Method Article

Formalin-Sabit ve Parafin-Gömülü Doku Örneklerinin Kütle Spektrometrisi Görüntülemesini Kullanarak Tümör Mikroçevresinin Kavranmasının Genişletilmesi

DOI:

10.3791/64015

⸱

June 29th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Translational Molecular Pathology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser immünoterapisi çağında, tümör mikroçevre dinamiklerini aydınlatmaya olan ilgi çarpıcı bir şekilde artmıştır. Bu protokol, boyama ve görüntüleme adımlarıyla ilgili olarak kütle spektrometresi görüntüleme tekniğini detaylandırır ve bu da oldukça çoklanmış mekansal analize izin verir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağışıklık temelli tedavilerdeki ilerlemeler, kanser tedavisi ve araştırmalarında devrim yaratmıştır. Bu, tümör bağışıklık manzarasının karakterizasyonu için artan talebi tetiklemiştir. Standart immünohistokimya doku mimarisini incelemek için uygun olmasına rağmen, az sayıda belirtecin analizi ile sınırlıdır. Tersine, akış sitometrisi gibi teknikler, doku morfolojisi hakkında bilgi kaybolmasına rağmen, aynı anda birden fazla belirteci değerlendirebilir. Son yıllarda, fenotipik ve mekansal analizi bütünleştiren çoklanmış stratejiler, tümör immün manzarasının karakterizasyonuna kapsamlı yaklaşımlar olarak ortaya çıkmıştır. Burada, metal etiketli antikorları ve ikincil iyon kütle spektrometresini birleştiren, tahlil geliştirme ve optimizasyonu, doku hazırlama ve görüntü toplama ve işlemedeki teknik adımlara odaklanan yenilikçi bir teknolojiyi tartışıyoruz. Boyama işleminden önce, metal etiketli bir antikor paneli geliştirilmeli ve optimize edilmelidir. Bu hi-plex görüntü sistemi, tek bir doku bölümünde 40 adede kadar metal etiketli antikoru destekler. Not olarak, sinyal paraziti riski, panele dahil edilen işaretleyicilerin sayısıyla birlikte artar. Panel tasarımından sonra, bu paraziti en aza indirmek için antikora metal izotop atanmasına özellikle dikkat edilmelidir. Ön panel testi, küçük bir antikor alt kümesi kullanılarak ve ardından tüm panelin kontrol dokularında test edilmesi kullanılarak gerçekleştirilir. Formalin sabit, parafin gömülü doku kesitleri elde edilir ve altın kaplı slaytlara monte edilir ve daha fazla boyanır. Boyama 2 gün sürer ve standart immünohistokimyasal boyamaya çok benzer. Numuneler lekelendikten sonra, görüntü alma cihazına yerleştirilir. Görünüm alanları seçilir ve görüntüler alınır, karşıya yüklenir ve depolanır. Son aşama, sistemin görüntü işleme yazılımını kullanarak parazitin filtrelenmesi ve giderilmesi için görüntü hazırlamadır. Bu platformun bir dezavantajı, analitik yazılım eksikliğidir. Bununla birlikte, üretilen görüntüler farklı hesaplamalı patoloji yazılımları tarafından desteklenmektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonal tümör popülasyonlarını çevreleyen çok sayıda hücre tipinin önemi, karsinogenezin kategorizasyonunda çok önemli bir unsurdur. Bu tümör mikroçevre (TME) kompozisyonunu ve etkileşimlerini aydınlatmaya olan ilgi, kanser tedavisi cephaneliğinin bir parçası olarak bağışıklık temelli tedavinin kurulmasını takiben sürekli artmıştır. Bu nedenle, tedavi stratejileri tümör merkezli bir yaklaşımdan TME merkezli bir yaklaşıma kaymıştır1.

Bağışıklık hücrelerinin tümör sürveyansı ve kanser gelişimindeki rollerini aydınlatma çabaları son yıllarda çarpıcı bir şekilde artmıştır 2,3. Tıbbi araştırmalarda, sitometri tabanlı yöntemler ve singleplex ve multipleks görüntüleme teknolojileri de dahil olmak üzere çok sayıda yöntem, TME'lerin çoklu elemanlarının benzersiz etkileşimlerini deşifre etme girişiminin bir parçası olarak ortaya çıkmıştır.

