Yöntem makalesi

Dinamik Hücre Kültürü için Çıkış Fraksiyonasyonu ile Entegre Çok Akışlı Perfüzyon Biyoreaktörü

DOI:

10.3791/63935

⸱

20 Temmuz 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biochemical Engineering, Rutgers University, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Medicine, Rutgers Biomedical Health Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, hücresel proseslerde çözünenlerin sekresyon dinamiklerini ve absorpsiyon oranlarını ölçmek için düşük maliyetli, çok kanallı bir perfüzyon hücre kültürü sistemi kurmak ve çalıştırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Sistem ayrıca hücreleri dinamik uyaran profillerine maruz bırakabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bazı hücre ve doku fonksiyonları, geleneksel kültür sistemleri tarafından zayıf bir şekilde çözülen dakikalar ila saatler arasındaki dinamik zaman ölçeği içinde çalışır. Bu çalışma, kültür ortamının sürekli olarak bir hücre kültürü modülüne perfüze edilmesini ve bu ölçekteki dinamikleri ölçmek için bir aşağı akış modülünde fraksiyone edilmesini sağlayan düşük maliyetli bir perfüzyon biyoreaktör sistemi geliştirmiştir. Sistem neredeyse tamamen ticari olarak temin edilebilen parçalardan inşa edilmiştir ve aynı anda geleneksel çok kuyulu hücre kültürü plakalarında bağımsız deneyler yapmak için paralelleştirilebilir. Bu video makalesinde, yalnızca tek bir çok kanallı şırınga pompası ve paralel olarak altı kültüre kadar perfüze etmek için modifiye edilmiş bir fraksiyon kolektörü gerektiren taban kurulumunun nasıl monte edileceği gösterilmektedir. Modüler tasarımdaki yararlı varyantlar, çözünen darbeler veya farmakokinetik benzeri profiller gibi kontrollü stimülasyon dinamiklerine izin veren de sunulmaktadır. Daha da önemlisi, çözünen sinyaller sistemden geçerken, çözünmüş dağılım nedeniyle bozulurlar. Ayrıca, perfüzyon kurulumunun bileşenlerinin ikamet süresi dağılımlarını (RTD'ler) MATLAB kullanarak bir izleyici ile ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. RTD'ler, çözünen sinyallerin çok bölmeli sistemdeki akış tarafından nasıl bozulduğunu hesaplamak için kullanışlıdır. Bu sistem son derece sağlam ve tekrarlanabilir, bu nedenle temel araştırmacılar özel üretim tesislerine ihtiyaç duymadan kolayca benimseyebilirler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok önemli biyolojik süreç, hücre ve doku kültürlerinde dakikalar ila saatlerarasında 1,2,3 zaman ölçeğinde gerçekleşir. Bu fenomenlerin bazıları hızlandırılmış mikroskopi4, biyolüminesans1 veya diğer yöntemler kullanılarak otomatik bir şekilde gözlemlenebilir ve kaydedilebilirken, kimyasal analiz için kültür süpernatant örneklerinin toplanmasını içeren deneyler genellikle statik hücre kültürlerinde manuel olarak gerçekleştirilir. Manuel örnekleme, sık veya mesai saatleri dışında örnekleme zaman noktalarının rahatsızlığı nedeniyle belirli çalışmaların fizibilitesini sınırlar. Statik kültür yöntemlerinin diğer eksiklikleri, kimyasal uyaranlara kontrollü, geçici maruziyetleri içeren deneyleri içerir. Statik kültürlerde, uyaranlar manuel olarak eklenmeli ve çıkarılmalıdır ve uyaran profilleri zaman içindeki adım değişiklikleriyle sınırlıdır, orta değişiklikler de hücreleri kontrolsüz bir şekilde etkileyebilecek diğer ortam bileşenlerini ekler ve kaldırır5. Akışkan sistemler bu zorlukların üstesinden gelebilir, ancak mevcut cihazlar başka zorluklar da doğurur. Mikroakışkan cihazlar, özel ekipmanın ve üretim ve kullanım eğitiminin engelleyici maliyetleri ile birlikte gelir, numuneleri işlemek için mikroanalitik yöntemler gerektirir ve perfüzyon6'dan sonra hücrelerin cihazlardan kurtarılması zordur. Burada açıklanandeney türleri için birkaç makroakışkan sistem oluşturulmuştur 7,8,9,10 ve bunlar şirket içinde yapılan birden fazla özel parçadan yapılmıştır ve birden fazla pompa veya fraksiyon toplayıcı gerektirir. Ayrıca, yazarlar, biyoüretim için yararlı olan, ancak fizyolojiyi modellemek ve incelemek için tasarlanmamış, süspansiyon kültürü için karıştırılmış tank biyoreaktörleri dışında, ticari olarak temin edilebilen herhangi bir makroakışkan perfüzyon hücre kültürü sisteminin farkında değildir.

