Mevcut protokol, bozulmamış, temizlenmiş organ ve dokulardaki çoğalan ve uykuda olan Trypanosoma cruzi parazitlerini ve T hücrelerini görselleştirmek ve hassas bir şekilde ölçmek için ışık tabakası floresan mikroskopisi ve otomatik yazılım destekli yöntemleri açıklamaktadır. Bu teknikler, tedavi sonuçlarını değerlendirmek için güvenilir bir yol sağlar ve parazit-konakçı etkileşimlerine yeni bakış açıları sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sağlam Berraklaştırılmış Organlarda Tripanosoma Cruzi ile Enfekte Hücrelerin, Uykuda Olan Amastigotların ve T Hücrelerinin Kantitatif 3D Görüntülenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Chagas hastalığı, başta Latin Amerika olmak üzere dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen ihmal edilmiş bir patolojidir. Chagas hastalığı ajanı Trypanosoma cruzi (T. cruzi), insanlar da dahil olmak üzere birçok memeli türünü enfekte eden, kalp ve sindirim patolojilerine neden olan çeşitli biyolojiye sahip zorunlu bir hücre içi parazittir. Chagas hastalığının karmaşık biyolojisini anlamak ve tedavi rejimlerinin sonucunu doğru bir şekilde değerlendirmek için T. cruzi in vivo enfeksiyonlarının güvenilir bir şekilde tespit edilmesi uzun zamandır gereklidir. Mevcut protokol, 3D yeniden yapılandırılmış, temizlenmiş organlarda T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin otomatik olarak ölçülmesi için entegre bir boru hattı göstermektedir. Işık tabakası floresan mikroskopisi, tüm organ veya dokularda aktif olarak çoğalan ve uykuda olan T. cruzi parazitlerinin ve bağışıklık efektör hücrelerinin doğru bir şekilde görselleştirilmesini ve ölçülmesini sağlar. Ayrıca, temizlenmiş organların antikorlar ve nükleer lekelerle düzgün bir şekilde etiketlenmesini sağlamak için CUBIC-HistoVision boru hattı başarıyla kabul edildi. 3D immün boyama ile birlikte doku temizleme, ilaç tedavi protokollerini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek, T. cruzi ile enfekte olmuş dokuların hücresel organizasyonunun anlaşılmasını geliştirmek için tarafsız bir yaklaşım sağlar ve Chagas hastalığında anti-T. cruzi immün yanıtları, doku hasarı ve onarımı ile ilgili keşifleri ilerletmesi beklenmektedir.
Giriş
Protozoan parazit T. cruzi'nin neden olduğu Chagas hastalığı, dünyanın en çok ihmal edilen tropikal hastalıkları arasındadır ve yılda yaklaşık 13.000 ölüme neden olmaktadır. Enfeksiyon sıklıkla akuttan kronik bir aşamaya ilerleyerek hastaların %30'unda kardiyak patoloji oluşturur ve buna aritmiler, kalp yetmezliği ve ani ölüm 1,2. Akut fazda parazite karşı ortaya çıkan güçlü konakçı bağışıklık tepkisine rağmen, konakçının yaşamı boyunca kalp ve iskelet kası gibi dokularda kronik olarak düşük sayıda parazit devam eder. Adaptif immün yanıtların gecikmiş başlangıcı ve parazitin replikasyon yapmayan forml....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma, İnsancıl Bakım ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmet Politikası ve Laboratuvar Hayvanları Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Derneği akreditasyon kılavuzlarına sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan Kullanım Protokolü (farelerde T. cruzi enfeksiyonunun kontrolü-A2021 04-011-Y1-A0) Georgia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. B6. Bu çalışmada C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J ve C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J fareleri (dişi,1-2 aylık) kullanılmıştır. Fareler ticari ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
KÜBİK sabit dokular, fiksatifleri çıkarmak için PBS ile yıkandı ve daha sonra doku mimarisini korurken dokunun renginin bozulmasına neden olan pigmentleri ve lipitleri dokudan çıkaran temel tamponlu bir amino alkol çözeltisi olan CUBIC-L kokteylleri ile inkübe edildi. Kağıttaki ızgara çizgileri, organların uygun şekilde temizlendiğini gösteren dokulardan görülebilir (Şekil 2A). Delipidasyondan sonra, dokular yıkandı ve sırasıyla RI homojenizasyonu ve görüntüleme için CUBIC-R.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Parazitlerin ve immün yanıtın yaygın, tüm organ görüntülemesinin olmaması, konakçı-parazit etkileşimlerinin karmaşıklığının anlaşılmasını sınırlar ve Chagas hastalığı için tedavilerin değerlendirilmesini engeller. Bu çalışma, T. cruzi ile enfekte olmuş farelerin bozulmamış organlarını ve dokularını açıklığa kavuşturmak ve boyamak için CUBIC boru hattını benimsemiştir.
