Beyin Dilimlerinde Miyelinasyon Görüntüleme için Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi (CARS) Uygulaması

Aksiyon potansiyelleri beyindeki temel bilgi birimidir ve aksonlar aracılığıyla aksiyon potansiyeli yayılımı bilgi işlemenin bir ayağını oluşturur ^1,2,3. Nöronlar tipik olarak diğer birçok nörondan afferent girdiler alır ve bu girdileri belirli bir dar zaman aralığı ^4,5 içinde bütünleştirir. Bu nedenle, aksonlardaki potansiyel yayılım mekanizmaları araştırmacılardan önemli miktarda ilgi görmüştür.

Bir akson boyunca yayılırken, güvenilir yayılmayı sağlamak için bir aksiyon potansiyeli akson boyunca tekrar tekrar yenilenir⁶. Çeneli omurgalıların (gnathostomlar) nöronlarının çoğunda, aksonlar, glial hücrelerin tipleri olan yakındaki oligodendrositler veya Schwann hücreleri tarafından üretilen lipit bakımından zengin bir madde olan bir miyelin kılıfı ile çevrilidir (^7,8'de gözden geçirilmiştir). Bu miyelin kılıf, aksonu elektriksel olarak yalıtır, kapasitansını azaltır ve aksiyon potansiyelinin verimli, hızlı ve daha düşük enerji tüketimi ile yayılmasına izin verir. Miyelin, aksonu düzgün bir şekilde örtmez, ancak aksonu, Ranvier'in düğümleri olarak adlandırılan aralarında kısa boşluklar olan bölümler halinde kaplar (^9,10'da gözden geçirilmiştir). Hem bir aksonun elektriksel yalıtım seviyesini kontrol eden miyelinasyon kalınlığı hem de bir akson boyunca aksiyon potansiyellerinin yenilenme sıklığını kontrol eden Ranvier düğümlerinin aralığı, aksiyon potansiyeli yayılım hızını etkiler (^11'de gözden geçirilmiştir).

Miyelinasyon kalınlığının aksonlar^{12,13,14'teki} aksiyon potansiyeli yayılım hızını etkilediğini öne süren geniş bir literatür ^vardır. Ayrıca, akson miyelinasyonundaki değişiklikler bir dizi CNS açığına neden olabilir 15,16,17,18,19,20,21. Bu nedenle, birçok araştırma çabasının odak noktasının akson miyelinasyonunun ölçümünü ve karakterizasyonunu içermesi şaşırtıcı değildir. Miyelin kalınlığının ölçümleri en yaygın olarak, önemli miktarda doku hazırlığı gerektiren ve immünohistokimya ile kombinasyon halinde kullanılması zor olan bir teknik olan elektron mikroskobu ile yapılmıştır. Bununla birlikte, Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisine (CARS) dayanan akson miyelinasyonunu ölçmek için daha hızlı ve daha basit bir teknik de vardır. Bir CARS lazeri çeşitli frekanslara ayarlanabilir ve lipitleri uyarmak için uygun frekanslara ayarlandığında, miyelin herhangi bir ek etikete ihtiyaç duymadan görüntülenebilir²². Lipid görüntüleme, standart immünohistokimya ile birleştirilebilir, böylece lipitler birkaç floresan kanalı ile birlikte görüntülenebilir²³. CARS ile miyelinasyonun görüntülenmesi, elektron mikroskobundan önemli ölçüde daha hızlıdır ve EM'den daha düşük olsa da, aynı tip aksonlardaki miyelinasyondaki küçük farklılıkları bile tespit etmek için yeterli bir çözünürlüğe sahiptir.

Tüm deneyler yürürlükteki tüm yasalara, Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uymuş ve Colorado Üniversitesi Anschutz Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvanlar

1. Jackson Laboratuvarı'ndan elde edilen C57BL / 6J (stok #000664) farelerini (Mus musculus) veya aslen Charles Nehri'nden elde edilen Moğol gerbillerini (Meriones unguiculatus) kullanın.

2. Doku hazırlığı

1. Transkardiyal perfüzyon için, pentobarbital (120 mg / kg vücut ağırlığı) ile ilgilenen aşırı doz kemirgen türleri ve transkardiyal olarak fosfat tamponlu salin (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na₂HPO4) ile%₄ paraformaldehit (PFA) ²⁴ ile perfüze edilir.
   1. Spesifik olarak, karın ve göğüs kafesini makas kullanarak açın ve kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini Kelly hemostatik forseps ile yerinde tutun.
   2. Sol ventriküle bir perfüzyon pompasına bağlı 23 GA'lık bir iğne yerleştirin ve ince makas kullanarak sağ atriyumu hızla kesin.
   3. Beyni ve vücudu kandan temizlemek için PBS'yi perfüzyon pompası ve kalpteki iğne ile 10 dakika boyunca uygulayın.
   4. Perfüzyon pompasını 10 dakika boyunca% 4 PFA'ya değiştirin ve başarılı perfüzyonu onaylamak için uzuvların ve kuyruğun sertliğini kontrol edin.
2. Perfüzyondan sonra, hayvanların kafasını kesin ve beyinlerini kafatasından çıkarın. PBS'ye geçmeden önce beyinleri gece boyunca% 4 PFA'da tutun. Beyin saplarını% 4 agaroza (PBS'de) gömün ve 200 μm kalınlığında bir vibratom kullanarak koronal olarak dilimleyin.