Yazarlar daha önce neredeyse tamamen ticari olarak temin edilebilen parçalardan oluşan düşük maliyetli bir perfüzyon biyoreaktör sisteminin tasarımı hakkında rapor vermişlerdi11. Sistemin baz versiyonu, bir kuyu plakasındaki birden fazla kültürün bir CO2 inkübatöründe tutulmasını ve bir şırınga pompasından gelen ortamla sürekli olarak perfüze edilmesini sağlarken, kültürlerden gelen atık su ortam akışları, özel bir modifikasyona sahip bir fraksiyon toplayıcı kullanılarak zaman içinde otomatik olarak numunelere bölünür. Böylece, bu sistem kültür ortamı süpernatantının otomatik örneklemesini ve zaman içinde kültürlere sürekli çözünen girdiyi mümkün kılar. Sistem makroakışkan ve modülerdir ve yeni deney tasarımlarının ihtiyaçlarını karşılamak için kolayca değiştirilebilir.

Burada sunulan yöntemin genel amacı, maddelerin zaman içinde hücreler tarafından salgılanma veya emilim oranlarının ölçüldüğü ve / veya hücrelerin hassas, geçici çözünen sinyallere maruz kaldığı deneylere olanak tanıyan bir perfüzyon hücre kültürü sistemi oluşturmak, karakterize etmek ve kullanmaktır. Bu video makalesinde, tek bir şırınga pompası ve modifiye fraksiyon toplayıcı kullanarak aynı anda altı adede kadar hücre kültürünü perfüze edebilen baz kurulumunun nasıl monte edileceği açıklanmaktadır. Baz sistemde, hücreleri kısa darbeler ve farmakokinetik benzeri profiller12 dahil olmak üzere geçici çözünen konsantrasyon sinyallerine maruz bırakan deneylere izin vermek için ek pompalar ve parçalardan yararlanan iki yararlı varyant da Şekil 1'de gösterilmiştir.

figure-introduction-1
Resim 1: Perfüzyon sistemi tasarımı üzerinde üç varyasyon . (Top) Temel perfüzyon sistemi. (Orta) Birden fazla orta kaynak için bir stopcock ile perfüzyon sistemi. (Altta) İyi karıştırılmış bir dağılım hacmini taklit etmek için karıştırılmış bir tanka sahip perfüzyon sistemi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Akış içindeki dağılım ve difüzyon nedeniyle, çözünen sinyaller akış sisteminden geçerken bozulur veya "bulaşır". Bu bozulma, ikamet süresi dağılımları (RTD'ler) kullanılarak ölçülebilir13. Bu makalede, perfüzyon sisteminin bileşenleri üzerinde izleyici deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği açıklanmaktadır (Şekil 2) ve ölçülen verilerden RTD'ler oluşturmak için MATLAB komut dosyaları sağlanmaktadır. Bu analizin ayrıntılı bir açıklaması, yazarların önceki makalesi11'de bulunabilir. Ek MATLAB komut dosyaları, RTD'lere uygun işlevler sığdırır ve fiziksel parametreleri çıkarır ve kullanıcı tarafından çözünen sinyal girişinin perfüzyon sistemi14 aracılığıyla nasıl yayılacağını ve bozulacağını tahmin etmek için RTD'leri kullanarak sinyal evrişimi gerçekleştirir.

figure-introduction-2
Şekil 2: İkamet süresi dağılımları. Bu boru uzunluğu gibi akış sistemi bileşenlerinin RTD'leri, sisteme bir izleyici darbesi girerek ve toplanan fraksiyonlara çıktığı zamana kadar nasıl "bulaştığını" ölçerek ölçülür. Bu rakam Erickson ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kuyu plakası perfüzyonu için parçalar hazırlayın

  1. Boru hazırlama
    1. Perfüze edilecek her hücre kültürü için iki uzunlukta silikon boru (1,6 mm iç çap) kesin. Yukarı akış borusu olarak kullanılan parçanın, şırınga pompasından inkübatörün içindeki hücre kültürüne ulaşacak kadar uzun olduğundan ve aşağı akış parçasının hücre kültüründen fraksiyon toplayıcının en uzatılmış konumuna ulaşabildiğinden emin olun.
    2. Her boru parçasına, etiketli bant ile her iki ucunda benzersiz bir etiket verin.
  2. Kuyu plakası için tıpalar hazırlayın
    1. Perfüze edilecek kuyu plakasının her bir kuyucuğu için, hava geçirmez bir conta ile kuyucuklara sıkıca oturması için uygun bir çapa sahip bir silikon tıpa elde edin.
    2. Tıpanın diplerinden fazla malzemeyi kesin, böylece kuyucuklara sığacak şekilde içeride amaçlanan sıvı seviyesinin üzerinde hava için yer bırakın.
    3. İki künt 18 G iğneyi her bir durdurucudan, kuyudan geçen akış için giriş ve çıkış görevi görecek şekilde üstten ve alttan dışarı doğru itin, kuyu içindeki uçları arasındaki mesafeyi en üst düzeye çıkarmak için birbirine taban tabana zıttır.
    4. Tıkanmış kuyu içindeki iğnelerin yüksekliklerini ayarlayın, çünkü çıkış iğnesinin yüksekliği, perfüzyon sırasında kuyudaki sıvı seviyesinin sabit yüksekliğini belirleyecektir.
      NOT: Perfüzyon, çıkış iğnesi sıvı seviyesinin üzerinde olacak şekilde başlatılırsa, seviye iğneye ulaşana kadar sıvı kuyuda birikecektir. Perfüzyon, sıvı seviyesinin altındaki çıkış iğnesi ile başlatılırsa, hava kabarcıkları kuyuya akmadığı sürece sıvı seviyesi sabit kalır, bu da sıvı yüksekliğinin çıkış iğnesiyle aynı yüksekliğe gelene kadar düşmesine neden olur.
  3. Ek parçalar toplayın
    1. Perfüzyona tabi tutulacak her hücre kültürü için, tüm perfüzyon için yeterli ortam içerecek kadar büyük, ayrıca başlangıçta boruyu doldurmak için ek miktarda ortam içeren bir steril şırınga elde edin.
    2. Perfüze edilecek her kültür için, bir dişi-diken-ve iki erkek-diken-Luer konektörünün yanı sıra iki dişi ve iki erkek Luer başlığı elde edin.
  4. Parçaları temizleyin ve sterilize edin
    1. Parçalar daha önce kullanılmışsa, 0.1 N NaOH ile perfüze ederek temizleyin, ardından deiyonize su ile durulayın.
    2. Otoklavlama veya başka bir şekilde, yukarıda listelenen tüm parçaların sterilitesini sağlayın.

