Formalin-Sabit ve Parafin-Gömülü Doku Örneklerinin Kütle Spektrometrisi Görüntülemesini Kullanarak Tümör Mikroçevresinin Kavranmasının Genişletilmesi

Klonal tümör popülasyonlarını çevreleyen çok sayıda hücre tipinin önemi, karsinogenezin kategorizasyonunda çok önemli bir unsurdur. Bu tümör mikroçevre (TME) kompozisyonunu ve etkileşimlerini aydınlatmaya olan ilgi, kanser tedavisi cephaneliğinin bir parçası olarak bağışıklık temelli tedavinin kurulmasını takiben sürekli artmıştır. Bu nedenle, tedavi stratejileri tümör merkezli bir yaklaşımdan TME merkezli bir yaklaşıma kaymıştır¹.

Bağışıklık hücrelerinin tümör sürveyansı ve kanser gelişimindeki rollerini aydınlatma çabaları son yıllarda çarpıcı bir şekilde artmıştır ^2,3. Tıbbi araştırmalarda, sitometri tabanlı yöntemler ve singleplex ve multipleks görüntüleme teknolojileri de dahil olmak üzere çok sayıda yöntem, TME'lerin çoklu elemanlarının benzersiz etkileşimlerini deşifre etme girişiminin bir parçası olarak ortaya çıkmıştır.

Akış sitometrisi (1960'larda icat edildi), floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ve kütle sitometrisi gibi öncü yöntemler esas olarak TME bileşenlerini tanımlamaya ve ölçmeye odaklanmıştır⁴. Sitometriye dayalı kantitatif teknikler immün peyzaj fenotiplemesine izin verse de, hücresel uzamsal dağılımın belirlenmesi imkansızdır. Tersine, standart singleplex immünohistokimyası gibi yöntemler doku mimarisini korur ve araştırmacıların hücresel dağılımı analiz etmelerini sağlar, ancak tek bir doku bölümünde daha az sayıda hedef bu yöntemlerin bir sınırlamasıdır ^5,6. Son birkaç yılda, multipleks immünofloresan, barkodlamalı floresan görüntüleme ve görüntüleme kütle spektrometrisi gibi tek hücreli çözünürlük için çoklanmış görüntüleme teknolojileri, aynı doku bölüm^7'yi kullanarak eşzamanlı belirteç boyama hakkında bilgi edinmek için kapsamlı stratejiler olarak ortaya çıkmıştır.

Burada, metal etiketli antikorları ve ikincil iyon kütle spektrometrisini birleştiren ve tek hücreli çözünürlük ölçümü, işaretleyici ko-ekspresyonu (fenotipleme) ve formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) ve taze dondurulmuş (FF) doku örnekleri ^8,9 kullanılarak mekansal analiz sağlayan bir teknoloji sunuyoruz. FFPE örnekleri, doku arşivleme örnekleri için en yaygın kullanılan malzemelerdir ve çoğaltılmış görüntüleme teknolojileri için taze dondurulmuş örneklerden daha kolay erişilebilir bir kaynağı temsil eder¹⁰. Ek olarak, bu teknoloji aylar sonra görüntüleri yeniden elde etme imkanı sunar. Burada, FFPE doku örneklerini kullanarak boyama ve görüntü işleme protokollerimizi tartışıyoruz.

Doku örnekleri, Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulu'na uygun olarak araştırma amacıyla elde edildi ve örnekler daha da tanımlandı.

