektir.

Giriş

İskelet kası içine plazmid DNA elektroporasyonu in vivo olarak iskelet kası fizyolojisindeki değişiklikleri ve moleküler sinyallemeyi değerlendirmek için çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda gen ekspresyonunu modüle ederek önemli bir araçtır 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . İskelet kasına deneysel gen transferi, Wolff ve ark. tarafından 1990 gibi erken bir tarihte gösterilmiştir; burada hem RNA hem de DNA elektroporasyon olmadan başarılı bir şekilde aktarılmış ve lusiferaz ekspresyonu en az 2 ay boyunca korunmuştur10. Sadece enjeksiyonla nispeten düşük transfeksiyon etkinliği sorunludur ve Aihara ve Miyazaki, 1998 yılında bir pCAGGS-IL-5 yapısını tibialis anterior (TA) kasına elektroporasyon yaparak ve serum IL-5 ekspresyonu11'i ölçerek elektroporasyon ile artan gen transferini göstermiştir. O zamandan beri, birçok çalışma, maksimum gen transfer verimliliğini sağlamak için farklı DNA konsantrasyonlarının, hacimlerinin ve elektroporasyon parametrelerinin etkinliğini araştırmıştır. Mir ve ark. voltaj, darbe sayısı, nabız süresi ve frekansın yanı sıra DNA konsantrasyonu da dahil olmak üzere farklı elektroporasyon parametrelerini test ettiler ve daha fazla voltaj, darbe sayısı ve DNA konsantrasyonunun hepsinin elektroporasyon verimliliğinin artmasına katkıda bulunduğunu belirlediler12. Yüksek elektroporasyon voltajına yapılan önemli bir uyarı, miyoliflere artan DNA alımını kolaylaştırırken, aynı zamanda sonuçları karıştırabilecek kas hasarına neden olmasıdır. Schertzer ve ark., 200 V'ta elektroporasyonun, elektroporasyondan 3 gün sonra miyoliflerin yaklaşık% 50'sinde hasara neden olduğunu, oysa miyoliflerin sadece% 10'unun 50 V13'te hasar gördüğünü göstermiştir. Etkili DNA transferini etkileyen değişkenleri kas hasarına karşı dikkate aldık ve etkili gen transferini gerçekleştirmek için santimetre kaliper genişliğinde 125 V'luk bir voltajın yeterli olduğunu bulduk.

Elektroporasyon sonrası kas lifi kesit alanının ve tüm kas kontraktilitesinin analizi, gen modülasyonuna bağlı kas büyüklüğü ve fonksiyonundaki değişiklikleri ölçme yönteminin önemli yönleridir. Biz ve diğerleri daha önce kontrol vektörlerinin elektroporasyonunun tek başına miyofiber alanda bir azalmaya neden olmadığını göstermiştir. Yeşil floresan protein (EGFP) yapısı, bu çalışmalarda DNA transfeksiyonunun yararlı bir floresan göstergesiydi13,14. Bir dizi çalışma, elektroporasyon sonrası TA'nın in situ kontraktilitesini araştırmış ve değişen sonuçlar bulmuştur. Bir çalışma, 75 V / cm elektroporasyonun, elektroporasyondan 3 gün sonra tetanik kuvvette yaklaşık% 30'luk bir azalmaya neden olduğunu ve elektroporasyondan 7 gün sonra, tetanik kuvvetin kontrol seviyesine geri döndüğünü, 50 V / cm elektroporasyonun ise kuvvet 13,15'ten ödün vermediğini göstermiştir. Başka bir çalışma, 180 V / cm elektroporasyondan 3 saat sonra% 30'luk bir tetanik kuvvet kaybı olduğunu ve 7 gün16'dan sonra sahte kuvvet seviyelerine geri döndüğünü göstermiştir.

Aşağıdaki ayrıntılı prosedürde, farelerin TA ve ekstansör digitorum longus (EDL) kaslarında bir pcDNA3-EGFP plazmidinin enjeksiyonunu ve elektroporasyonunu gösteriyoruz. Ayrıca bu yöntemin EDL tüm kas kontraktilitesini etkilemediğini de gösteriyoruz. Amaç, fonksiyon kaybına neden olmadan miyoliflere etkili plazmid alımını göstermektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanları kullanan tüm deneyler, Penn State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan Penn State College of Medicine'de gerçekleştirildi ve 1964 Helsinki Deklarasyonu'nda ve daha sonraki değişikliklerinde belirtilen etik standartlara uygun olarak gerçekleştirildi. Bu işlem için 12 haftalık dişi C57BL/6 fareler kullanıldı. Tüm cerrahi aletler deneyden önce sterilite için otoklavlandı.

1. TA ve EDL enjeksiyon / elektroporasyon hazırlığı

NOT: Bu adımlar TA ve EDL enjeksiyon/elektroporasyon hazırlığı için aynıdır.