2. Çok kafalı dağıtıcıyı lazerle kesin ve bir fraksiyon toplayıcıya takın

  1. Bilgisayar destekli bir tasarım programında Şekil 3'teki çok kafalı dağıtıcı modelini yeniden oluşturun veya sağlanan model DXF dosyasını indirin (Ek Dosya 1).
  2. Tasarımı 1/8 akrilik levhadan kesmek için bir lazer kesici kullanın.
  3. Dağıtım kafasını fraksiyon toplayıcının hareketli tabanına bağlayan üç vidayı çıkarın.
  4. Çok kafalı dağıtıcıdaki en küçük üç deliği hareketli tabandaki vida delikleriyle hizalayın ve vidaları takılacak deliklerden tekrar vidalayın.
  5. Üç vidanın sızdırmazlığını, çok kafalı dağıtıcıyı, dağıtım delikleri sırası altındaki toplama borularıyla aynı hizaya gelene kadar yukarı ve aşağı açılandıracak şekilde ayarlayın.
  6. 300 μL pipet uçlarını, dağıtım uçları olarak kullanılmak üzere istenen deliklerden dikkatlice yerleştirin.
    NOT: Fraksiyon toplayıcı, tek bir hücre kültürünü perfüze etmek için çok kafalı dağıtıcı olmadan kullanılabilir.