1. Antikor seçimi

1. Mevcut en iyi antikor klonlarını seçmek için araştırma sorularını tanımlayın. İnsan Protein Atlası, yayınlanmış araştırma ve antikor üreticisi web sitelerini araştırma kaynakları olarak kullanın.
   NOT: Farklı adımlarda boyanacak yeterli insan doku kontrollerinin ve aynı insan dokusu kontrollerinin seçimi, belirteçlerin doğru yerde, doğru yerde ve doğru hücresel bölmede boyandığından emin olmak için kritik öneme sahiptir. Boyama validasyonu için her zaman normal doku ve neoplastik dokuları içeren küçük bir doku mikrodizisi (TMA) önerilir.
2. Paneli tasarlamak için yalnızca taşıyıcı içermeyen antikorlar kullanın.
   NOT: Ticari taşıyıcısız bir antikor mevcut değilse, taşıyıcısız antikor formülasyonlarının kullanılması gerekir; saflaştırma kitleri, antikoru doğru formülasyona ayarlamak için kullanılabilir. Sığır serum albümini gibi protein katkı maddelerinin konjugasyon kapasitesini azalttığı bilinmektedir.
3. Bir belirtecin ekspresyonunun hücre altı paternini belirlemek için standart kromojenik immünohistokimyayı kullanarak her bir antikoru test edin ve titre edin; membran, sitoplazmik veya nükleer boyama; ve kontrol dokularındaki spesifik hücrelerde ekspresyon.
   NOT: Bununla birlikte, her bir antikor pH 6 sitrat ve pH 9 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) cinsinden test edilmeli ve panelin pH 6 sitrat veya pH 9 EDTA ile lekelenip boyanmayacağı belirlenmelidir. Özellikle bu metodoloji ile çalışırken iyi sinyaller elde etmek için pH 9 EDTA kullanılması önerilir.
4. Pozitif kontrollerdeki ekspresyon paternine göre optimal boyama konsantrasyonunu seçin.
5. Her bir antikoru, immünohistokimyasal belirteç bolluğuna, hücre altı lokalizasyonuna ve diğer hedeflerle hücresel birlikte ekspresyona göre mevcut metal izotoplarından birine atayın.
6. Antikoru karşılık gelen atanmış metal ile sabitleyin ve daha önce kullanılan aynı kontrol dokusundaki ekspresyonla karşılaştırın.
   NOT: Antikor metal konjugasyonu, antikor preparasyonu, redüksiyonu ve ardından konjugasyon ile başlar (Ek Dosya 1). Her metal yüklü polimer tüp, 100 μg bir antikorun etiketlenmesi için yeterlidir.

2. Antikor paneli tasarımı

1. Küçük antikor boyama partileri oluşturun. Bir kokteylde beş adede kadar işaretleyiciyi test edin.
   NOT: İmmünohistokimya kullanılarak gruplar halinde konjuge edilmiş ve analiz edilmiş antikorların test edilmesi, kanal parazitlerinin erken tanımlanmasını kolaylaştırır ve antikorları başka bir metalle yeniden konjuge etme fırsatı sağlar. Ayrıca, yeterli belirteç birlikte ifadesini değerlendirmek için bir fırsat sağlar.
2. Her küçük partiyi dört farklı antikor konsantrasyonuna (0.05 μg / mL, 0.2 μg / mL, 1 μg / mL ve 4.0 μg / mL) sabitleyin.
   NOT: Farklı titreleri karşılaştırarak, minimum arka plan boyaması (en iyi sinyal-gürültü oranı) ile doğru konum ve en yüksek ekspresyonla sonuçlanan antikor konsantrasyonunu tanımlayın.

3. FFPE doku kesitleme

1. Altın kaplı slaytları seçin (bu amaca özel) ve mikrotoma yakın tutun. Tutucuya yeni bir bıçak sokarak mikrotomu hazırlayın. Bölüm kalınlığını 4-5 μm'ye ayarlayın.
2. Bölümlemeden önce FFPE bloklarını buzun üzerine koyun. Damıtılmış suyu veya deiyonize suyu (diH₂O) 40-45 ° C'ye ısıtarak bir doku yüzdürme banyosu hazırlayın.
   NOT: diH₂O veya damıtılmış su kullanmak kontaminasyon olasılığını azaltır.
3. Bölümlemeye başlayın. Doku bölümünü cımbız kullanarak suya yerleştirin ve düzleşmesine izin verin. Doku kesitlerini sudan çıkarmak için slaytları kullanın.
4. Slaytları bir sürgü rafına yerleştirin ve gece boyunca oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.

4. FFPE antikor boyama

NOT: Boyama işlemi iki ayrı günde gerçekleşir.

DİKKAT: Bu protokolde kullanılan çözeltiler potansiyel olarak aşındırıcıdır ve cilt ve gözler için tehlikeleri temsil eder. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu göz ve yüz ekipmanı giyilmesi tavsiye edilir ve kurumumuzun biyogüvenlik politikasının bir parçasıdır.

