Bu protokol, tek emülsiyon formülasyonuna dayalı kolay mikroakışkan teknolojisi ile poli(laktik-ko-glikolik asit) bazlı yüksek açık gözenekli mikrosferlerin (HOPM'ler) üretimini açıklamaktadır. Bu mikrosferlerin doku mühendisliği ve ilaç taramasında potansiyel uygulamaları vardır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mikroakışkan Teknoloji ile Yüksek Açık Gözenekli Mikrosferlerin ( HOPM'ler ) Üretilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Toplu iskeleler ve tek başına hücrelerin doğrudan enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, enjekte edilebilir modüler üniteler, hücrelerin paketlenmesindeki kolaylık, gelişmiş hücre tutma ve minimum invazivlik nedeniyle arızalı dokuların onarımında büyük ilgi görmüştür. Dahası, bu mikro ölçekli taşıyıcıların gözenekli konformasyonu, orta değişimi artırabilir ve besin ve oksijen kaynaklarının seviyesini artırabilir. Bu çalışma, hücre dağıtım uygulamaları için kolay mikroakışkan teknolojisi ile poli(laktik-ko-glikolik asit) bazlı yüksek açık gözenekli mikrosferlerin (PLGA-HOPM'ler) uygun şekilde üretilmesini göstermektedir. Ortaya çıkan monodispers PLGA-HOPM'lar, ~400 μm'lik parçacık boyutlarına ve birbirine bağlı pencerelerle ~50 μm'lik açık gözeneklere sahipti. Kısaca,% 7.5 (w / v) jelatin sulu faz ile sarılmış emülsifiye yağ damlacıkları (diklorometan, DCM'deki PLGA çözeltisi), özelleştirilmiş mikroakışkan kurulumdaki koaksiyel nozul aracılığıyla% 1 (w / v) sürekli akan poli (vinil alkol) (PVA) sulu çözeltiye sokulmuştur. Daha sonra, mikrosferler çözücü ekstraksiyonu ve liyofilizasyon prosedürlerine tabi tutuldu ve bu da HOPM'lerin üretilmesiyle sonuçlandı. Özellikle, çeşitli formülasyonlar (PLGA ve porojen konsantrasyonları) ve işleme parametreleri (emülsifiye edici güç, iğne göstergesi ve dağınık fazın akış hızı), ortaya çıkan PLGA HOPM'ların niteliklerinde ve özelliklerinde çok önemli roller oynamaktadır. Dahası, bu mimariler, genişletilmiş ilaç keşfi ve doku rejenerasyonu uygulamaları için büyüme faktörleri gibi çeşitli diğer biyokimyasal ipuçlarını potansiyel olarak kapsülleyebilir.
Giriş
Hücre yüklü mikrosferler, in situ hücre tutma kapasitesinin artması, hücrelerin verimli bir şekilde verilmesi ve ardından in vivo1 hücre çoğalmasının kabiliyeti gibi olumlu avantajlar sunar. Bugüne kadar, doku rejenerasyonu veya ilaç tarama uygulamaları için hücreler için elverişli bir ortamı desteklemek üzere başarılı bir iskele yapısı geliştirmek için çok sayıda araştırma yapılmıştır2. Bununla birlikte, hipoksi ortamı, yetersiz besin / oksijen kaynağı ve metabolik atık birikimi nedeniyle iç mekanlarda çoğu zaman kaçınılmazdır3. Bu sorunların üstesinden gelmek için, çeşitli biyo....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Çözeltilerin hazırlanması
- PVA stok çözeltisini, PVA çözeltisini 80 °C'lik bir su banyosunda ısıtarak ve daha sonra 4 °C'de buzdolabına yerleştirerek önceden hazırlayın. Deneysel kullanım için oda sıcaklığına (RT) soğutun.
- Sulu jelatin çözeltisini (1 mL,% 7.5, w / v) PLGA'nın organik fazına (2 mL,% 2, diklorometan, DCM'de w / v) ekleyerek emülsiyon öncüsünü hazırlayın (bkz.
NOT: Genel olarak, mikroakışkan teknolojisi, mikrosferleri oluşturmak için farklı aşamalar içerir. Sürekli veya toplama fazı sulu bir poli (vinil alkol) içerir (PVA, 600 mL,% 1, w / v).