  1. Deneyden önce steril PBS'de seyreltilmiş 1 μg / μL konsantrasyonuna ekspresyon plazmidi yapılarını saflaştırın. Bu prosedür için, pcDNA3-EGFP (GFP) veya pcDNA3 boş vektörünü (kontrol) saflaştırmak için ticari olarak temin edilebilen bir endotoksin içermeyen saflaştırma kiti kullanıldı.
  2. Yeterli enjeksiyon hacmini sağlamak için plazmid konsantrasyonunu hesaplayın (50 μL steril PBS'de TA 50 μg DNA; 10 μL steril PBS) ve aliquot örneklerinde EDL 10 μg DNA.
  3. Elektroporatör ayarlarını, seçilen tekerleği kullanarak ve aşağıdaki parametreleri seçmek için tekerleğe basarak programlayın: Mod - LV, Voltaj - 12,5 V / mm (enjeksiyon sırasında ayarlanacak), darbe uzunluğu - 20 ms, darbe sayısı - 5, aralık - 200 ms, polarite - tek kutuplu.
  4. İzofluran gazı kullanarak fareleri anestezi altına alın. Fareleri% 5 izofluran içeren bir indüksiyon kutusuna yerleştirin. Forseps kullanarak ayak parmağı sıkışma refleksinin yokluğunda anestezinin cerrahi düzlemini onaylayın ve izofluranı% 2 bakım dozuna düşürün. Fareleri, prosedürün geri kalanı için 37 ° C'de dolaşımdaki bir su plakasına dayanan uygun bir burun konisine aktarın.
  5. Küçük saç kesme makineleri kullanarak her iki arka bacaktan da saçları çıkarın. Enjeksiyon bölgesini sterilize etmek için alt ekstremiteleri alternatif% 70 etanol / betadin ile ovalayın.

2. TA enjeksiyon / elektroporasyon

  1. Fare sırtüstü pozisyondayken, alt bacağın yan tarafındaki deriden görülebilen TA tendonunu bulun. Çıkarılabilir 30 G iğneli 50 μL'lik bir mikro şırınga kullanarak, iğne kasın üst ucuna ulaşana kadar miyotendinöz kavşaktan 1-2 mm daha üstün olan iğneyi sığ bir 5° açıyla yerleştirin.
    NOT: Kasın ortasına enjeksiyon amaçtır.
  2. 50 μL plazmid çözeltisi vermek için iğneyi enjeksiyon yolu boyunca yavaşça geri çekerken pistonu yavaşça bastırın. Kas şişmelidir.
  3. Zamanlayıcıyı 1 dakika boyunca ayarlayın ve TA'daki bacağın kalınlığını ölçün. Farenin boyutuna bağlı olarak, bu 5-10 mm arasında olabilir. Kaliper elektrotlarını ölçülen kalınlığa ayarlayın ve elektroporatör voltajını 12,5 V / mm'ye ayarlayın.
  4. 1 dakika sonra, kumpas elektrotlarını alt ekstremitenin etrafına yerleştirin. Elektrotlar rahat olmalı ancak aşırı sıkı olmamalıdır. 20 ms süreli ve 200 ms aralıklarla 5 kare dalga darbesi verin (kas her nabızla seğirmelidir).
  5. Kontrol vektörünü kullanarak alternatif uzuvla tekrarlayın.
  6. Fareyi anesteziden çıkarın ve 37 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin. İyileştikten sonra, fareyi kafesine geri getirin.