1. Reaktif hazırlama (1. gün)
   1. 1 L TBS-T yapmak için 50 mL 20x Tris tamponlu salini Tween (TBS-T) ile 950 mL diH₂O içine seyreltin.
   2. 1x ısıya bağlı epitop geri kazanımı (HIER) çözeltisi yapmak için 8 mL 10x Tris-etilendiamintetraasetik asidi (EDTA)₇₂mL diH 2 O içine seyreltin.
   3. Bloke edici tampon oluşturmak için eşek serumunu 1x TBS-T'de% 5'lik son konsantrasyona kadar seyreltin. Çözeltiyi kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
2. HIER hazırlığı: Ön işlem (PT) modülü
   DİKKAT: PT modülünde kullanılan herhangi bir reaktifi veya herhangi bir reaktife batırılmış parçaları tutarken kimyasal koruyucu eldiven giyin.
   1. 1.4 L 1x PBS yapmak için 140 mL 10x fosfat tamponlu salin (PBS)_1.260mL diH 2 O içine seyreltin. Alternatif olarak, yedi PBS tabletini 1.4 L diH₂O olarak seyreltin.
   2. Bir tankı 1,4 L PBS ile doldurun ve hazırlanan sürgülü hazneli kabı 100 mL 1x HIER çözeltisi ile tankın içine yerleştirin.
   3. Tankı bir PT modülünde 75 ° C'ye kadar önceden ısıtın.
3. Aşırı parafin çıkarılması
   1. 70 °C'de kızakları fırında en az 20 dakika pişirin.
      NOT: Bazı mendiller veya bölümler daha uzun pişirme sürelerine ihtiyaç duyabilir. Beyin dokusu veya TMA için önerilen pişirme süresi 1 saattir. Bu, 16 saate (gecelik) veya laboratuvar deneyimine göre uzatılabilir.
   2. Pişmiş slaytları bir slayt tutucuya yerleştirin ve aşağıdaki yıkama adımlarını bir duman başlığının altındaki bir çalkalayıcıda gerçekleştirin. Kızakları aşağıdaki solüsyonda yıkayın: 30 s için ksilen 2x (metalsiz), 30 s için %100 alkol 2x (metalsiz), 30 s için %95 alkol 2x (metalsiz), 30 s için %80 alkol (metalsiz), 30 s için %70 alkol (metalsiz) ve 30 s için diH₂O 2x (metalsiz).
   3. Slaytları antijen alımına hazır olana kadar taze bir diH₂O kabında saklayın.
      NOT: Slaytlar işlemin sonuna kadar kurutulmamalıdır.
4. Antijen alımı
   1. Slaytları, PT modülünün içinde 1x HIER tamponu içeren önceden ısıtılmış bir slayt odasına yerleştirin. Kapağı tankın üzerine yerleştirin. Kapağı kapatın ve mandallayın.
   2. Ana menüyü açmak için PT modülündeki Menü düğmesine basın ve özel bir program oluşturmak için Kurulum döngüsü (zaman ve sıcaklık) düğmesine basın.
   3. PT modülünü 97 °C'de 40 dakika çalıştırın. Daha sonra, PT modülü otomatik olarak 65 ° C'ye soğur.
   4. 65 °C sıcaklığa ulaşıldığında kızakları PT modülünden çıkarın. Slaytları 30 dakika oda sıcaklığında tutun.
      NOT: PT modülü, sıcaklık 65 °C'ye soğuyana kadar açılmaz. Bu işlem sırasında slaytların altın yüzeyine dokunmayın ve daima eldiven kullanın.
5. Antikor bloke edici
   1. Bir çalkalayıcıyı 70 rpm'ye ayarlayın.
   2. Slaytları 5 dakika 2x için 1x TBS-T'ye batırarak yıkayın.
   3. Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak, doku bölümünün etrafına slayt kenarlarından en az 1 mm uzakta bir sınır çizin ve 15-30 s kurumasını bekleyin.
      NOT: Lekelenmeye herhangi bir doku müdahalesini önlemek için kalem sıvısının doku bölümüne temas etmesini önlemeye özen gösterin. Olası sızıntıları önlemek için bariyeri çizerken kaleme çok sert bastırmayın. Optimum boyama ve görüntü elde etme sonuçları için, doku kesitleri altın kaplı slaytların ortasına, dokuya veya kızağın dış kenarına yerleştirilen kılavuz noktalara dokunmadan bariyeri çizmek için yeterli alan sağlamak üzere 15 mm x 30 mm'den büyük olmayan bir çerçeveye yerleştirilir.
   4. Kalem kalıntılarını gidermek için slaytları TBS-T'ye batırın.
