Yöntem makalesi

KÜBİK ile Tüm Böbrek Üç Boyutlu Boyama

4.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63986

⸱

18 Temmuz 2022

 , 
1Division of Nephrology and Endocrinology, The University of Tokyo

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, üç boyutlu (3D) böbrek görüntüleme için bir doku temizleme yöntemi ve tam montajlı immünofloresan boyama yöntemini tanımlamaktadır. Bu teknik, böbrek patolojisinde makroskopik perspektifler sunarak yeni biyolojik keşiflere yol açabilir.

Özet

Konvansiyonel patoloji böbrek mikroyapısı hakkında çok sayıda bilgi vermesine rağmen, üç boyutlu (3D) bilgi eksikliği nedeniyle böbrekteki kan damarlarının, proksimal tübüllerin, toplama kanallarının, glomerüllerin ve sempatik sinirlerin kesin yapısını bilmek zordu. Optik temizleme, bu büyük engelin üstesinden gelmek için iyi bir stratejidir. Bütün bir organdaki çoklu hücreler, doku temizleme ve 3D görüntüleme tekniği birleştirilerek tek hücre çözünürlüğünde analiz edilebilir. Bununla birlikte, tüm organ görüntüleme için hücre etiketleme yöntemleri az gelişmiş kalmaktadır. Özellikle, antikor penetrasyonundaki zorluk nedeniyle tüm organ boyama zordur. Mevcut protokol, CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) doku temizleme yöntemi ile 3D görüntüleme için tam montajlı bir fare böbrek boyama geliştirdi. Protokol, iskemi-reperfüzyon hasarı sonrası renal sempatik denervasyonun ve diyabetik böbrek hastalığının erken evresinde glomerülomegalinin kapsamlı bir bakış açısıyla görselleştirilmesini sağlamıştır. Böylece, bu teknik makroskopik bir bakış açısı sağlayarak böbrek araştırmalarında yeni keşiflere yol açabilir.

Giriş

Böbrek çeşitli hücre popülasyonlarından oluşur. Konvansiyonel patoloji bize böbrek mikroçevresi hakkında çok fazla bilgi vermesine rağmen, böbrek hastalığı progresyonu sırasında hücreler arası çapraz konuşmayı tam olarak anlamak için üç boyutlu (3D) görüntülemeye ihtiyaç vardır. Geçmişte, tüm organ 3D görüntüleme1 için çok sayıda seri kesitleme ve görüntü rekonstrüksiyonu yapılması gerekiyordu. Ancak bu yöntem çok fazla çaba gerektiriyordu ve tekrarlanabilirlik açısından sorunlar yaşıyordu.

Optik temizleme, bu engelin üstesinden gelmek için iyi bir stratejidir 2,3. Doku opaklığı esas olarak ışık saçılması ve emiliminden kaynaklanır, çünkü her organ su, protein ve lipitler dahil olmak üzere çeşitli maddelerden oluşur. Bu nedenle, doku temizlemenin temel stratejisi, dokulardaki su ve lipitleri, proteinlerle aynı optik özelliklere sahip kırılma indisi (RI) eşleşen reaktiflerle değiştirmektir4. Şeffaf bir örneği gözlemlemek için, hafif bir tabaka floresan mikroskobu yararlıdır5. Işık tabakaları şeffaf numuneyi yandan aydınlatır ve uyarma sinyalleri dikey konumda bulunan objektif lens aracılığıyla elde edilir6. Bu mikroskopi, konfokal veya multifoton floresan mikroskopisinden farklı olan tek bir taramada kesit bilgisi elde eder. Böylece, düşük fotobeyazlatma seviyesine sahip z-stack görüntülerini hızlı bir şekilde elde edebilir.

Net, Engelsiz Beyin/Vücut Görüntüleme Kokteylleri ve Hesaplamalı Analiz (CUBIC), ışık tabakası floresan mikroskobuile tüm organların görüntülenmesini sağlayan doku temizleme yöntemlerinden biridir 2,7,8. KÜBİK ve tam montajlı immünofloresan boyama, fare böbrek 3D yapılarını görselleştirmek için bu çalışmada optimize edilmiştir 9,10,11. Bu bütünsel boyama yöntemini kullanarak, böbrek sempatik sinirlerindeki değişiklik, diyabetikböbrek hastalığı 11'in erken evresinde iskemi-reperfüzyon hasarı 9,10 ve glomerülomegaliden sonra, ayrıca kan damarları, proksimal tübüller ve bütün bir böbrekte toplama kanalları9 olarak görselleştirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler Tokyo Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. Tüm hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına göre gerçekleştirildi. Bu çalışmada 8 haftalık erkek C57BL/6NJcl fareler kullanıldı. Fareler ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Hayvan hazırlığı ve böbrek fiksasyonu