Akış sitometrisi (1960'larda icat edildi), floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ve kütle sitometrisi gibi öncü yöntemler esas olarak TME bileşenlerini tanımlamaya ve ölçmeye odaklanmıştır4. Sitometriye dayalı kantitatif teknikler immün peyzaj fenotiplemesine izin verse de, hücresel uzamsal dağılımın belirlenmesi imkansızdır. Tersine, standart singleplex immünohistokimyası gibi yöntemler doku mimarisini korur ve araştırmacıların hücresel dağılımı analiz etmelerini sağlar, ancak tek bir doku bölümünde daha az sayıda hedef bu yöntemlerin bir sınırlamasıdır 5,6. Son birkaç yılda, multipleks immünofloresan, barkodlamalı floresan görüntüleme ve görüntüleme kütle spektrometrisi gibi tek hücreli çözünürlük için çoklanmış görüntüleme teknolojileri, aynı doku bölüm7'yi kullanarak eşzamanlı belirteç boyama hakkında bilgi edinmek için kapsamlı stratejiler olarak ortaya çıkmıştır.

Burada, metal etiketli antikorları ve ikincil iyon kütle spektrometrisini birleştiren ve tek hücreli çözünürlük ölçümü, işaretleyici ko-ekspresyonu (fenotipleme) ve formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) ve taze dondurulmuş (FF) doku örnekleri 8,9 kullanılarak mekansal analiz sağlayan bir teknoloji sunuyoruz. FFPE örnekleri, doku arşivleme örnekleri için en yaygın kullanılan malzemelerdir ve çoğaltılmış görüntüleme teknolojileri için taze dondurulmuş örneklerden daha kolay erişilebilir bir kaynağı temsil eder10. Ek olarak, bu teknoloji aylar sonra görüntüleri yeniden elde etme imkanı sunar. Burada, FFPE doku örneklerini kullanarak boyama ve görüntü işleme protokollerimizi tartışıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku örnekleri, Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulu'na uygun olarak araştırma amacıyla elde edildi ve örnekler daha da tanımlandı.

1. Antikor seçimi

  1. Mevcut en iyi antikor klonlarını seçmek için araştırma sorularını tanımlayın. İnsan Protein Atlası, yayınlanmış araştırma ve antikor üreticisi web sitelerini araştırma kaynakları olarak kullanın.
    NOT: Farklı adımlarda boyanacak yeterli insan doku kontrollerinin ve aynı insan dokusu kontrollerinin seçimi, belirteçlerin doğru yerde, doğru yerde ve doğru hücresel bölmede boyandığından emin olmak için kritik öneme sahiptir. Boyama validasyonu için her zaman normal doku ve neoplastik dokuları içeren küçük bir doku mikrodizisi (TMA) önerilir.
  2. Paneli tasarlamak için yalnızca taşıyıcı içermeyen antikorlar kullanın.
    NOT: Ticari taşıyıcısız bir antikor mevcut değilse, taşıyıcısız antikor formülasyonlarının kullanılması gerekir; saflaştırma kitleri, antikoru doğru formülasyona ayarlamak için kullanılabilir. Sığır serum albümini gibi protein katkı maddelerinin konjugasyon kapasitesini azalttığı bilinmektedir.
  3. Bir belirtecin ekspresyonunun hücre altı paternini belirlemek için standart kromojenik immünohistokimyayı kullanarak her bir antikoru test edin ve titre edin; membran, sitoplazmik veya nükleer boyama; ve kontrol dokularındaki spesifik hücrelerde ekspresyon.
    NOT: Bununla birlikte, her bir antikor pH 6 sitrat ve pH 9 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) cinsinden test edilmeli ve panelin pH 6 sitrat veya pH 9 EDTA ile lekelenip boyanmayacağı belirlenmelidir. Özellikle bu metodoloji ile çalışırken iyi sinyaller elde etmek için pH 9 EDTA kullanılması önerilir.
  4. Pozitif kontrollerdeki ekspresyon paternine göre optimal boyama konsantrasyonunu seçin.
  5. Her bir antikoru, immünohistokimyasal belirteç bolluğuna, hücre altı lokalizasyonuna ve diğer hedeflerle hücresel birlikte ekspresyona göre mevcut metal izotoplarından birine atayın.
  6. Antikoru karşılık gelen atanmış metal ile sabitleyin ve daha önce kullanılan aynı kontrol dokusundaki ekspresyonla karşılaştırın.
    NOT: Antikor metal konjugasyonu, antikor preparasyonu, redüksiyonu ve ardından konjugasyon ile başlar (Ek Dosya 1). Her metal yüklü polimer tüp, 100 μg bir antikorun etiketlenmesi için yeterlidir.