   5. Oda sıcaklığında bir nem odasında, doku bölümünü 20 dakika boyunca 100-200 μL bloke edici tampon ile inkübe edin. Bir antikor ana karışımı hazır olana kadar dokuyu bloke edici tamponda inkübe etmeye bırakın.
6. Antikor paneli hazırlama
   NOT: Antikor paneli kokteylinin son hacmi, tahmini doku kesiti yüzey alanına göre değişir. 20 mm x 20 mm'lik bir alanı kaplamak için, kokteylin 100-200 μL'sini hazırlayın.
   Metal izotop konjuge antikorlardan oluşan bir antikor paneli kokteyli hazırlamak için aşağıdakileri yapın:
   1. Kokteylin, bloke edici tampon hacmine eklenen antikor kokteyli hacmine eşit olan son hacmini onaylayın.
   2. Proje için bir panel elektronik tablosundaki tüm antikorların, seyreltmelerin ve/veya antikor konsantrasyonlarının özelliklerini onaylayın.
   3. Tüm antikor içeren tüpleri 5 dakika boyunca 10.000 x g'de döndürün. Bloke edici tampona bireysel antikorlar ekleyin ve çok iyi karıştırın. Pipetleme yaparken antikor tüpünün tabanını rahatsız etmeyin.
   4. Antikor panelini, 0,1 μm'lik bir santrifüj filtre cihazını 100 μL bloke tamponu ile önceden ıslatarak filtreleyin. Filtreyi 2 dakika boyunca 10.000 x g'de döndürün ve engelleyici tampon akışını bir pipetle çıkarın.
   5. Antikor panelini bir spin kolonuna aktarın ve filtreyi 2 dakika boyunca 10.000 x g'de döndürün. Döndürme kolonunu atın ve filtrelenmiş antikor paneli olarak akış akışını kullanın.
      NOT: Metal değişimini önlemek için kokteyli yaptıktan hemen sonra boyama işlemini gerçekleştirin. Antikor kokteylinin uzun süre saklanması gerekiyorsa, liyofilizasyona tabi tutulabilir.
7. Antikor boyama
   1. Her bir slaytı kendi tarafına devrerek ve kenarları bir görev sileceğine hafifçe vurarak engelleme arabelleğini slaytlardan dikkatlice çıkarın.
   2. Slaytları bir nem odasına yerleştirin ve dokuya 100-200 μL antikor ana karışımı ekleyin (doku ile temastan ve hava kabarcıklarının oluşmasından kaçının).
   3. Boyama partisine pozitif ve negatif kontrol slaytları ekleyin.
   4. Slaytları gece boyunca 4 ° C'de (14-16 saat) inkübe edin.
8. Reaktif hazırlama (2. gün)
   1. 1x PBS yapmak için 100 mL 10x düşük baryum PBS, pH 7.4, 900 mL diH₂O içinde seyreltin.
   2. Düşük baryum PBS'de (340 mL düşük baryum PBS + 10 mL% 70 glutaraldehit) 350 mL% 2 glutaraldehit çalışan bir stok çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Seyreltmeyi bir kaputun altında gerçekleştirin. Glutaraldehit çok viskoz bir sıvıdır. 1 mL'lik bir pipet kullanın ve tüpten dökülecek kadar sıvı hale gelene kadar glutaraldehit tüpüne her seferinde 1 mL düşük baryum PBS ekleyin.
   3. 1x Tris yapmak için 10x Tris, pH 8.5, 900 mL diH₂0'da seyreltin.
9. Fiksasyon ve dehidrasyon
   1. Slaytı yan tarafına eğerek ve kenarını bir görev sileceğine hafifçe vurarak her slayttan ana antikor karışımını çıkarın.
   2. Slaytları aşağıdaki tamponlarda hafif ila orta derecede ajitasyonla yıkayın: 1x TBS-T, her biri 5 dakika boyunca 3x kez (metalsiz); 5 dakika boyunca% 2 glutaraldehit filtrelenmiş; filtrelenmiş 1x tris, pH 8.5, 30 s için 3x; 30 s için filtrelenmiş_{diH 2}O 2x; 30 s için% 70 alkol (metal içermez); 30 s için% 80 alkol (metal içermez); 30 s için% 95 alkol (metalsiz); ve 30 s için% 100 alkol (metal içermez).
   3. Fazla alkolü gidermek ve artık alkolün oda sıcaklığında (~5-10 dakika) buharlaşmasına izin vermek için her kızağın kenarını bir görev sileceğine hafifçe dokunun.
   4. Görüntü yakalamadan önce kızakları kurutucuda en az 1 saat kurutun veya uzun süreli depolama için slaytları vakum odasında tutun.