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek perfüzyon fiksasyonu gerçekleştirin.
    1. İzofluran (% 3, 2.0 L / dak) solunması ve intraperitoneal medetomidin hidroklorür (0.3 mg / kg), butorphanol tartarat (5 mg / kg) ve midazolam (4 mg / kg) (bkz.
    2. Hayvanı kalbin sol ventrikülünden fosfat tamponunda (PB) 20 mL PBS (pH 7.4) ve 30 mL% 4 PFA ile perfüze edin12.
  2. Daldırma fiksasyonunu perfüzyon fiksasyonundan ve böbrek örneklemesinden hemen sonra gerçekleştirin9.
    1. Böbreği 4 °C'de %4 PFA'ya 16 saat daha batırın, ardından PBS ile 2 saat (üç kez)9 yıkayın (Şekil 1).
      DİKKAT: Formaldehit ve paraformaldehit toksik tahriş edicilerdir. Reaktifleri uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla bir duman başlığında tutun.

2. Renk giderme ve delipidasyon

  1. Daha önce yayınlanan 4,8,9 raporlarını takiben, ağırlıkça% 10 Triton X-100 ve ağırlıkça% 10 N-bütildietanolamin'den oluşan renk giderme ve delipidasyon için CUBIC-L'yi hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu).
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek CUBIC-L ile renk giderme ve delipidasyon gerçekleştirin.
    1. Sabit böbreği, oda sıcaklığında 6 saat boyunca hafifçe sallanarak 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe (bkz. Malzeme Tablosu) 7 mL'lik %50 (v/v) CUBIC-L'lik (1:1 su ve CUBIC-L karışımı) batırın (Şekil 2A). Daha sonra, 5 gün boyunca 37 ° C'de hafifçe sallanan 14 mL'lik yuvarlak bir alt tüpe 7 mL CUBIC-L'ye batırın.
    2. Bu işlem sırasında CUBIC-L'yi her gün yenileyin. Renk giderme ve delipidasyon işleminden sonra, böbreği PBS ile oda sıcaklığında 2 saat (üç kez)9 yıkayın (Şekil 1). Numune işleme için bir dağıtım kaşığı kullanın (Şekil 2B).

3. Tam montajlı immünofloresan boyama

  1. Boyama tamponlarını hazırlayın.
    1. PBS'de% 0.5 (v / v) Triton X-100,% 0.5 kazein ve% 0.05 sodyum azid9 karıştırarak birincil antikorlar için boyama tamponunu hazırlayın.
    2. PBS'de% 0.5 (v / v) Triton X-100,% 0.1 kazein ve% 0.05 sodyum azid9 karıştırarak ikincil antikorlar için boyama tamponunu hazırlayın.
  2. Birincil antikorlarla boyama yapın.
    1. Delipide böbreği primer antikorlarla (1:100 veya 1:200, bakınız Malzeme Tablosu) 37 °C'de boyama tamponunda 7 gün boyunca hafifçe sallayarak immünoboyayın.
      NOT: Bir böbrek için gerekli boyama tamponu miktarı 500-600 μL'dir (Şekil 2C).
    2. Böbreği PBS'de (PBST) %0,5 (v/v) Triton X-100 ile oda sıcaklığında 1 gün9 boyunca yıkayın (Şekil 1).
  3. İkincil antikorlarla boyama yapın.
    1. Böbreği ikincil antikorlarla (1:100 veya 1:200, bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'de boyama tamponunda 7 gün boyunca hafifçe sallayarak immünoboyayın. Böbreği PBST ile oda sıcaklığında 1 gün9 boyunca yıkayın (Şekil 1).
    2. Fiksasyon9 sonrası, böbreği 3 saat boyunca PB'de% 1 formaldehit (% 37 formaldehit ve PB karışımı% 1: 36 karışımı) içine batırın ve 6 saat boyunca oda sıcaklığında PBS ile yıkayın (Şekil 1).

4. Kırılma indisi (RI) eşleştirmesi

  1. CUBIC-R+'ı hazırlayın.
    1. Ağırlıkça% 45 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolon / antipirin ve ağırlıkça% 30 nikotinamid karıştırarak CUBIC-R hazırlayın (bkz.
    2. Daha önce yayınlanan 4,8,9 raporlarını takiben CUBIC-R'ye N-bütildietanolaminin% 0,5 v'sini ekleyerek kırılma indisi (RI) eşleşmesi için CUBIC-R + hazırlayın.
  2. RI eşleştirmesini gerçekleştirin.
    1. Böbreği, 1 gün boyunca oda sıcaklığında hafifçe çalkalanan 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüp içinde 7 mL'lik %50 (v/v) CUBIC-R+ (1:1 su ve CUBIC-R+) karışımına batırın. Ardından, 2 gün9 boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallanan 14 mL'lik yuvarlak alt tüpe 7 mL CUBIC-R + 'ya batırın (Şekil 1).
      NOT: Böbrek, RI eşleşmesinin başlangıcında% 50 CUBIC-R + 'da yüzmesine rağmen, işlemin sonunda CUBIC-R + 'da batar ve şeffaf hale gelir (Şekil 2D).