2. Antikor paneli tasarımı

  1. Küçük antikor boyama partileri oluşturun. Bir kokteylde beş adede kadar işaretleyiciyi test edin.
    NOT: İmmünohistokimya kullanılarak gruplar halinde konjuge edilmiş ve analiz edilmiş antikorların test edilmesi, kanal parazitlerinin erken tanımlanmasını kolaylaştırır ve antikorları başka bir metalle yeniden konjuge etme fırsatı sağlar. Ayrıca, yeterli belirteç birlikte ifadesini değerlendirmek için bir fırsat sağlar.
  2. Her küçük partiyi dört farklı antikor konsantrasyonuna (0.05 μg / mL, 0.2 μg / mL, 1 μg / mL ve 4.0 μg / mL) sabitleyin.
    NOT: Farklı titreleri karşılaştırarak, minimum arka plan boyaması (en iyi sinyal-gürültü oranı) ile doğru konum ve en yüksek ekspresyonla sonuçlanan antikor konsantrasyonunu tanımlayın.

3. FFPE doku kesitleme

  1. Altın kaplı slaytları seçin (bu amaca özel) ve mikrotoma yakın tutun. Tutucuya yeni bir bıçak sokarak mikrotomu hazırlayın. Bölüm kalınlığını 4-5 μm'ye ayarlayın.
  2. Bölümlemeden önce FFPE bloklarını buzun üzerine koyun. Damıtılmış suyu veya deiyonize suyu (diH2O) 40-45 ° C'ye ısıtarak bir doku yüzdürme banyosu hazırlayın.
    NOT: diH2O veya damıtılmış su kullanmak kontaminasyon olasılığını azaltır.
  3. Bölümlemeye başlayın. Doku bölümünü cımbız kullanarak suya yerleştirin ve düzleşmesine izin verin. Doku kesitlerini sudan çıkarmak için slaytları kullanın.
  4. Slaytları bir sürgü rafına yerleştirin ve gece boyunca oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.

4. FFPE antikor boyama

NOT: Boyama işlemi iki ayrı günde gerçekleşir.

DİKKAT: Bu protokolde kullanılan çözeltiler potansiyel olarak aşındırıcıdır ve cilt ve gözler için tehlikeleri temsil eder. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu göz ve yüz ekipmanı giyilmesi tavsiye edilir ve kurumumuzun biyogüvenlik politikasının bir parçasıdır.

