Bu protokol, fare preadipositlerinin deri altı yağdan izolasyonunu, olgun adipositlere farklılaşmasını ve insülin direncinin indüklenmesini açıklar. İnsülin etkisi, batı lekesi boyunca insülin sinyal yolunun üyelerinin fosforilasyonu / aktivasyonu ile değerlendirilir. Bu yöntem, primer adipositlerde insülin direncinin/duyarlılığının doğrudan belirlenmesini sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Primer Kültürde Diferansiye Fare Adipositleri: İnsülin Direncinin Bir Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
İnsülin direnci, insülinin hedef hücreleri üzerindeki azaltılmış bir etkisidir ve genellikle azalmış insülin reseptör sinyalizasyonundan kaynaklanır. İnsülin direnci, tip 2 diyabet (T2D) ve dünya çapında yüksek prevalansı olan diğer obezite kaynaklı hastalıkların gelişimine katkıda bulunur. Bu nedenle, insülin direncinin altında yatan mekanizmaları anlamak büyük önem taşımaktadır. İnsülin direncini hem in vivo hem de in vitro olarak incelemek için çeşitli modeller kullanılmıştır; Primer adipositler, insülin direncinin mekanizmalarını incelemek ve bu duruma ve insülin duyarlılaştırıcı ilaçların moleküler hedeflerine karşı koyan molekülleri tanımlamak için çekici bir seçenektir. Burada, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ile tedavi edilen kültürde primer adipositleri kullanarak bir insülin direnci modeli oluşturduk.
Manyetik hücre ayırma teknolojisi ile kollajenaz ile sindirilmiş fare deri altı yağ dokusundan izole edilen adiposit öncü hücreleri (APC'ler), primer adipositlere ayrılır. İnsülin direnci daha sonra insülin sinyal kaskadı üyelerinin tirozin fosforilasyonunu / aktivasyonunu azaltan proinflamatuar bir sitokin olan TNF-α ile tedavi ile indüklenir. İnsülin reseptörünün (IR), insülin reseptör substratının (IRS-1) ve protein kinaz B'nin (AKT) azalmış fosforilasyonu, batı lekesi ile ölçülür. Bu yöntem, yağ dokusunda insülin direncine aracılık eden mekanizmaları incelemek için mükemmel bir araç sağlar.
Giriş
İnsülin, pankreas adacığı β hücreleri tarafından üretilen anabolik bir hormondur ve glikoz ve lipit metabolizmasının anahtar düzenleyicisidir. Birçok işlevi arasında, insülin glikoz alımını, glikojen sentezini, glukoneogenezi, protein sentezini, lipogenezi ve lipoliz1'i düzenler. Reseptörü (IR) ile insülin etkileşiminden sonraki ilk moleküler sinyal, IR2'nin intrinsik tirozin protein kinaz aktivitesinin aktivasyonudur, bu da otofosforilasyon3 ile sonuçlanır ve daha sonra adaptör proteinlerine bağlanan insülin reseptör substratları (IRS) olarak bilinen bir protein ailesinin aktivasyonudur. protein ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm kemirgen deneyleri, UNAM Nörobiyoloji Enstitüsü Biyoetik Komitesi, protokol numarası 075 tarafından onaylanmıştır.
1. Fare adiposit öncü hücrelerinin izolasyonu
- 8-10 haftalık erkek C57BL / 6 fareleri ötenazi yapın (örneğin, CO2 inhalasyonu ve müteakip servikal çıkık ile) (izolasyon başına dört hayvan). Fareleri %70 etanol ile ovalayarak dezenfekte edin ve kurbandan hemen sonra yağ dokusunu elde edin.
NOT: Kemirgenlerin ötenazisinden sonra, yağ dokusunu derhal izole edin ve steril laminer akış başlığı içindeki tüm adımları gerçekleştirin. Fareler, yiyecek ve suya serbest erişim ile 12 saat açık / ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Son birkaç yılda, obezite ve T2D prevalansının artması, yağ dokusunda insülin direncine aracılık eden mekanizmalar için yoğun bir araştırmaya yol açmıştır. Burada açıklanan protokolle, APC'ler insülin direncini ve duyarlılığını değerlendirmek için olgun adipositlere ayrılabilir. APC'ler birleşime ulaştıklarında, olgun adipositlere farklılaşmalarını ve TNF-α aracılı insülin direnci indüksiyonlarını tamamlamak 10 gün sürer (Şekil 1).