3. Bileşen RTD'lerini ölçün ve sinyal evrişimi gerçekleştirin

  1. İzleyici darbesi için pompaları ve şırıngaları Şekil 2'de gösterildiği gibi ayarlayın.
    1. İki adet tek kanallı veya çok kanallı şırınga pompası edinin.
    2. Hücre kültürü deneyleri sırasında akış sisteminde kullanılacak ortamı temsil etmek için bir arka plan çözümü seçin. Arka plan çözümünün ortama benzer kütle transfer özelliklerine sahip olduğundan emin olun. Çoğu durumda, deiyonize su uygun bir seçimdir.
    3. Hücre kültürü deneyleri sırasında ilgi çekici olacak çözünürlüğü temsil etmek için bir izleyici madde seçin. İzleyicinin, ilgilenilen çözünene benzer kütle transfer özelliklerine sahip olduğundan ve konsantrasyonunun ölçülebildiğinden emin olun. Çoğu durumda, gıda boyası uygun bir seçimdir.
    4. İzleyici çözeltisini yapmak için izleyici maddesini arka plan çözeltisinde çözün.
    5. Bir şırıngayı bir arka plan çözeltisiyle doldurun ve bir şırınga pompasına yükleyin. Başka bir şırıngayı izleyici çözeltisiyle doldurun ve ikinci şırınga pompasına yükleyin.
    6. Luer konektörlerini kullanarak her iki şırıngayı da dört yönlü bir stopcock'un üç bağlantı noktasından ikisine bağlayın.
    7. Stopcock'u arka plan çözeltisine kapatın ve izleyici çözeltisini açık porttan damlamaya başlayana kadar stopcock'a pompalayın. Pompayı durdurun ve şırıngayı daha fazla ayarlamayın.
      NOT: Şırınga pompasının hareketli çubuğunun, deneyin zamanlanmış kısımları başlamadan önce şırınga pistonlarına doğru itilmesi önemlidir. Bu, pompa başlatıldığında akışın hemen başlamasını sağlayacaktır. Aksi takdirde, pompa başlatılabilir, ancak hareketli çubuk piston konumuna gelene kadar akış aslında başlamaz.
    8. Durdurucuyu izleyici çözeltisine kapatın ve tüm artık izleyici çözeltisi açık bağlantı noktasından temizlenene kadar arka plan solüsyonunu stopcock'a pompalayın. Pompayı durdurun ve şırıngayı daha fazla ayarlamayın.
  2. İlgilenilen akış sistemi bileşenini ve kesir toplayıcıyı ayarlayın
    1. RTD analizi için istenen akış sistemi bileşenini ayarlayın. Ölçülecek bileşenin, çalışma sırasında fraksiyon toplayıcıya ulaşmak için uygun uzunlukta ve esneklikte bir parça aşağı akış borusu ile uçtuğundan emin olun.
    2. Çıkış yönündeki borunun ucunu, çok kafalı dağıtıcıdaki pipet ucu dağıtıcısına, sıkıca bağlanacak şekilde yerleştirin.
    3. Dört yönlü durdurmanın açık portunu, ölçülecek bileşenin girişine takın. Bir hücre kültürü deneyi sırasında olduğu gibi tamamen dolana kadar bileşenden arka plan çözeltisini pompalayın ve fraksiyon toplayıcı dağıtım ucundan damlamaya başlar. Pompayı durdurun.
  3. İzleyici darbesini enjekte edin, fraksiyonları toplayın ve izleyiciyi ölçün
    1. İzleyici çözeltisi için pompayı istenen akış hızına ayarlayın. Stopcock'u arka plan çözümüne kapatın ve izleyici çözümünün akışını başlatın. Aynı zamanda, kesir toplayıcıyı başlatın.
    2. İzleyicinin impuls girişine yaklaşmak için izleyici çözeltisinin akışına kısa bir süre devam edin. 10 dakikalık bir darbe süresinin, RTD'ler için 1 mL / s akış hızında iyi çalıştığı bulunmuştur.
      NOT: İzleyici darbesi çok kısaysa, ölçülebilir olması için akışa yeterli izleyici girmeyecektir. Nabız çok uzunsa, artık bir dürtüye yaklaşmayacak ve RTD'nin şeklini değiştirecektir.
    3. İzleyici çözeltisi darbe periyodunun sonunda, izleyici çözeltisi pompasını durdurun. Durdurmayı hızlı bir şekilde izleyici çözeltisine kapatın ve arka plan çözeltisinin akışını aynı akış hızında başlatın.
    4. Arka plan çözeltisinin akmasına ve fraksiyonların toplanmasına, izleyicinin tamamı sistemden ve toplanan fraksiyonlara geçene kadar izin verin.
    5. Sistemi durdurun ve fraksiyonlardaki izleyici konsantrasyonunu ölçün. Sadece tamamen dağıtılan kesirleri içerir. Koleksiyon, bir kesirin toplanması yoluyla yarı yolda durdurulursa, bu kesri dahil etmeyin.
  4. MATLAB'da ölçülen verilerden ikamet süresi dağılımını (RTD) hesaplayın
    NOT: Bu MATLAB senaryosu tarafından gerçekleştirilen analizin yazılı bir açıklaması, yazarların önceki yayını11'de bulunabilir ve teorinin tartışmaları literatür13'te yaygın olarak mevcuttur.
    1. Ek Dosya 2'de sağlanan .xlsx elektronik tablosu biçiminde konsantrasyon verilerini içeren bir example_tracer_data.xlsx dosyası oluşturun. İzleyicinin kesirlerdeki (herhangi bir birim) konsantrasyon değerlerini, satır 2'de soldan sağa kronolojik sırayla girin. Nabzın başlangıcından A5 hücresindeki son fraksiyonun sonuna kadar geçen süreyi girin ve izleyici darbesinin uzunluğunu A8 hücresine dakika cinsinden girin.
    2. .xlsx dosyasını MATLAB dizinine kaydedin.
    3. Ek Dosya 3'teki RTD_From_Data.m komut dosyasını MATLAB düzenleyicisinde açın.
    4. Komut dosyasının Veri Yükle bölümünün ilk satırındaki parantez içindeki .xlsx dosyasının adını, komut dosyasında yazılan yönergeleri izleyerek yeni .xlsx veri dosyasının adıyla değiştirin. Komut dosyasını çalıştırın.
    5. Komut dosyasının RTD analizi13'ü başarıyla gerçekleştirdiğinden, RTD'nin bir grafiğini oluşturduğundan ve sayısal integralin değerini RTD'ye eşit 1 üzerinden döndürdüğünden emin olun. Komut dosyası tarafından MATLAB dizinine kaydedilen zaman vektörünü (t) ve ilişkili RTD değerleri vektörünü (Et) bulun.
  5. MATLAB'da RTD'ye model işlevi sığdırma
    1. Ek Dosya 4'ten MATLAB düzenleyicisinde Fit_RTD_Function.m komut dosyasını açın.
    2. RTD'ye uyacak şekilde yorumlanmış üç model fonksiyonundan birini seçin: silindirik tüplerde laminer akış için RTD'lere uyan eksenel dağılım modeli13; iyi karıştırılmış tanklara uyan CSTR model13; ve yaklaşık olarak daha büyük kuyu plakalarına uyan n-CSTR model15. Burada bulunmayan başka bir modele sığdırmak için, aynı biçimde komut dosyasına ekleyin.
    3. Komut dosyasının sığdırmak için seçilen modeli içeren bölümündeki yorumları kaldırın.
    4. Parametreler için ilk tahminlerin değerlerini RTD için uygun olanlarla değiştirin.
    5. RTD verilerinin üzerine bindirilmiş fit işlevinin grafiğini oluşturmak ve işlevin fit parametre değerlerini yazdırmak için komut dosyasını çalıştırın. Sığdırma çok zayıfsa veya hatalar oluşursa, parametrenin ilk tahminlerini değiştirin ve komut dosyasını yeniden çalıştırın.
  6. MATLAB'da sinyal evrişimi gerçekleştirme
    1. Birleştirmek için bir sinyal ve bir RTD veya iki RTD seçin.
    2. Ek Dosya 5'teki Signal_Convolution.m komut dosyasını MATLAB düzenleyicisinde açın.
    3. Bükülecek iki sinyalin her biri için (yani, bir sinyal ve bir RTD veya iki RTD), istenen birimlerde eşit aralıklı zaman noktalarının bir vektörünü ve bu zamanlarda karşılık gelen bir sinyal değerleri vektörünü tanımlayın.
      NOT: İki sinyalin vektörleri aynı sayıda elemana ve aynı boyutta zaman adımlarına sahip olmalıdır. Bu nedenle, RTD'nin herhangi bir zaman aralığında rasgele sayıda nokta için örneklenebilen sürekli bir işlev olarak kullanılması yararlıdır.
    4. İki sinyali MATLAB'a girin ve çıkış sinyalinin zaman ve sinyal vektörlerini elde etmek için komut dosyasını çalıştırın.