3. EDL enjeksiyonu / elektroporasyon

  1. Fare sırtüstü pozisyondayken, tibia kemiği ön tepesini görsel olarak ve nazik palpasyonla bulun.
    1. Bir neşter kullanarak, tibia ön kretinin lateral tarafındaki deriden dizden 5 mm daha düşük, TA miyotendinöz bileşkekten 2 mm daha üstün sığ bir kesi yapın.
    2. Küçük makas kullanarak, künt fasyayı disseke ederek TA kasını açığa çıkarır.
    3. Yine, makasla künt diseksiyon kullanarak, kası yanal olarak çekerek EDL'yi açığa çıkararak TA kasını tibiadan yavaşça ayırın. İşlem sırasında TA'yı EDL'den uzak tutmak için küçük, kavisli forsepsler kullanılabilir.
  2. Çıkarılabilir 30 G iğneli 50 μL'lik bir mikro şırınga kullanarak, iğne kasın üst ucuna ulaşana kadar iğneyi EDL'ye uzunlamasına yerleştirin.
  3. Plazmid çözeltisinin 10 μL'sini enjekte etmek için iğneyi enjeksiyon yolu boyunca yavaşça geri çekerken pistonu yavaşça bastırın (kas şişmelidir).
  4. 1 dakika boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın ve EDL'deki bacağın kalınlığını ölçün. Farenin boyutuna bağlı olarak, bu 5-10 mm arasında olabilir. Kaliper elektrotlarını ölçülen kalınlığa ayarlayın ve elektroporatör voltajını 12,5 V / mm'ye ayarlayın.
  5. 1 dakika sonra, kumpas elektrotlarını alt ekstremitenin etrafına yerleştirin. Elektrotlar rahat olmalı ancak aşırı sıkı olmamalıdır. 20 ms süreli ve 200 ms aralıklarla 5 kare dalga darbesi verin (kas her darbede seğirmelidir).
  6. Kesiyonu tek kullanımlık 4/0 emilemeyen naylon sütürler kullanarak kapatın.
  7. Alternatif uzuvla tekrarlayın veya uzuvları mutlak kontrol olarak el değmeden bırakın.
  8. Fareyi anesteziden çıkarın ve 37 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin. Ameliyattan hemen sonra ve ameliyattan 12-24 saat sonra uygun bir subkutan analjezik uygulayın. İyileştikten sonra, fareyi kafesine geri getirin.
    NOT: Önceki çalışmalar, elektroporasyondan hemen sonra TA'da bir kas kontraktilitesi açığı olduğunu ve kontraktil iyileşmenin 3 gün boyunca gerçekleştiğini göstermiştir13,15. Bu nedenle, hem TA hem de EDL kaslarının histoloji, protein ekspresyonu veya kas kontraktilitesi için analizi, elektroporasyondan 3-10 gün sonra gerçekleştirilir. EGFP'nin uzun süreli ekspresyonu, prosedür 13'ü takip eden3 haftaya kadar gözlenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İskelet kasında gen transferini kolaylaştırmak için elektroporasyon, kas fizyolojisindeki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan yararlı bir tekniktir. Hem TA hem de EDL kaslarında verimli gen transferini gerçekleştirmek için ayrıntılı, adım adım bir prosedür gösterdik. Transfeksiyon verimliliğindeki farklılıklar bir dizi değişken nedeniyle ortaya çıkar. Bu değişkenler arasında elektroporasyon parametreleri (darbeler, voltaj, nabız süresi vb.), Gen yapı boyutu ve enjekte edilen DNA'nın konsantrasyonu / hacmi bulun...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Elektroporasyon ile güçlendirilmiş iskelet kasında in vivo gen transferi, kastaki protein ekspresyonunu modüle etmek için yararlı ve nispeten basit bir araçtır. EDL ve TA kaslarında etkili gen transferi sağlamak için gereken adımları gösterdik ve EDL'nin kontraktilite ölçümünün prosedürü takiben uygulanabilir olduğunu gösterdik. Bu teknik daha karmaşık viral vektörler gerektirmez ve tek bir kasta transfekte ve transfekte olmayan kas lifi kesit alanının karşılaştırılmasına izin verir. Bu prosedürün bir sınırlamas...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

B.A.H. ve D.L.W. çıkar çatışması olmadığını iddia etmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4-0 Naylon sütür (emilmez)Ethicon662GCilt kesisini kapatmak için sütür
50 & mikro; l Hamilton şırıngaHamilton80501mikroşırınga
C57BLl / 6NHsd farelerEnvigo044deney için kullanılan 12 haftalık dişi fareler
Kaliper ElektrotBTX45-01021.0cm x 1.0cm paslanmaz çelik
Dinamik Kas Kontrolü Veri Toplama/analiziAurora Scientific605AKas kasılma ölçümü ve analizi için kullanılan yazılım
ECM 830 Elektroporasyon SistemiBTX45-0662elektroporatör
EndoFree Plazmid Maxi KitiQiagen12362Plazmid saflaştırma kiti
Ekstra Dar MakasGüzel Bilim Araçları14088-10Künt diseksiyon için makas
Kuvvet DönüştürücüAurora Scientific407Agelen kuvveti ölçmek için
Güzel Bilim Araçları13010-12vektörünü büyütmek için hemastatlar
Fisher ScientificV79020Kontrol Vektörü
pcDNA3-EGFP ekspresyon plazmidiAddgene13031GFP ekspresyonu için plazmid
Semken kavisli forsepsGüzel Bilim Araçları11009-13Ameliyat için forseps
Cerrahi bıçaklar paslanmaz çelik no. 10Becton Dickinson37 1210Neşter bıçakları
Tissue-Tek O.C.T. ortamıVWR25608-930Histoloji için dondurma ortamı
Buğday tohumu Aglütininin- Texas RedThermo-Fisher ScientificW21405Kas kesiti için membran boyama
EDL Mikro-Masquito Hemastatlarından pcDNA3.1 memeli ekspresyon

Kaynaklar

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732(2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Plazmid ElektroporasyonuGen TransferiFare KasıKas KontraktilitesiDNA EnjeksiyonuGen Ekspresyon ModülasyonuTibialis AnteriorExtensor Digitorum LongusProtein Lokalizasyonu
Plazmid DNA'sının Fare İskelet Kasına Elektroporasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.