APC'ler, düz ve uzun şekilleri v.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, TNF-α ile tedavi edilen kültürde primer adipositleri kullanan insülin direncini incelemek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu model, birincil adipositlerin, hücresel çevresel faktörlerin sıkı bir kontrolü ile tanımlanmış koşullar altında uzun süre kültürlenebilmesi avantajına sahiptir26. Tahlil süresi 15-20 gündür, ancak deneyler arasında farklılaşmış adipositlerin yüzdesinde değişiklikler meydana gelebilir. Primer adipositler, kültürde sürekli olarak genişlemedikleri ve türetildikleri do.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla ve María Antonieta Carbajo'ya teknik yardımları için ve Jessica Gonzalez Norris'e makaleyi eleştirel bir şekilde düzenledikleri için teşekkür ederiz. Bu protokol Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (Y.M.) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1. İzolasyon fare adiposit öncü hücreleri | |||
| ACK parçalama tamponu | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Mikroboncuklar | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Ayırıcı | Miltenyi | ||
| Bodrum membran matrisi (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Büyüme faktörü |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoklonal Antikor (30-F11) - Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Kollajenaz, Tip 1 | Worthington Biyokimya | LS004197 | |
| Deksametazon | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM düşük glikoz | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Büyüme faktörü |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS karışımı | Sigma | I3146 | |
| L-askorbik asit 2-fosfat | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Büyüme faktörü |
| Linoleik asit-albümin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 orta | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Büyüme faktörü |
| Penicilin-Streptomisin | BioWest | L0022-100 | |
| Ön Ayırma Filtreleri (70 & mikro; m) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Tripsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adiposit farklılaşması ve insülin direnci indüksiyonu | |||
| 3-İzobutil-1-metilksantin [IBMX] | Sigma | I5879 | Farklılaşma kokteyli |
| BMP4 | R& D Systems | 5020-BP-010 | Farklılaşma kokteyli |
| Deksametazon | Sigma | D1756 | Farklılaşma kokteyli |
| İnsülin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Farklılaşma kokteyli |
| TNF & alfa; | Ar-Ge D Sistemleri | 210-TA-005 | |
| 3. İnsülin sinyal yolunun western blot | |||
| Anti-beta tubulin antikoru | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli tampon |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA tampon |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA tampon |
| FluorChem E sistemi | ProteinBasit | ||
| Gliserol | Sigma | G6279 | Laemmli tamponu |
| Glisin | Sigma | G7126 | Çalıştırma ve Transfer tamponu |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA tamponu |
| 2-merkaptoetanol | Sigma | M3148 | Laemmli tamponu |
| Metanol | JT Baker | 907007 | Transfer tamponu |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA tamponu |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA tamponu |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA tamponu |
| Nitroselüloz membran ve nbsp; | BioRad | 1620112 | |
| Yağsız kuru süt | BioRad | 1706404 | Bloke edici çözelti |
| Önceden boyanmış protein standardı | BioRad | 1610395 | |
| Proteaz inhibitörü kokteyli | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroksidaz AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Fosfo-İnsülin Reseptörü ve beta; | Hücre sinyalizasyonu | 3024 | |
| Fosfo-Akt (Ser473) Antikoru | Hücre sinyali | 9271 | |
| Fosfo-IRS1 (Tyr608) | antikoru Millipore | 9432 | |
| Sakkaroz | JT Baker | 407205 | RIPA tamponu |
| SDS | BioRad | 1610302 | Çalışan ve laemmli tamponu |
| SuperSignal West Pico PLUS Kemilüminesan Yüzey | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Çalıştırma, aktarma ve laemmli tamponu |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA tamponu - TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
Kaynaklar
- Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