  1. Reaktif hazırlama (1. gün)
    1. 1 L TBS-T yapmak için 50 mL 20x Tris tamponlu salini Tween (TBS-T) ile 950 mL diH2O içine seyreltin.
    2. 1x ısıya bağlı epitop geri kazanımı (HIER) çözeltisi yapmak için 8 mL 10x Tris-etilendiamintetraasetik asidi (EDTA)72mL diH 2 O içine seyreltin.
    3. Bloke edici tampon oluşturmak için eşek serumunu 1x TBS-T'de% 5'lik son konsantrasyona kadar seyreltin. Çözeltiyi kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
  2. HIER hazırlığı: Ön işlem (PT) modülü
    DİKKAT: PT modülünde kullanılan herhangi bir reaktifi veya herhangi bir reaktife batırılmış parçaları tutarken kimyasal koruyucu eldiven giyin.
    1. 1.4 L 1x PBS yapmak için 140 mL 10x fosfat tamponlu salin (PBS)1.260mL diH 2 O içine seyreltin. Alternatif olarak, yedi PBS tabletini 1.4 L diH2O olarak seyreltin.
    2. Bir tankı 1,4 L PBS ile doldurun ve hazırlanan sürgülü hazneli kabı 100 mL 1x HIER çözeltisi ile tankın içine yerleştirin.
    3. Tankı bir PT modülünde 75 ° C'ye kadar önceden ısıtın.
  3. Aşırı parafin çıkarılması
    1. 70 °C'de kızakları fırında en az 20 dakika pişirin.
      NOT: Bazı mendiller veya bölümler daha uzun pişirme sürelerine ihtiyaç duyabilir. Beyin dokusu veya TMA için önerilen pişirme süresi 1 saattir. Bu, 16 saate (gecelik) veya laboratuvar deneyimine göre uzatılabilir.
    2. Pişmiş slaytları bir slayt tutucuya yerleştirin ve aşağıdaki yıkama adımlarını bir duman başlığının altındaki bir çalkalayıcıda gerçekleştirin. Kızakları aşağıdaki solüsyonda yıkayın: 30 s için ksilen 2x (metalsiz), 30 s için %100 alkol 2x (metalsiz), 30 s için %95 alkol 2x (metalsiz), 30 s için %80 alkol (metalsiz), 30 s için %70 alkol (metalsiz) ve 30 s için diH2O 2x (metalsiz).
    3. Slaytları antijen alımına hazır olana kadar taze bir diH2O kabında saklayın.
      NOT: Slaytlar işlemin sonuna kadar kurutulmamalıdır.
  4. Antijen alımı
    1. Slaytları, PT modülünün içinde 1x HIER tamponu içeren önceden ısıtılmış bir slayt odasına yerleştirin. Kapağı tankın üzerine yerleştirin. Kapağı kapatın ve mandallayın.
    2. Ana menüyü açmak için PT modülündeki Menü düğmesine basın ve özel bir program oluşturmak için Kurulum döngüsü (zaman ve sıcaklık) düğmesine basın.
    3. PT modülünü 97 °C'de 40 dakika çalıştırın. Daha sonra, PT modülü otomatik olarak 65 ° C'ye soğur.
    4. 65 °C sıcaklığa ulaşıldığında kızakları PT modülünden çıkarın. Slaytları 30 dakika oda sıcaklığında tutun.
      NOT: PT modülü, sıcaklık 65 °C'ye soğuyana kadar açılmaz. Bu işlem sırasında slaytların altın yüzeyine dokunmayın ve daima eldiven kullanın.
  5. Antikor bloke edici
    1. Bir çalkalayıcıyı 70 rpm'ye ayarlayın.
    2. Slaytları 5 dakika 2x için 1x TBS-T'ye batırarak yıkayın.
    3. Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak, doku bölümünün etrafına slayt kenarlarından en az 1 mm uzakta bir sınır çizin ve 15-30 s kurumasını bekleyin.
      NOT: Lekelenmeye herhangi bir doku müdahalesini önlemek için kalem sıvısının doku bölümüne temas etmesini önlemeye özen gösterin. Olası sızıntıları önlemek için bariyeri çizerken kaleme çok sert bastırmayın. Optimum boyama ve görüntü elde etme sonuçları için, doku kesitleri altın kaplı slaytların ortasına, dokuya veya kızağın dış kenarına yerleştirilen kılavuz noktalara dokunmadan bariyeri çizmek için yeterli alan sağlamak üzere 15 mm x 30 mm'den büyük olmayan bir çerçeveye yerleştirilir.
    4. Kalem kalıntılarını gidermek için slaytları TBS-T'ye batırın.