5. Görüntü alma

1. Slayt kurulumu
   NOT: Cihazı kullanarak taramadan önce, slaytlar aşağıda açıklanan adımlar izlenerek web tabanlı görüntü yönetimi uygulaması kullanılarak tanımlanmalı ve ayarlanmalıdır.
   1. Web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasındaki slayt sayfasında, Yeni Slayt Erişimi'ni tıklatın ve istediğiniz ayrıntıları (ad, slayt tanımlama, konum ve açıklama) girin.
   2. Bölüm Ekle'yi tıklatarak tarama bölümleri oluşturun. Her bölümün bilgilerini doldurun (projenin adı, slayt adı, blok ve konum). Oluşturulan yeni slaytları/bölümleri kaydetmek için Gönder'i tıklatın.
   3. Kaynaklar sekmesinin altında, paneller sayfasını açın ve kullanılacak paneli seçin. Yeni paneller için Yeni Panel Oluştur'u tıklatın.
   4. Paneli seçtikten sonra, Bölümler'e tıklayın. 2. adımda oluşturulan bölümleri ekleyin. Bölüm Atamasını Düzenle'ye tıklayarak. Gönder'i tıklayarak kaydedin.
2. Cihaz kurulumu
   NOT: Bu cihaz (bakınız Malzeme Tablosu) belirli bir kontrol yazılımı programı kullanılarak çalıştırılır (bkz.
   1. Kontrol yazılımında oturum açın. Cihaz uyku modundaysa Uyandır'ı tıklatın.
      NOT: İşlemden en az 1 saat önce, cihazın ısıtılması önerilir, bu da ışın odağının dengelenmesine yardımcı olur.
   2. Bir slayt yüklemek için, Exchange Örneği'ne tıklayın ve ardından kapıyı açmak için Devam'a tıklayın. Slaytı, numune yukarı bakacak ve etiket sağda olacak şekilde yükleme yuvasına yerleştirin. Kapıyı kapatmak için Devam'ı tıklatın.
      NOT: Slayt doğru yüklenmezse, slaytı ayarlamak için bir uyarı sesi ve bildirim görüntülenir.
   3. Projeyi seçin ve ardından yüklenen örnek için slayt adını seçin.
   4. Slayt optik görüntü bölmesindeki panoramik görüntüyü görselleştirin.
3. Görüş alanı (FOV) seçimi ve edinimi
   1. Mod menüsüne tıklayın ve SED (İkincil Elektron Dedektörü) öğesini seçin. Görüntüleme modu menüsüne tıklayın ve QC −300 μm'yi seçin.
   2. FOV konumunu kontrol etmek için Jog Stage'e tıklayın ve ardından FOV'un konumunu seçmek ve gezinmek için oklara tıklayın.
   3. FOV Ekle'yi tıklatın, alan boyutu olarak 400 μm x 400 μm olarak ayarlayın ve görüntüleme modu ve 1 ms bekleme süresi olarak iyi seçeneğini belirleyin. Onayla'yı tıklayın.
      NOT: Ayarlanan bekleme süresi, istenen çözünürlüğe bağlı olacaktır. Çözünürlük arttıkça bekleme süresi de artar. Satın alma süresi, dedektörün kırılma süresi ve çalışma süresi dahil olmak üzere birçok faktöre bağlı olarak değişebilir. Bir FOV için ortalama edinme süremiz yaklaşık 17 dakikadır. Cihazı 8 saate kadar kesintisiz kullanın, bu da yaklaşık 28 FOV'un taranmasını sağlar. Elde edilen görüntülerin kalitesi, art arda birçok saatlik kullanımdan sonra düşer.
   4. Bir FOV listesi oluşturduktan sonra, görüntü odağına geçin ve ışını görüntülenmeyecek bir doku bölgesine taşıyarak damgalamayı ayarlayın. Net bir merkezi görüntü elde edilene kadar parametreleri ayarlayın.
      NOT: Görüntü yakalamayı optimize etmek için, doku bölümünü slaytta merkezi tutmak idealdir. Netleme sırasında sadece merkezi alanın net bir görüntüsü elde edilebiliyor. Doku bölümü çok büyükse, kenarlar odak dışı kalır ve görüntü bulanıklaşır.
   5. Start Run'a (Çalıştırmayı Başlat) tıklayın. Elde edilen görüntüler otomatik olarak yüklenecek ve web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasında saklanacaktır.