3. Boyama

1. Nissl için, hücre cisimciklerini görselleştirmek için (1:100), antikor ortamında (AB ortamı: 0,1 M fosfat tamponu (PB: 50 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na₂HPO₄), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, %1 sığır serum albümini (BSA)) standart bir laboratuvar çalkalayıcı²⁵ üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca lekesiz yüzer kesitler.
   1. Alüminyum folyo ve/veya kapak kullanarak bölümleri ışıktan koruyun. 550 nm veya altındaki dalga boyları CARS görüntüleme ile uyumludur (Şekil 1).
      NOT: Triton-X veya diğer reaktiflerin lipitlerin CARS görüntülemesi üzerinde bir etkisi olmasını beklemesek de, spesifik antikor ortamları ile ek kontroller garanti edilebilir.
2. DURAKLATMA NOKTASI: Serbest kayan bölümleri (ışıktan korunurken) görüntülemeye kadar PBS'de saklayın. Bölümlendikten sonra, 2 hafta içinde beyin bölümlerini görüntüleyin.

Şekil 1: CARS görüntüleme immünofloresan görüntüleme ile birleştirilebilir. Grafikler, CARS görüntülemenin 660/640 nm kırmızı sinyal spektrumu^26'da gerçekleştiğini göstermektedir. Bu dalga boyu yeşil, mavi veya UV aralığından yeterince uzaktır ve CARS sinyalinin bu aralıklarda immünofloresan ile kombinasyonuna izin verir. Özellikle, grafik ayrıca, bu yayın için temsili sonuçların toplanması sırasında CARS ile birleştirilen mavi florofor ile etiketlenmiş Nissl için uyarma ve emisyonu da göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Görüntüleme

NOT: CARS lazer kurulumu, 80 MHz saat sağlayan bir fiber lazer ve CARS sinyalini toplamak için gerekli olan 1031 nm'de sabitlenmiş Stokes ışını ile 770-990 nm ayarlanabilir aralıkta bir OPO (Optik Parametrik Osilatör) lazer içerir. Her iki ışın için de bir diyafram açıklığı vardır.