    5. Oda sıcaklığında bir nem odasında, doku bölümünü 20 dakika boyunca 100-200 μL bloke edici tampon ile inkübe edin. Bir antikor ana karışımı hazır olana kadar dokuyu bloke edici tamponda inkübe etmeye bırakın.
  6. Antikor paneli hazırlama
    NOT: Antikor paneli kokteylinin son hacmi, tahmini doku kesiti yüzey alanına göre değişir. 20 mm x 20 mm'lik bir alanı kaplamak için, kokteylin 100-200 μL'sini hazırlayın.
    Metal izotop konjuge antikorlardan oluşan bir antikor paneli kokteyli hazırlamak için aşağıdakileri yapın:
    1. Kokteylin, bloke edici tampon hacmine eklenen antikor kokteyli hacmine eşit olan son hacmini onaylayın.
    2. Proje için bir panel elektronik tablosundaki tüm antikorların, seyreltmelerin ve/veya antikor konsantrasyonlarının özelliklerini onaylayın.
    3. Tüm antikor içeren tüpleri 5 dakika boyunca 10.000 x g'de döndürün. Bloke edici tampona bireysel antikorlar ekleyin ve çok iyi karıştırın. Pipetleme yaparken antikor tüpünün tabanını rahatsız etmeyin.
    4. Antikor panelini, 0,1 μm'lik bir santrifüj filtre cihazını 100 μL bloke tamponu ile önceden ıslatarak filtreleyin. Filtreyi 2 dakika boyunca 10.000 x g'de döndürün ve engelleyici tampon akışını bir pipetle çıkarın.
    5. Antikor panelini bir spin kolonuna aktarın ve filtreyi 2 dakika boyunca 10.000 x g'de döndürün. Döndürme kolonunu atın ve filtrelenmiş antikor paneli olarak akış akışını kullanın.
      NOT: Metal değişimini önlemek için kokteyli yaptıktan hemen sonra boyama işlemini gerçekleştirin. Antikor kokteylinin uzun süre saklanması gerekiyorsa, liyofilizasyona tabi tutulabilir.
  7. Antikor boyama
    1. Her bir slaytı kendi tarafına devrerek ve kenarları bir görev sileceğine hafifçe vurarak engelleme arabelleğini slaytlardan dikkatlice çıkarın.
    2. Slaytları bir nem odasına yerleştirin ve dokuya 100-200 μL antikor ana karışımı ekleyin (doku ile temastan ve hava kabarcıklarının oluşmasından kaçının).
    3. Boyama partisine pozitif ve negatif kontrol slaytları ekleyin.
    4. Slaytları gece boyunca 4 ° C'de (14-16 saat) inkübe edin.
  8. Reaktif hazırlama (2. gün)
    1. 1x PBS yapmak için 100 mL 10x düşük baryum PBS, pH 7.4, 900 mL diH2O içinde seyreltin.
    2. Düşük baryum PBS'de (340 mL düşük baryum PBS + 10 mL% 70 glutaraldehit) 350 mL% 2 glutaraldehit çalışan bir stok çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Seyreltmeyi bir kaputun altında gerçekleştirin. Glutaraldehit çok viskoz bir sıvıdır. 1 mL'lik bir pipet kullanın ve tüpten dökülecek kadar sıvı hale gelene kadar glutaraldehit tüpüne her seferinde 1 mL düşük baryum PBS ekleyin.
    3. 1x Tris yapmak için 10x Tris, pH 8.5, 900 mL diH20'da seyreltin.
  9. Fiksasyon ve dehidrasyon
    1. Slaytı yan tarafına eğerek ve kenarını bir görev sileceğine hafifçe vurarak her slayttan ana antikor karışımını çıkarın.
    2. Slaytları aşağıdaki tamponlarda hafif ila orta derecede ajitasyonla yıkayın: 1x TBS-T, her biri 5 dakika boyunca 3x kez (metalsiz); 5 dakika boyunca% 2 glutaraldehit filtrelenmiş; filtrelenmiş 1x tris, pH 8.5, 30 s için 3x; 30 s için filtrelenmişdiH 2O 2x; 30 s için% 70 alkol (metal içermez); 30 s için% 80 alkol (metal içermez); 30 s için% 95 alkol (metalsiz); ve 30 s için% 100 alkol (metal içermez).
    3. Fazla alkolü gidermek ve artık alkolün oda sıcaklığında (~5-10 dakika) buharlaşmasına izin vermek için her kızağın kenarını bir görev sileceğine hafifçe dokunun.
    4. Görüntü yakalamadan önce kızakları kurutucuda en az 1 saat kurutun veya uzun süreli depolama için slaytları vakum odasında tutun.