6. Görüntü hazırlama

1. Görüntü izobarik düzeltme
   NOT: İzobarik düzeltmenin amacı, kütle analizörü kullanılarak kütle farklılıkları tespit edilemeyen eşit veya çok benzer kütleli izotopların varlığından kaynaklanan kanallar arasındaki yayılma sinyalini ortadan kaldırmaktır.
   1. Web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasında, FOV'ları (TIFF görüntüleri) kaydetmek için yeşil İndir simgesine tıklayın.
   2. Web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasındaki hakkında sekmesinde bulunan görüntü işleme yazılımının en güncel sürümünü (bkz. Malzeme Tablosu) indirin ve bir dosyaya kaydedin. .zip arşiv dosyasını açın ve yükleme adımlarını izleyin. Yükleme tamamlandıktan sonra yazılımı açın.
   3. Görüntü işleme yazılımının giriş bölmesindeki Dosya simgesine tıklayarak düzeltilecek görüntüleri içeren klasörü seçin. Bir FOV listesi yüklenecektir.
   4. Varsayılan düzeltmeleri uygulamak için giriş bölmesindeki Filtre simgesine tıklayın. Her kanal için, ekranın sağ tarafında düzeltmeden önce ve sonra elde edilen görüntüleri görselleştirin.
   5. Düzeltilen görüntüyü kaydetmek için çıktı bölmesindeki Disket simgesine tıklayın.
2. Görüntü filtreleme: Voronoi mozaikleme
   NOT: Voronoi mozaikleme diyagramları, Voronoi hücrelerine tohum noktaları içeren bir alan bölümünü gösterir. Amaç, hücre yoğunluğunu tahmin etmek ve hücre sınırlarını tanımlamaktır. Voronoi mozaikleme hesaplaması kullanılarak, bir maske oluşturulur ve filtreleme için orijinal görüntüye uygulanır.
   1. Filtreleme sekmesine tıklayın ve filtreleme parametreleri menüsünden Voronoi Tesselation'ı seçin.
   2. Giriş bölmesinde, MassCorrected.tiff görüntüsünü seçin. Giriş bölmesindeki Filtre simgesine tıklayın.
   3. Filtre uygulanmış görüntüyü kaydetmek için çıktı bölmesindeki Disket simgesine tıklayın. Elde edilen iki dosya -Filtered.tiff ve -Filtered.json soneklerine sahip olacaktır.
      NOT: MassCorrected-Filtered.tiff adlı görüntü daha sonra üçüncü taraf bir dijital analiz yazılımı programına veya açık kaynaklı yazılım programına yüklenebilir.

Tonsil ve akciğer adenokarsinomu TMA doku kesitleri (5 mm kalınlığında) elde edildi ve slaytların doku büyüklüğü ve güvenli kenar boşlukları ile ilgili spesifikasyonlara göre altın kaplı slaytların ortasına yerleştirildi. Optimum boyama için sırasıyla dokunun kenarı ile cam kızakların yanal ve alt kenarlıkları arasında 5 mm ve 10 mm'lik serbest cam kenar boşlukları gereklidir. Doku kesitleri, bölümün slayda uygun şekilde yapışmasını sağlamak için boyamadan önce bir fırında gece boyunca pişirildi. Antikor paneli 23 belirteçten oluşuyordu. Aynı boyama partisinde, akciğer adenokarsinom örneklerinde yetersiz olarak eksprese edilen belirteçlerin ekspresyonunu değerlendirmek için bir bademcik sürgüsü ve birden fazla doku içeren bir TMA slaytı dahil edildi (Şekil 1). Panellerde kullanılan antikorların hedeflerine göre pozitif kontrollerin seçilmesi gerekir; örneğin, SOX10 ekspresyonunu değerlendirmek için melanom örneklerine ihtiyaç vardır ve GAFP ekspresyonunu değerlendirmek için glioblastoma örneklerine ihtiyaç vardır (Şekil 2).

Resim 1: İzotopik saflık ve kanal çapraz konuşma. Matris, prob saflığından ve oksitlerden (mavi kutular,% 0,5 ≥ temizlenmiş kutular,% 0,5) türetilen çapraz konuşma yüzdesini gösterir <% 0,5). Toplu etiketler için, hiçbir kanala (yeşil), bir veya iki kanala (sarı) veya ikiden fazla kanala (turuncu) en az %0,5 çapraz konuşmaya katkıda bulunan problar gösterilir. Hiçbir probdan (yeşil), bir veya iki probdan (sarı) veya ikiden fazla probdan (turuncu) en az% 0.5 çapraz konuşma alan kütle kanalları da gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Farklı dokularda temsili boyama görüntüleri . (A) Akciğer adenokarsinomu. (B) Neoplastik olmayan böbrek. (C) Bademcik. CD20 sarı, Ki67 macenta, CD3 beyaz, CD11c yeşil, CD68 kırmızı, sitokeratin camgöbeği ve çift sarmallı DNA (dsDNA) mavi renkte gösterilir. Büyütme, 200x. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu boyama prosedürü standart immünohistokimyasal boyamaya çok benzer ve art arda iki günde meydana gelir. Boyama protokolünün beş ana basamağı 1) fazla parafin çıkarılması, 2) antijen geri kazanımı, 3) antikor blokajı, 4) antikor boyama ve 5) fiksasyon ve dehidratasyondur (Şekil 3). Boyama prosedüründeki temel bir adım, plastik eşyalarda depolanan metal içermeyen reaktiflerin kullanılması ve mekanik hasarı sınırlamak için numunelerin dikkatli bir şekilde kullanılması da dahil olmak üzere numunelerin metal kontaminasyonunu önlemek için önlemler almaktır. Antikor kokteylinin boyamadan hemen önce hazırlanması önerilir. Bu, metal değişimini azaltır. Boyama tamamlandıktan sonra, slaytları sakladık ve ertesi gün taradık. Görüntü almadan önce, gerekli bir adım, web tabanlı bir görüntü yönetimi uygulaması kullanılarak slayt kurulumudur (Şekil 4).