5. Görüntü toplama ve yeniden yapılandırma

  1. Görüntü yakalama sırasında (RI = 1.51)5 (Şekil 3) RI uyumlu böbreği silikon yağı (RI = 1.555) ve mineral yağ (RI = 1.467) (55:45) karışımına batırın.
  2. Özel yapım9 ışık tabakası floresan mikroskop ile tüm böbreğin 3D görüntülerini elde edin (bkz. Tüm ham görüntü verilerini 16 bit TIFF biçiminde toplayın. Görüntüleme analiz yazılımı ile 3B olarak işlenmiş görüntüleri görselleştirin ve yakalayın (Imaris, bkz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu boyama yöntemi kullanılarak bütün böbrekte sempatik sinirler [anti-tirozin hidroksilaz (TH) antikoru] ve arterler [anti-α-düz kas aktin (αSMA) antikoru] (Şekil 4A,B ve Video 1) görselleştirildi9. İskemi/reperfüzyon hasarı (IRI)9,10 sonrası anormal renal sempatik sinirler de görüntülendi (Şekil 4C). Ayrıca, tüm dalak13'teki

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut protokol, sempatik sinirler, toplama kanalları, arterler, proksimal tübüller ve glomerüller 9,10,11 gibi çeşitli yapıların tüm böbrek 3D görüntülenmesine izin verdi. Bu boyama yöntemi, iskemi-reperfüzyon hasarı 9,10 ve diyabetik böbrek hastalığının ilk aşamasında glomerülomegali sonrası renal sempatik sinirlerdeki değişimi görselleştirerek makroskopik gözlem sağladı ve yeni biyolojik keş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışmanın bir kısmı Prof. Hiroki R. Ueda (Tokyo Üniversitesi), Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo Üniversitesi), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku Üniversitesi), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada ve Dr. Hirotaka Komaba (Tokai Üniversitesi) ile işbirliği içinde yürütülmüştür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
14 mL Yuvarlak Alt Yüksek Berraklık PP Test TüpüFalcon352059Doku temizleme, boyama, yıkama
2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolon / antipirinTokyo Kimya EndüstrisiD1876CUBIC-R+
%37-Formaldehit ÇözeltisiNacalai Tesque16223-55Sabitleme sonrası
%4-Paraformaldehit Fosfat Tampon ÇözeltisiNacalai Tesque09154-85Böbrek fiksasyonu
Alexa Flour 555-konjuge eşek anti-koyun IgG antikoruInvitrogenA-21436İkincil antikor (1:100)
Alexa Flour 647-konjuge eşek anti-tavşan IgG antikoruInvitrogenA-31573İkincil antikor (1:200
)Anti-aquaporin 2 (AQP2) antikoruAbcamab199975Birincil antikor (1:100)
Anti-podocin antikoruSigma-AldrichP0372Birincil antikor (1:100)
Anti-sodyum glikoz kotransporter 2 (SGLT2) antikoruAbcamab85626Birincil antikor (1:100
)Anti-tirozin hidroksilaz (TH) antikoruAbcamab113Birincil antikor (1:100)
Anti-&alfa;-düz kas aktin (&alfa;-SMA) antikoruAbcamab5694Birincil antikor (1:200)
Thermo Fisher Scientific37528'deBloker KazeinBoyama tamponu
Butorphanol TartaratMeiji005526Anestezik
C57BL/6NJclNippon Bio-Supp.CenterN/AFare suşu
ImarisBitplaneN/AGörüntüleme analiz yazılımı
Makro zoom mikroskobuOLYMPUSMVX10Gözlem ünitesi özel yapım mikroskop
Medetomidin HidroklorürKyoritsu-Seiyaku008656Anestezik
MidazolamSANDOZ27803229Anestezik
Mineral yağSigma-AldrichM8410Daldırma yağı
N-buthyldiethanolaminTokyo Kimya EndüstrisiB0725CUBIC-L, CUBIC-R +
NikotinamidTokyo Kimya EndüstrisiN0078CUBIC-R+
Polietilen glikol mono-p-izooktilfenil eter/Triton X-100Nacalai Tesque12967-45CUBIC-L, PBST
Silikon yağı HIVAC-F4Shin-Etsu Kimyasal50449832Daldırma yağı
Sodyum azidWako195-11092Boyama tamponu
PBS

Kaynaklar

  1. Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  4. Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  5. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  6. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  8. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  9. Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
  10. Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
  11. Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  17. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

B brek G r nt lemeCUBIC Doku Saydamla t rmaT m Ba lam Boyamamm nofloresan BoyamaAntikor PenetrasyonuRenal Sempatik SinirlerGlomeruli G rselle tirmeProksimal T b llerskemi Reperf zyon Hasar

İlgili makaleler