1. Örnekleri mikroskopa getirmeden önce, CARS lazerini en az 1 saat boyunca açın ve ısıtın, CARS lazerini ve Koehler'i kondenser optiklerini ve ileri CARS görüntüleme için mikroskobun diyaframını hizalayın.
   NOT: Bu adım, CARS mikroskopisinin düzgün çalışması için kritik öneme sahiptir.
   1. İki lazer ışınının (pompa ve stoklar) uzamsal hizalaması için, CARS lazer GUI'si aracılığıyla iki dahili PSD'ye (konuma duyarlı dedektörler) erişin.
   2. CARS lazer GUI'sindeki gecikme işlevini kullanarak zamansal hizalama elde edin, bu da farklı dalga boyları nedeniyle farklı dağılımlara sahip iki lazerin (pompa ve stoklar) darbelerinin üst üste binmesine yardımcı olabilir. Bu nedenle, pompa ve stokes kirişlerinin hem zamansal hem de mekansal örtüşmesi, GUI üzerinden kullanıcı girişi ile yapılır.
   3. Uzaysal olarak üst üste binen iki lazeri mikroskobun tarama kafası aynalarına ortalamak için harici periskopu (kurulumun son iki aynası) ayarlayın.
   4. En iyi ileri CARS taramasız algılama için, kondenserin Koehler-ed olduğundan emin olun (kondenserin ortalandığı ve düzgün aydınlatma elde etmek için diyaframa odaklandığı anlamına gelir)
2. İmmünofloresan konfokal görüntüleme ve CARS görüntüleme için, floresan görüntüleme için görünür lazerlerle donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak, CARS lazerini hem ileri hem de epi CARS taranmamış dedektörlerle (NDD'ler) birlikte takın (Şekil 2).
3. Bölümleri kapak kayması (ters mikroskopi için), dokunun kurumasını önlemek için PBS ve dokuyu örtü kaymasının yakınında tutmak için bir cam ağırlığı olan bir kültür kabına yerleştirin.
4. CARS sinyalinin epi yönde toplanmasına ve yamuk cismin medial çekirdeği (MNTB) gibi beyin bölgelerini görüntülemek için ileri yönde 0,55 NA kondenserden toplanmasına hizmet eden 60X, 1,2 NA kızılötesi düzeltilmiş su hedefi ile z-yığınları veya tek görüntüler alın.
   1. CARS lazer GUI'sini kullanarak CARS görüntülerini yaklaşık 600 mW pompa/prob ve 300 mW Stokes'ta alın. Bu lazer güç değerleri sistem tarafından dahili olarak ölçülür. Her iki lazerin de numune konumundaki güçleri 25 mW'tan azdır ve doku numunesi için güvenlidir.
   2. Pompa ve Stokes kirişlerini mekansal ve geçici olarak üst üste bindirin. OPO'yu 797,2 nm olarak ayarlayın. Bu, 650 nm'lik bir CARS dalga boyu verir. Daha yüksek enerji seviyesi nedeniyle, zemin durumuna ortaya çıkan geri dönüş, uyarılmaya karşı anti-Stokes'tur (mavi kaydırılmış).
   3. CARS sinyalini, bandpass filtreleri (640-680 nm) kullanarak epi veya ileri taramasız dedektörlerde yakalayın, ardından immünofloresan etiketinin (bu örnekte floresan olarak etiketlenmiş Nissl) sıralı olarak algılanmasını sağlayın.
      NOT: Nissl nöronal soma işaretleyicisi, CARS 640-680 nm bandpass filtresinde yakalanmamıştır ve aşağıda sunulan görüntülerde floresan ve CARS görüntüleme kombinasyonuna izin vermektedir.
   4. CARS ve floresan PMT'leri paylaşmaz. Bu ayarları, beyin bölgesindeki miyelinasyonu seçici olarak görüntülemek için optimal lipit sinyali için kullanın.
      DİKKAT: Kullanıcıyı lazer ışınından koruyun
5. Görüntüleri, daha fazla niceleme için bir görüntü analiz programına aktarılabilen .oib dosyaları olarak kaydedin (Şekil 3).

Şekil 2: Bir lazer tarama konfokaline dahil edilen CARS lazerlerini (kırmızı oklar) ve taranmamış (NDD) epi ve ileri algılamayı gösteren CARS cihaz diyagramı. İleri NDD'de, 515 nm'de (turuncu ok) C-H bağları (koyu kırmızı oklar) ve SHG (ikinci harmonik genratioin) için CARS satın aldık. Epi NDD'de, C-H bağları (koyu kırmızı oklar) ve 2PE (iki foton emisyonu) otofloresan (açık mavi ok) için CARS satın aldık. Sırasıyla, floresan konfokal görüntüler elde edilebilir (görünür lazer için yeşil oklar, konfokal algılama için mavi oklar). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: CARS, beyin dokusundaki (beyin sapı) miyelini (macenta) aydınlatırken, aynı zamanda Nissl (camgöbeği) veya floresan belirteçleri de görüntüleyebilir. İki panel, Moğol gerbili (tek görüntü M. unguiculatus, Şekil 3A, C, E) ve fare (z-stack max projeksiyonu M. musculus, Şekil 2B, D, F) beyninden temsili sonuçlar göstererek, bu tekniğin türler arasında kullanılabileceğini göstermektedir. Şekil 3A,B, camgöbeğinde Nissl'i gösterir, C,D macentadaki CARS sinyalini gösterir, E,F sırasıyla gerbil veya fare için her panelle Nissl ve CARS sinyallerini birleştirir. Her iki görüntü seti de beyin sapındaki yamuk cismin (MNTB) medial çekirdeğinin bir bölümünü göstermektedir. MNTB'deki nöronlar, bir tür dev sinaps²⁷ olan tutulan kalikste sonlanan ağır miyelinli aksonlardan girdiler alırlar. Ölçek çubuğu 20 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

CARS mikroskopisinin diğer tekniklere göre en büyük avantajlarından biri, floresan görüntüleme23 ile uyumluluğudur. Şekil 1 , spektrumlarda çok az / hiç örtüşme göstermeyen/hiç örtüşme göstermeyen immünofloresan işaretleyici ile etiketlenmiş Nissl ile karşılaştırıldığında CARS spektrumlarını göstermektedir. Şekil 2 , konfokal mikroskopi ile birlikte CARS için kurulan lazeri göstermektedir. Şekil 3 , biri tek bir yığın ve bir z-yığını maksimum projeksiyonu olarak gerbil ve fareden hem hücre gövdelerini (camgöbeği) hem de miyelin sinyalini (macenta) gösteren CARS görüntüleme kullanılarak elde edilebilecek iki temsili görüntüyü göstermektedir.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.