Şekil 3: Resim alma iş akışı ve ilişkili slayt. (A) Resim alma iş akışı özeti. 1) Metal konjuge antikorlarla boyanmış bir FFPE doku kesiti, birincil iyon tabancası kullanılarak rasterleştirilir ve ikincil iyonlar serbest bırakılır. 2) Bir uçuş zamanı kütle spektrometresi, iyonları piksel seviyesindeki kütlelerine göre ayırır ve ölçer. 3) İkincil iyonların piksel tabanlı nicelleştirilmesi. Y ekseni, tespit edilen iyon sayısına (tepe) karşılık gelir ve x ekseni her metalin kütlesine karşılık gelir. 4) Her kütle spektrumunun zirvesine dayanarak, çok boyutlu görüntüler yeniden oluşturulur. (B) Bu yordamda kullanılan slaytın şeması. Optimum boyama dokusu için, kesit kızağın yanal kenarından en az 5 mm ve alt kenarından 10 mm uzağa yerleştirilmelidir. Hidrofobik bariyeri doku bölümünün etrafına çizerken, kızağın kenarından en az 1 mm uzakta dikdörtgenin içinde tutulmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasında slayt kurulumu. Slayt taramadan önce, her slaytın ayarlanması gerekir. Slayt tanımlamaya yardımcı olabilecek istediğiniz ayrıntıları girin. Blok ve konum bilgilerini eklemek için Bölüm Ekle'ye (siyah ok) tıklayın. Kaydetmek için Gönder'i (kırmızı ok) tıklatın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tarama gününde, kontrol yazılımını kullanarak satın alma cihazını açın. Exchange Slide'a tıklamak, bir slaytın yüklenmesine izin vererek cihazın kapısını açtı. Slaytı yükleme yuvasına sağ taraftaki etiketle yukarı bakacak şekilde konumlandırdık. Aynı anda yalnızca bir slayt taranabilir. Bir sonraki adım, FOV'ları seçmek ve protokolde açıklanan adımları izleyerek odağı ve damgalamayı ayarlamaktı. Çalıştırmayı Başlat'a tıklayarak görüntüleri elde ettik. Edinme süresi, istenen FOV boyutuna ve çözünürlüğüne bağlı olarak değişir. FOV boyutu 200 μm x 200 μm ila 800 μm x 800 μm arasında değişir, bu da 128 piksel x 128 piksel ila 2048 piksel x 2048 piksel çerçeve boyutu aralığına karşılık gelir. Üç standart çözünürlük mevcuttur: kaba, ince ve süper ince. Daha büyük FOV'ların süper ince çözünürlükte taranması zaman alıcıdır ve bir FOV için son edinme süresi 25 s ile 4,7 saat arasında değişmektedir (Şekil 5).

Şekil 5: Kontrol yazılımını kullanarak görüntü toplama. Edinme ayarları istenildiği gibi ayarlanabilir. Tarama çözünürlüğünü değiştirmek için, Görüntüleme Modu'na (siyah ok) göre açılır menüye tıklayın. FOV boyutunu değiştirmek için FOV Boyutu (μm) alanına (kırmızı ok) bir sayı girin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tarama tamamlandıktan sonra, tüm FOV'ları içeren bir görüntü seti otomatik olarak web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasına yüklendi. Görüntülerin depolanmasının yanı sıra, bu uygulama tüm kanalların birlikte veya ayrı ayrı görselleştirilmesini, görüntü ayarlamalarını ve daha fazla hazırlık için görüntülerin indirilmesini sağlar. Standart görselleştirilmiş görüntü bir TIFF dosyası olarak kaydedilir (Şekil 6).

Şekil 6: Web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasını kullanarak görüntü görselleştirme. Elde edilen görüntüler çevrimiçi platform kullanılarak saklanır ve görselleştirilir. Görselleştirme parametrelerini ayarlamak ve her işaretçinin rengini değiştirmek mümkündür. Diğer işaretçileri görselleştirmek için Görüntü kanalı ekle'ye (beyaz ok) tıklayın. Büyütme, 200x. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Metal parazitleri, bunları en aza indirgemek için stratejilerin kullanılmasına rağmen, metal etiketleme yöntemlerinin doğasında vardır. Antikorlara konjuge edilmiş metal izotopundan gelen fazla arka plan sinyallerini gidermek ve analiz için görüntüler hazırlamak için, ilgili görüntü işleme yazılımını kullandık (bkz. Görüntü hazırlama prosedürünün iki adımı vardır: 1) kanallar arasındaki sinyalleri kaldıran izobarik düzeltme ve 2) görüntüdeki agregaların neden olduğu sinyalleri kaldıran filtreleme.