5. Görüntü alma

  1. Slayt kurulumu
    NOT: Cihazı kullanarak taramadan önce, slaytlar aşağıda açıklanan adımlar izlenerek web tabanlı görüntü yönetimi uygulaması kullanılarak tanımlanmalı ve ayarlanmalıdır.
    1. Web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasındaki slayt sayfasında, Yeni Slayt Erişimi'ni tıklatın ve istediğiniz ayrıntıları (ad, slayt tanımlama, konum ve açıklama) girin.
    2. Bölüm Ekle'yi tıklatarak tarama bölümleri oluşturun. Her bölümün bilgilerini doldurun (projenin adı, slayt adı, blok ve konum). Oluşturulan yeni slaytları/bölümleri kaydetmek için Gönder'i tıklatın.
    3. Kaynaklar sekmesinin altında, paneller sayfasını açın ve kullanılacak paneli seçin. Yeni paneller için Yeni Panel Oluştur'u tıklatın.
    4. Paneli seçtikten sonra, Bölümler'e tıklayın. 2. adımda oluşturulan bölümleri ekleyin. Bölüm Atamasını Düzenle'ye tıklayarak. Gönder'i tıklayarak kaydedin.
  2. Cihaz kurulumu
    NOT: Bu cihaz (bakınız Malzeme Tablosu) belirli bir kontrol yazılımı programı kullanılarak çalıştırılır (bkz.
    1. Kontrol yazılımında oturum açın. Cihaz uyku modundaysa Uyandır'ı tıklatın.
      NOT: İşlemden en az 1 saat önce, cihazın ısıtılması önerilir, bu da ışın odağının dengelenmesine yardımcı olur.
    2. Bir slayt yüklemek için, Exchange Örneği'ne tıklayın ve ardından kapıyı açmak için Devam'a tıklayın. Slaytı, numune yukarı bakacak ve etiket sağda olacak şekilde yükleme yuvasına yerleştirin. Kapıyı kapatmak için Devam'ı tıklatın.
      NOT: Slayt doğru yüklenmezse, slaytı ayarlamak için bir uyarı sesi ve bildirim görüntülenir.
    3. Projeyi seçin ve ardından yüklenen örnek için slayt adını seçin.
    4. Slayt optik görüntü bölmesindeki panoramik görüntüyü görselleştirin.
  3. Görüş alanı (FOV) seçimi ve edinimi
    1. Mod menüsüne tıklayın ve SED (İkincil Elektron Dedektörü) öğesini seçin. Görüntüleme modu menüsüne tıklayın ve QC −300 μm'yi seçin.
    2. FOV konumunu kontrol etmek için Jog Stage'e tıklayın ve ardından FOV'un konumunu seçmek ve gezinmek için oklara tıklayın.
    3. FOV Ekle'yi tıklatın, alan boyutu olarak 400 μm x 400 μm olarak ayarlayın ve görüntüleme modu ve 1 ms bekleme süresi olarak iyi seçeneğini belirleyin. Onayla'yı tıklayın.
      NOT: Ayarlanan bekleme süresi, istenen çözünürlüğe bağlı olacaktır. Çözünürlük arttıkça bekleme süresi de artar. Satın alma süresi, dedektörün kırılma süresi ve çalışma süresi dahil olmak üzere birçok faktöre bağlı olarak değişebilir. Bir FOV için ortalama edinme süremiz yaklaşık 17 dakikadır. Cihazı 8 saate kadar kesintisiz kullanın, bu da yaklaşık 28 FOV'un taranmasını sağlar. Elde edilen görüntülerin kalitesi, art arda birçok saatlik kullanımdan sonra düşer.
    4. Bir FOV listesi oluşturduktan sonra, görüntü odağına geçin ve ışını görüntülenmeyecek bir doku bölgesine taşıyarak damgalamayı ayarlayın. Net bir merkezi görüntü elde edilene kadar parametreleri ayarlayın.
      NOT: Görüntü yakalamayı optimize etmek için, doku bölümünü slaytta merkezi tutmak idealdir. Netleme sırasında sadece merkezi alanın net bir görüntüsü elde edilebiliyor. Doku bölümü çok büyükse, kenarlar odak dışı kalır ve görüntü bulanıklaşır.
    5. Start Run'a (Çalıştırmayı Başlat) tıklayın. Elde edilen görüntüler otomatik olarak yüklenecek ve web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasında saklanacaktır.