4. Temel perfüzyon sistemini bir kuyu plakasındaki hücrelerle kurun

  1. Kuyu plakasını hazırlayın
    1. Kuyu plakası kültürünün perfüzyon deneyi için uygun orta derinliğe sahip olduğundan emin olun. Perfüzyona başlamadan önce son ortam değişikliklerini, stimülasyonları veya diğer adımları istediğiniz gibi gerçekleştirin. Süspansiyon hücreleri perfüze ediliyorsa, altta olduklarından emin olmak için plakayı santrifüj edin.
    2. Steril koşullar altında, iğneli tıpaları, iğneler yukarı çekilmiş olarak kuyu plakası kültürlerine yerleştirin. Durdurucu yerleştirildikten sonra, çıkış iğnesinin yüksekliği kararlı sıvı seviyesini belirlediğinden, iğneleri perfüzyon için istenen yüksekliğe indirin.
    3. İğneleri erkek Luer kapaklarıyla kapatın ve tüm kuyu plakasını kullanıma kadar bir inkübatörde tutun.
  2. Şırıngaları ve yukarı akış borularını hazırlayın
    1. Steril koşullar altında, perfüzyonun istenen süresi boyunca yeterli ortam ve ayrıca yukarı akış borusunu doldurmak için yeterli ek ortam ile perfüze edilecek her kültür için bir şırınga doldurun.
    2. Dişi-dikenli Luer konektörü kullanarak yukarı akış borusunu şırıngaya takın. Tüpün diğer ucunda, erkekten dikenlere Luer konektörü takın.
    3. Yukarı akış tüpü tamamen ortamla dolana kadar şırıngadan ortam dağıtın.
    4. Tüpün açık ucunu dişi bir Luer başlığı ile kapatın.
      NOT: Tüm çoğaltılan şırıngalar bu noktada tam olarak aynı hacme sahip olmalıdır. Hacimleri eşit değilse, pistonları farklı pozisyonlarda olacak ve hepsi tek bir çok kanallı şırınga pompasına iyi sığmayacaktır.
  3. Steril koşullar altında, aşağı akış borusunun bir ucuna erkekten dikenlere bir Luer konektörü takın ve dişi bir Luer kapağı ile kapatın.
  4. Hazırlanan tüm boruları, şırıngaları ve kuyu plakasını perfüzyon için kullanılacak inkübatöre dikkatlice getirin.
  5. Şırınga pompasını ve fraksiyon toplayıcıyı inkübatörün yakınında istenen yerlere yerleştirin. Şırınga pompasını inkübatörün üstüne veya yanına yerleştirin ve fraksiyon toplayıcıyı inkübatörün yanına, portun yanına yerleştirin.
  6. Tüm yukarı ve aşağı akış tüplerinin kapaklı uçlarını bir araya getirin ve bunları inkübatörün dışından liman üzerinden içeriye doğru itin.
  7. Şırıngaları şırınga pompasına yükleyin ve çıkış yönündeki tüplerin açık uçlarını, fraksiyon toplayıcının çok kafalı dağıtıcısının dağıtım pipet uçlarına yerleştirin.
  8. İnkübatörün içinde, akan ortamın inkübatör havasından ısı ve CO2 alabileceği boru uzunluğunu en üst düzeye çıkarmak için inkübatöre mümkün olduğunca fazla yukarı akış borusu gevşetin. Bunları yerinde tutarken, aşağı akış tüplerini inkübatörden dışarı çekin, böylece fraksiyon toplayıcı üzerindeki en uzak uzatılmış noktaya ulaşabilmeleri için kapaklı uçları inkübatörün içinde tutmaya devam edin.
  9. Tıkanan her kuyu için, iğneleri ve bu kuyu için yukarı ve aşağı akış tüplerini hızlı bir şekilde açın ve bunları Luer konektörleriyle birbirine takın.
  10. Tüm parçalar bağlandıktan sonra, tüm akışların düzgün bir şekilde aktığından emin olmak için şırınga pompasını nispeten yüksek bir hızda kısaca çalıştırın.
  11. Bu noktada, deneye ortamla dolu çıkış yönündeki tüplerle başlamak istenirse, hepsi dolana kadar pompayı çalıştırmaya devam edin. Aksi takdirde, pompayı durdurun.
  12. Şırınga pompası akış hızını ve fraksiyon toplama sıklığını ayarlayın ve deneye başlamak için her iki makineyi aynı anda başlatın. İstenilen deneme süresi boyunca kesirleri toplayın.