İzobarik düzeltmeyi başlatmak için, kaydedilen TIFF görüntüsünü içeren dosya, giriş bölmesinin Dosya simgesine tıklanarak seçilmiştir. Yazılım, arşivlenmiş tüm TIFF görüntülerini dosyada otomatik olarak yükleyerek toplu analize izin verir. Ardından, giriş bölmesinin Filtre simgesine tıklayarak görüntüyü düzelttik. -MassCorrected sonekiyle elde edilen iki dosya otomatik olarak oluşturuldu: biri TIFF biçiminde, diğeri JSON biçiminde arşivlendi. Varsayılan olarak, elde edilen arşivler ilk görüntünün yüklendiği dosyaya kaydedilmiştir (Şekil 7).

Şekil 7: Görüntü hazırlama: düzeltme adımı. Görüntü işleme yazılımında hazırlanmak üzere bir görüntü yüklemek için, giriş bölmesindeki Dosya simgesine (siyah ok) tıklayın ve görüntüyü seçin. Varsayılan düzeltme prosedürünü uygulamak için, giriş bölmesindeki Filtre simgesine tıklayın (kırmızı ok). Güncellenmiş, düzeltilmiş görüntüyü kaydetmek için, çıktı bölmesindeki Disket simgesine tıklayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Görüntü hazırlamanın ikinci adımı, yazılımdaki üst sekmede seçilebilen filtrelemedir. Giriş bölmesinde düzeltilmiş görüntüyü seçtik. Bu adımda, filtreleme parametresi olarak otomatik Voronoi mozaiklemesi kullanılmıştır. Giriş panelindeki filtre simgesine tıklandığında, seçilen filtre otomatik olarak tüm kanallara uygulanır. Her iki görüntü hazırlama adımında da (düzeltme ve filtreleme), her kanalın işlem öncesi ve sonrası görüntüleri ve sinyal farklılıkları ekranın sağ tarafında görüntülenir.

İzobarik düzeltme adımına benzer şekilde, biri TIFF diğeri JSON biçiminde olmak üzere iki yeni arşiv oluşturuldu. Bu adımda, dosya adını izleyen son ek -Filtered idi. Bu nedenle, elde edilen son görüntü MassCorrected-Filtered.tiff olarak adlandırıldı. Bu adımları tamamlayarak tercih edilen dijital patoloji yazılımını kullanarak analiz için görüntü hazırladık (Şekil 8 ve Şekil 9). Bu tekniği kullanarak, antikor panelindeki 23 belirtecin tümünü, tek bir doku kesitinde hücre altı düzeyde kanallar arasında minimum girişimle analiz edebildik.

Şekil 8: Görüntü hazırlama: filtreleme adımı. Görüntü işleme yazılımındaki üst sekmede (siyah ok) Filtreleme'yi seçin. Filtreleme Parametreleri altında, istediğiniz yöntemi seçin (yeşil ok). Giriş bölmesinde MassCorrected image'ı (Kütle Düzeltilmiş görüntü) seçin. Seçilen yordamı görüntüye uygulamak için, giriş bölmesindeki Filtre simgesine (kırmızı ok) tıklayın. Güncelleştirilmiş filtre uygulanmış görüntüyü kaydetmek için, çıktı bölmesindeki Disket simgesine tıklayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Görüntü hazırlamadan önce ve sonra boyanmanın temsili görüntüleri. (A) Bu teknik kullanılarak boyanmış ve filtreleme ve düzeltmeden önce üçüncü taraf bir dijital görüntü analiz yazılımı programı kullanılarak görselleştirilmiş bir bademcik dokusu kesitinin görüntüsü. (B) Filtreleme ve düzeltme adımlarından sonra aynı koşullar altında aynı bölümün görüntüsü. CD20 sarı, Ki67 macenta, CD3 beyaz, CD11c yeşil, sitokeratin camgöbeği ve çift sarmallı DNA (dsDNA) mavi renkte gösterilir. Büyütme, 200x. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Antikor paneli listesi. Her antikor, listelendiği gibi farklı bir kütleye sahip belirli bir metal izotopuna konjuge edildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çatışması yoktur.