6. Görüntü hazırlama

  1. Görüntü izobarik düzeltme
    NOT: İzobarik düzeltmenin amacı, kütle analizörü kullanılarak kütle farklılıkları tespit edilemeyen eşit veya çok benzer kütleli izotopların varlığından kaynaklanan kanallar arasındaki yayılma sinyalini ortadan kaldırmaktır.
    1. Web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasında, FOV'ları (TIFF görüntüleri) kaydetmek için yeşil İndir simgesine tıklayın.
    2. Web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasındaki hakkında sekmesinde bulunan görüntü işleme yazılımının en güncel sürümünü (bkz. Malzeme Tablosu) indirin ve bir dosyaya kaydedin. .zip arşiv dosyasını açın ve yükleme adımlarını izleyin. Yükleme tamamlandıktan sonra yazılımı açın.
    3. Görüntü işleme yazılımının giriş bölmesindeki Dosya simgesine tıklayarak düzeltilecek görüntüleri içeren klasörü seçin. Bir FOV listesi yüklenecektir.
    4. Varsayılan düzeltmeleri uygulamak için giriş bölmesindeki Filtre simgesine tıklayın. Her kanal için, ekranın sağ tarafında düzeltmeden önce ve sonra elde edilen görüntüleri görselleştirin.
    5. Düzeltilen görüntüyü kaydetmek için çıktı bölmesindeki Disket simgesine tıklayın.
  2. Görüntü filtreleme: Voronoi mozaikleme
    NOT: Voronoi mozaikleme diyagramları, Voronoi hücrelerine tohum noktaları içeren bir alan bölümünü gösterir. Amaç, hücre yoğunluğunu tahmin etmek ve hücre sınırlarını tanımlamaktır. Voronoi mozaikleme hesaplaması kullanılarak, bir maske oluşturulur ve filtreleme için orijinal görüntüye uygulanır.
    1. Filtreleme sekmesine tıklayın ve filtreleme parametreleri menüsünden Voronoi Tesselation'ı seçin.
    2. Giriş bölmesinde, MassCorrected.tiff görüntüsünü seçin. Giriş bölmesindeki Filtre simgesine tıklayın.
    3. Filtre uygulanmış görüntüyü kaydetmek için çıktı bölmesindeki Disket simgesine tıklayın. Elde edilen iki dosya -Filtered.tiff ve -Filtered.json soneklerine sahip olacaktır.
      NOT: MassCorrected-Filtered.tiff adlı görüntü daha sonra üçüncü taraf bir dijital analiz yazılımı programına veya açık kaynaklı yazılım programına yüklenebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tonsil ve akciğer adenokarsinomu TMA doku kesitleri (5 mm kalınlığında) elde edildi ve slaytların doku büyüklüğü ve güvenli kenar boşlukları ile ilgili spesifikasyonlara göre altın kaplı slaytların ortasına yerleştirildi. Optimum boyama için sırasıyla dokunun kenarı ile cam kızakların yanal ve alt kenarlıkları arasında 5 mm ve 10 mm'lik serbest cam kenar boşlukları gereklidir. Doku kesitleri, bölümün slayda uygun şekilde yapışmasını sağlamak için boyamadan önce bir fırında gece boyunca pişirildi. Antikor paneli 23 belirt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir TME'nin çoklu bileşenleri arasındaki karmaşık, karmaşık etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde aydınlatılması, kanser araştırmalarının önemli bir amacı olmaya devam etmektedir. Üreticiler, özellikle son 5 yılda, bu çabanın bir parçası olarak çok sayıda çoklanmış tahlil başlattılar. Çok katlı mekansal analiz, tümör örneklerinde yapısal morfolojiyi korurken birkaç hedefin eşzamanlı kategorizasyonunu kolaylaştıran çok yönlü ve güçlü bir araçtır. Mekansal analiz teknikleri, burada açıklanan teknik gibi floresan görüntüleme ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu makaleyi düzenlediği için Düzenleme Hizmetleri, MD Anderson'daki Araştırma Tıp Kütüphanesi ve MD Anderson'daki Translasyonel Moleküler Patoloji Bölümü'ndeki Multipleks İmmünofloresan ve Görüntü Analizi Laboratuvarı'ndan Don Norwood'a teşekkür etmektedir. Bu yayın kısmen, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) İşbirliği Anlaşması (U24CA224285) aracılığıyla Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kanser İmmün İzleme ve Analiz Merkezi'ne (CIMAC) sağlanan Kanser İmmünolojik Veri Müşterekleri Ağı'na (CIMAC-CIDC) bilimsel ve finansal desteğin kolaylaştırdığı araştırmalardan kaynaklanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