5. Perfüzyon sistemini, birden fazla ortam kaynağı için bir stopcock ile kurun

  1. Yukarıdaki adım 4.1'in tüm alt adımlarını gerçekleştirin.
  2. Perfüzyonda kullanılacak iki ortamı hazırlayın, ilk önce dağıtılacak ortamı 1, diğerini orta 2 olarak etiketleyin.
  3. Perfüze edilecek her kültür için, bir şırıngayı dispenzasyon süresi boyunca yeterli ortam 1 ile doldurun, ayrıca başlangıçta perfüzyon sistemini doldurmak için yeterli hacim. İkinci bir şırıngayı, veriliş süresi boyunca yeterli orta 2 ile doldurun.
  4. Her iki şırıngayı da dört yönlü bir stopcock'un üç portundan ikisine bağlayın.
    NOT: Şırıngaları tıkayıcılara bağlamak için bir boru uzunluğu gerekebilir.
  5. Stopcock'u ve şırıngaları, yukarıdaki 3.1.7-3.1.8 adımlarına benzer şekilde, stopcock'u orta 1'e kapatarak ve orta 2'yi açık porttan damlamaya başlayana kadar stopcock'a dağıtarak hazırlayın.
  6. Stopcock'u orta 2'ye kapatın ve kalan tüm orta 2 açık porttan atılana kadar orta 1'i stopcock'a dağıtın.
  7. Dişi-dikenli Luer konektörü kullanarak yukarı akış borusunu açık stopcock portuna takın. Tüpün diğer ucunda, erkekten dikenlere Luer konektörü takın.
  8. Yukarı akış tüpü tamamen ortamla dolana kadar şırıngadan orta 1'i dağıtın.
  9. Yukarıdaki 4.3-4.11 adımlarıyla devam edin, her iki şırıngayı ayrı şırınga pompalarına ve sadece dağıtım ortamı 1'e yükleyin.
  10. Şırınga pompası akış hızını orta 1 ve fraksiyon toplama sıklığı için ayarlayın ve deneye başlamak için her iki makineyi aynı anda başlatın.
  11. Orta kaynak değiştirilecekse, şırınga pompasını orta 1 için hızlı bir şekilde durdurun, durdurma musluğunu orta 1'e kapatın ve şırınga pompasını orta 2 için başlatın. Daha sonra isterseniz, kaynağı benzer şekilde orta 1'e geri döndürün.
  12. İstenilen deneme süresi boyunca kesirleri toplayın.

6. Farmakokinetiği taklit etmek için perfüzyon sistemini karıştırılmış bir tankla kurun

  1. İlgilenilen ilaç için farmakokinetik veriler elde edin ve bunun bir konsantrasyon zirvesinden ve ardından üstel bir çürümeden oluştuğundan emin olun.
  2. Zirveyi 0 zamanına ayarladıktan ve tepe noktasından önceki veri noktalarını kaldırdıktan sonra, karıştırılan tank RTD denklemini verilere sığdırmak için Stirred_Tank_Fit.m komut dosyasını (Ek Dosya 6) kullanın. Giriş v (istenen perfüzyon akış hızı) ve bir çift vektör olarak doğrudan komut dosyasına sığdırılacak veriler, sırasıyla zaman değerleri ve konsantrasyon değerleri için t ve C ile birlikte. Gerekli karıştırılmış tank hacmi olan V parametresini yazdırmak için komut dosyasını çalıştırın.
  3. Perfüzyon sistemi için iki şırınga pompası ve inkübatörün yukarı yönünde bir plaka çalkalayıcı içerecek şekilde bir düzen planlayın.
  4. Perfüzyon sistemi bileşenlerinin RTD'lerini stopcock'un ötesinde ölçün ve uygun bir farmakokinetik profil bulmak için çeşitli ilaç nabız süreleri ve konsantrasyonları ile RTD'lerin sinyal evrişimini gerçekleştirin. Bu hesaplamada uygun karıştırılmış tank RTD denklemini kullanın.
  5. Yukarıdaki 5.1-5.8 arası adımlarla devam edin.
  6. Kurulum için karıştırılmış tank olarak uygun boyutta ek bir kuyu plakası kullanın. Her kuyu, perfüze edilmiş bir kültür için karıştırılmış bir tank görevi görebilir. Kuyuyu gerekli miktarda orta, V ile doldurun ve kuyuyu başlangıçta yukarı çekilen iğnelerle takın, daha sonra kuyunun dibine itin ve iğneleri kapatın.
  7. Şırıngaları şırınga pompalarına yükleyin ve boruyu şırıngalardan karıştırılmış tankların kapaklı giriş iğnelerine hızlı bir şekilde bağlayın. Daha sonra hücre kültürü yukarı akış tüp girişlerini karıştırılmış tankların çıkış iğnelerine bağlayın.
  8. 5.9-5.10 arasındaki adımlarla devam edin.
  9. İstenilen zamanda, adım 5.11'de açıklandığı gibi, ilacı içeren dağıtım ortamı 2'ye geçin. İlaç infüzyonu tamamlandığında orta 1'e geri dönün.
  10. Adım 5.12 ile devam edin.