2. Damlacık m....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Ana parametreler1'i optimize eden önceki çalışmalara dayanarak, PLGA buharlaştırılabilir DCM çözücü içinde çözüldü. Birincil W / O emülsiyonu, ultrasonik prob tedavisi altında jelatin ile homojenize edilerek hazırlanmıştır. Özelleştirilmiş ko-akışlı akışkan yapı, akışları sürekli olarak tanıtmak için bir şırınganın kullanıldığı basit bir şekilde monte edildi. Ayrıca, PLGA mikrosferlerinin PVA ve jelatinini ortadan kaldırmak için yeterli durulama prosedürleri gerçekleştirilmiştir (Şekil 1A,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede, PLGA-HOPM'ler gibi PLGA tabanlı mimariler üretmek için etkili bir strateji açıklanmaktadır. PLGA'nın çözücü uçuculuğundan kaçınmak ve emülsiyonun hazırlanması sırasında ultrasonik gücün hedef konuma nazikçe ayarlanması da dahil olmak üzere birkaç kritik adımın dikkatlice atılması gerektiğine dikkat edilmelidir. Ek olarak, 20 mL şırınganın sıvı çıkışı, emülsifiye öncüllerin faz ayrımını çözmek için belirli bir dereceye kadar ayarlanabilir. Bununla birlikte, bir sınırlama, porojen durumu çevresel sıcaklıktan e.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
SCL, YW, RKK ve AZC, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (NSFC, 32071323, 81971734 ve U1605225) ve Fujian Eyalet Üniversitesi'ndeki Bilim ve Teknoloji Yenilikçi Araştırma Ekibi Programı'ndan finansal desteği kabul eder. YSZ ne bu programlardan herhangi biri tarafından desteklendi ne de herhangi bir türde ödeme aldı; bunun yerine, Brigham Araştırma Enstitüsü'nün desteği kabul edilmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Santrifüj tüpü | Solarbio, Pekin, Çin | 5 mL & 50 mL (sterilite) | |
| Konfokal lazer tarama mikroskobu | Leica, Wetzlar, Almanya | TCS SP8 | |
| Diklorometan | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Şangay, Çin | 20161110 | Araştırma Sınıfı |
| Dağıtım iğnesi | Nazikçe, Şangay, Çin | 26 G, ID: 250 μ m, OD: 460 μ m | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, ABD | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Karışımı) L-glutamin |
| Etil alkol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Şangay, Çin | 20210918 | Araştırma Sınıfı |
| Etil-enediamintetraasetik asit (EDTA)-tripsin | Biyolojik Endüstriler, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Tripsin (% 0.25), EDTA (% 0.02) | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Biyolojik Endüstriler, Kibbutz Beit-Haemek, İsrail | Araştırma Sınıfı | |
| Dondurarak kurutucu | Bilon, Şangay, Çin | FD-1B-50 | |
| Jelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, ABD | lot # SZBF2870V | Domuz derisinden, Tip A |
| Cam alt plaka | Biosharp, Hefei, Çin | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Cam kılcal | Huaou, Jiangsu, Çin | 0.9-1.1 & zamanlar; 120 mm | |
| Kuluçka makinesi çalkalayıcı | Zhicheng, Şangay, Çin | ZWYR-200D | |
| Canlı ölü kiti hücre görüntüleme kiti | Solarbio, Pekin, Çin | 60421211112 | Canlı hücrelerde yeşil floresan (ex/em 488 nm/515 nm). Ölü hücrelerde kırmızı floresan (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Düşük hızlı santrifüj | Xiangyi, Hunan, Çin | TD5A | |
| Magnetron püskürtme | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, Çin | MSP-2S | |
| Mikro akış enjeksiyon pompası | Harvard Aparatı, Holliston, ABD | Harvard Pompası 11 Plus | |
| Penisilin-streptomisin | Biyolojik Endüstrileri, Kibbutz Beit-Haemek, İsrail | 2135250 | Araştırma Sınıfı |
| Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) | Servicebio Technology Co., Ltd. Wuhan, Çin | GP21090181556 | PBS 1x, kültür sınıfı, Kalsiyum yok, Magnezyum yok |
| Poli (laktik- co < / em> - glikolik asit) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, ABD | lot # MKCF9651 | 66– 107 kDa, laktit: glikolid 75: 25 |
| Poli (vinil alkol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, ABD | lot # MKCK4266 | 13-13 kDa,% 98 Hidrolize |
| PVC boru | Shenchen, Şangay, Çin | İç çap, ID: 1 mm | |
| Sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücreleri | Procell, Wuhan, Çin | ||
| Taramalı elektron mikroskobu | Phenom pure, Eindhoven, Hollanda | Tıbbi amaçlı hızlanma voltajını 5 kV | |
| Syrine | Nazikçe, Şangay, Çin | 5 mL & 50 mL (iğne ile) | |
| Sıcaklık su banyosu | Mingxiang, Shenzhen, Çin | 36 W | |
| Trafo | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, Çin | SZ-2KVA | |
| Ultrasonik hücre kesici | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, Çin | JY 92-IID | |
| UV kürleme tutkalı | Zhuolide, Foshan, Çin | D-3100 |
Kaynaklar
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397(2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Adv....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