Bu çalışmada çoklu doku temizleme protokolleri test edilmiştir (PACT32, ECi 33, FLASH
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Dr. Etsuo Susaki'ye doku temizleme ve immün boyama protokolleri ile ilgili değerli yardımları ve önerileri için teşekkür ederiz. Ayrıca, LSFM ve konfokal görüntüleme kullanarak teknik destek için CTEGD Biyomedikal Mikroskopi Çekirdeğinden M. Kandasamy'ye minnettarız. Ayrıca Tarleton Araştırma Grubu'nun tüm üyelerine bu çalışma boyunca yararlı öneriler için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1-metilimidazol | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimetil-1-fenil-5-pirazolon (Antipirin | TCI | D1876 | |
| 6 kuyulu hücre kültürü plakaları | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-fare Fab parçası | Jackson İmmüno-Araştırma Laboratuvarları | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-tavşan Fab parçası | Jackson İmmüno-Araştırma Laboratuvarları | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-&alfa;-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6. C + A2: A44G-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze< / sup> / J fare | Jackson Laboratuvarı | Suşu #007914 | Ortak Ad: Ai14, Ai14D veya Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J fare | Jackson Laboratuvarı | Suşu #007914 | Ortak Adı: Ai14, Ai14D veya Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 İyodür | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Sığır serum albümini (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J fare | Jackson Laboratuvarı | Suşu #032080 | Ortak Adı: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Temizleme mendilleri Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immün boyama kiti | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nükleer boyama kiti | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Siyanoakrilat bazlı jel süper yapıştırıcı | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1'-dioktadesil-3,3,3',3'-tetrametilindotrikarbosiyanin iyodür) Şirket: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Santrifüj tüpleri 15 mL | Corning | ||
| Falcon Santrifüj tüpleri 50 ve nbsp; mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920. BBR | |
| Hyaluronidaz | Sigma | #H3884 veya #H4272 | |
| Imaris Dosya Dönüştürücü x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris yazılımı | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector yazılımı | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| İntravenöz enjeksiyon iğnesi 23-G | Sartori, Minisart Şırınga filtresi | 16534 | |
| Kimwipes | tüy bırakmayan mendiller | ||
| Hafif tabaka floresan mikroskobu | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II görüntüleme sistemi | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Mikropipet uçları, 10 & L, 200 ve mikro; L ve 1.000 &mikro; L | Axygen | T-300, T-200-Y ve T-1000-B | |
| Motorlu pipet dağıtıcı | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Montaj Çözümü | TCI | M3294 | |
| N-butildietanolamin | TCI | B0725 | |
| Nikotinamid | TCI | N0078 | |
| N-Metilnikotinamid | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehit (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Uzak Kırmızı Nükleer Leke | Biotium | #40061 | |
| Kurban Perfüzyon Sistemi | Leica | 10030-380 | |
| Makas | Güzel Bilim Araçları | 91460-11 | |
| Serolojik pipetler | Costar Steril | 4488 | |
| Çalkalama inkübatörü | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodyum azid (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodyum karbonat (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodyum Klorür (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodyum hidrojen karbonat (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Yeşil Nükleik Asit Lekesi | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Kaynaklar
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleto....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