figure-protocol-1
Resim 3: Çok kafalı dağıtıcı. Lazer kesimli çok kafalı dağıtıcı için tasarım. Bu rakam Erickson ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün 5. bölümünden çoklu ortam kaynaklarına sahip perfüzyon sistemi, tümör nekroz faktörü alfasının (TNF-α) 1.5 saatlik nabzına yanıt olarak, insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücrelerinde aktive edilmiş B hücrelerinin (NF-κB) transkripsiyon faktörünün nükleer faktör kappa-hafif zincir-arttırıcısı tarafından yönlendirilen bir muhabir genin ekspresyon dinamiklerini ölçmek için kullanıldı. HEK293 hücreleri, dönüştürülmüş hücreleri izole etmek için floresan ile aktive edilmiş hücreler sıralama (FACS) yoluyla

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, TNF-α geçici bir darbesine yanıt olarak NF-κB güdümlü gen ekspresyonunun dinamiklerinin ölçüldüğü spesifik bir örnekle gösterilen çoklu ortam kaynaklarına sahip bir perfüzyon hücre kültürü sisteminin montajını ve çalışmasını açıklamaktadır. Perfüzyon sistemi bileşenlerinin RTD'leri ölçüldü ve modellendi ve hem hücrelerin TNF-α darbesine maruz kalmasını hem de toplanan atık su orta fraksiyonlarındaki TNF-α dağılımını tahmin etmek için sinyal evrişimi kullanıldı. Hücreler darbeye maruz bırakıldı ve fraksiyonlar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma Hibe No'lu destek ile yürütülmüştür. Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden R01EB012521, R01EB028782 ve T32 GM008339.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
18 Gauge 1 1/2- inç Şırıngalar ve Dağıtım Makineleri ile Kullanım İçin Tek Kullanımlık Prob İğnesiGrainger5FVK2
293T HücreleriATCCCRL-3216HEK 293T hücreleri Temsili Sonuçlar deneyinde kullanılmıştır.
96 Kuyulu Şeffaf Alt Plakalar, CorningVWR89091-010RTD deneylerinde boya konsantrasyonlarını ölçmek için plakalar ve temsili sonuçlar deneyinde GLuc
BD  Luer-Lok Uçlu Tek Kullanımlık Şırıngalar, 5 mLFisher Scientific14-829-45
BioFrac Fraksiyon Toplayıcı Bio-Rad7410002Tek bir akış için kullanılabilen veya birden fazla akıştan toplamayı sağlamak için yöntemimiz kullanılarak değiştirilebilen Fraksiyon toplayıcı.
Şeffaf Yüksek Mukavemetli UV Dayanımlı Akrilik 12" x 12" x 1/8"McMaster-Carr4615T93Bu tabaka, BioFrac fraksiyon toplayıcısına takılabilen çok kafalı dağıtıcıyı üretmek için ek malzemelerdeki DXF dosyasına göre bir lazer kesici kullanılarak kesilir.
Temsili sonuçlarda Gaussia lusiferaz biyolüminesans testinde kullanılanCoelenterazine doğalNanoLight Teknolojisi303
Corning Costar TC ile İşlenmiş Çoklu Kuyu Plakaları, boyut 48  kuyular, polistiren plaka, düz tabanlı kuyularMillipore SigmaCLS3548Temsili sonuçlarda 293T hücrelerini büyütmek ve perfüze etmek için kullanılır.
Corning  Costar Düz Tabanlı Hücre Kültürü Plakaları, boyut 12 kuyuFisher Scientific720081Perfüzyonda farmakokinetik profiller üretmek için tıkalı ve karıştırılmış bir tank olarak kullanılabilir. Perfüzyon için hücreler de içerebilir.
DMEM, yüksek glikozluThermoFisher Scientific11965126
Epilog Zing 24 LazerKesim Kenar SistemleriEpilog Zing 24Akrilik levhadan çok kafalı dağıtıcı üretmek için kullanılan lazer kesici. Diğer lazer kesiciler kullanılabilir.
Fisherbrand Tek Kullanımlık Steril Şırıngalar, Luer-Lock, 20 mLFisher Scientific14-955-460
Fisherbrand Tek Kullanımlık Steril Şırıngalar, Luer-Lock, 60 mLFisher Scientific14-955-461
Fisherbrand Premium Mikrosantrifüj Tüpleri: 1.5 mLFisher Scientific05-408-129Fraksiyonları toplamak için mikrosantrifüj tüpleri.
Balıkçı markası  Düz Uçlu Yuvarlak Alt Tek Kullanımlık Borosilikat Cam TüplerFisher Scientific14-961-26Fraksiyonları toplamak için cam tüpler.
Balıkçı markası  SureOne Micropoint Pipet Uçları, Evrensel Uyum, FiltresizFisher Scientific2707410Dağıtım ucu görevi görecek şekilde çok kafalı dağıtıcıya ve boruya en iyi uyan 300 ul pipet ucu
Gibco  DPBS, toz, kalsiyum yok, magnezyum yokFisher Scientific21600010Fosfat tamponlu tuzlu su.
Labline 4625 Titre ÇalkalayıcıMarshall ScientificLabline 4625 Titre ÇalkalayıcıKarıştırılmış tankları karıştırmak için kullanılan orbital çalkalayıcı.