%100 ReaktifAlkol Sigma-AldrichR8382
%95 Reaktif AlkolSigma-AldrichR3404
%80 Reaktif AlkolSigma-AldrichR3279
%70 Reaktif AlkolSigma-AldrichR315
20X TBS-Tİyon Yolu567005
10X Düşük Baryumlu PBS pH 7.4İyon Yolu
10X Tris pH 8.5 İyon yolu567003
4&derece; C BuzdolabıThermoScientificREVCO
Aerosol Bariyer Pipet Uçları P10Olympus24-401
Aerosol Bariyer Pipet Uçları P20Olympus24-404
Aerosol Bariyeri Pipet Uçları P200Olympus24-412
Aerosol Bariyeri Pipet Uçları P1000Olympus24-430
Santrifüj Filtre Ultrafree-MCFisher ScientificUFC30VV00
Deiyonize H2Oİyon Yolu567002
Eşek serumuSigma-AldrichD9663
EasyDip Slayt Boyama Kavanozu, Yeşil ElektronMikroskobu Bilimleri71385-G
EasyDip Slayt Boyama Kavanozu, Sarı ElektronMikroskobu Bilimleri71385-Y
EasyDip Slayt Boyama Kiti (Kavanoz+Raf), BeyazElektron Mikroskobu Bilimleri71388-01
EasyDip Paslanmaz Çelik TutucuElektron Mikroskobu Bilimleri71388-50
Gluteraldehit %70 EM Dereceli ElektronMikroskobu Bilimleri16360
Isı Kaynaklı Epitop Alma (HIER) tamponu: EDTA'lı 10X Tris, pH 9DakoS2367
Isıya dayanıklı slayt odaElektron Mikroskobu Bilimleri62705-01
Hidrofobik bariyer kalemFisher50-550-221
MIBI/O yazılımıIonpathNA
MIBIcontrol yazılımıIonpathNA
MIBIslideIonpath567001
MIBIscopeIonpathNA
MikrosantrifüjEppendorf5415D
MikrotomLeicaRM2135
Nem Odası (Nem Odası)SimportM922-1
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) TabletleriFisher ScientificBP2944100
PT ModülüThermo ScientificA80400012
Hızlı Akışlı Steril Tek Kullanımlık Filtre ÜniteleriFisher Scientific097403A
ShakerBioRockerS2025
Döndürme sütunu (Ultrafree-MC Döndürme Filtresi, 0.5mL 0.1μ m)MillQUFC30VV00
Sürgülü fırınFisher Scientific6901
Vakum Dolabı KurutucuVWR30621-076
Görev kırbaçKimberly Clark34155
KsilenSigma-Aldrich534056-4L
567004

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
  2. Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89(2020).
  3. Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
  4. Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
  5. Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
  6. Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466(2020).
  7. Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98(2021).
  8. Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
  9. Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
  10. Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
  11. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59(2020).
  12. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  13. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).
  14. Rad, H. S., et al. The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
  15. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
  16. Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tumor MicroenvironmentMass Spectrometry ImagingFormalin Fixed TissueParaffin Embedded TissueMultiplex ImagingMetal Labeled AntibodiesAntibody Panel OptimizationTissue CompartmentalizationCell SegmentationDigital Image Analysis

Related Articles