Masterflex Bağlantı Elemanı, Polikarbonat, Dört Musluk, Erkek Luer Kilidi, Steril Olmayan; 10/PKCole-ParmerEW-30600-04RTD deneyleri ve hücre kültürü deneyleri için çoklu giriş akışlarını birleştirmek için kullanılır.
Masterflex Bağlantı Elemanı, Polikarbonat, Düz, Dişi Luer x Kapak; 25/PKMasterflexUX-45501-28
Masterflex Bağlantı Elemanı, Polipropilen, Düz, Dişi Luer - Hosebarb Adaptörleri, 1/16"Cole-ParmerEW-45508-00
Masterflex Bağlantı Elemanı, Polipropilen, Düz, Erkek Luer Kilidinden Hortum Çubuğu Adaptörüne, 1/16" IDCole-ParmerEW-45518-00
Masterflex Bağlantı Elemanı, Polipropilen, Düz, Erkek Luer Kilidi - Fiş Adaptörü; 25/PKMasterflexEW-30800-30
Masterflex L/S Hassas Pompa Hortumu, Platinle Kürlenmiş Silikon, L/S 14; 25 ftMasterflexEW-96410-14
MATLABMathWorksR2019bSürüm R2019b. Daha yeni sürümler de kullanılabilir. Bazı eski sürümler çalışabilir.
NE-1600 Altı Kanallı Programlanabilir Şırınga PompasıYeni Dönem Pompa SistemleriNE-1600
Raf Seti F1Bio-Rad7410010Fraksiyon toplayıcıda toplama tüplerini tutmak için raflar.
Rekombinant İnsan TNF-alfa (HEK293 eksprese edilmiş) Proteini, CFBio-Techne10291-TA-020Sitokin, temsili sonuçlarda 293T hücrelerini uyarmak için kullanılır.
Saint Gobain Katı Tıpalar, Versilic Silikon, Boyut: 00, Alt 10.5mmSaint GobainDX263015-5048 oyuklu plakalara uyar.
Saint Gobain Katı Tıpalar, Versilic Silikon, Boyut: 4 Alt 21mmSaint GobainDX263027-1012 oyuklu plakalara uyar.
Sodyum Hidroksit, 10.0 N Sulu Çözelti APHA; 1 LSpektrum KimyasallarıS-395-1LT
SolidWorksDassault SistemleriÇok kafalı dağıtıcı DXF dosyasını oluşturmak için kullanılanSolidWorks
Varioskan LUX çok modlu mikroplaka okuyucuThermoFisher ScientificVL0000D0Plaka okuyucu.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, BlueMichaels10404779RTD deneylerinde izleyici olarak kullanılan Brilliant Blue FCF (Parlak mavi) içeren mavi gıda boyası. Absorbans spektrumu 628 nm'de zirve yapar.
. Substratı.. CAD yazılımı.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  2. Talaei, K., et al. A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153(2021).
  3. Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume. FASEB Journal. 35 (3), 21305(2021).
  4. Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).
  5. Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals. Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).
  6. Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. An outlook on microfluidics: the promise and the challenge. Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).
  7. Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (117), e54673(2016).
  8. Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells. Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).
  9. Watanabe, T., et al. Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells. Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).
  10. Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems. Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).
  11. Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion. Analytical Biochemistry. 625, 114213(2021).
  12. Saltzman, W. M. Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , Oxford University Press. (2001).
  13. Fogler, H. S. Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).
  14. Conesa, J. A. Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , Wiley. (2019).
  15. Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing). Processes. 7 (9), 615(2019).
  16. Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay. FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).
  17. Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests. Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).
  18. Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber. Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).
  19. Gaida, L. B., et al. Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle. HAL Open Science. , (2008).
  20. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution. New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).
  21. Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kal S resi Da l mr nga PompasFraksiyon Toplay cAksiyel Dispersiyon Modeliok Kuyucuklu Plakazleyici zeltiz nen Dispersiyonu

İlgili makaleler