Yöntem makalesi

Fonksiyonel Çalışmalar için İnsan Sinaptik Reseptörlerini Yeniden Aktive Etmek için Sinaptik Membranların Mikrotransplantasyonu

DOI:

10.3791/64024

⸱

20 Temmuz 2022

 ,  ,  , 
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, sinaptik membranların Xenopus laevis oositlerine mikrotransplantasyonunu gerçekleştirerek, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit ve γ-aminobütirik asit reseptörlerinin tutarlı ve güvenilir yanıtlarını kaydetmenin mümkün olduğunu göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uyarıcı ve inhibitör iyonotropik reseptörler, fizyolojik nöronal iletişim sırasında sinapsların aktivitesini belirleyen iyon akılarının başlıca kapılarıdır. Bu nedenle, bollukları, işlevleri ve diğer sinaptik elementlerle olan ilişkilerindeki değişiklikler, nörodejeneratif hastalıklarda ve zihinsel bozukluklarda beyin fonksiyonlarındaki değişikliklerin ve bilişsel bozulmanın önemli bir korelasyonu olarak gözlenmiştir. Uyarıcı ve inhibitör sinaptik reseptörlerin fonksiyonlarının hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini anlamak, etkili tedavilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Hastalıkla ilgili bilgi edinmek için, hastalıklı insan beyninde işlevsel kalan nörotransmitter reseptörlerinin elektriksel aktivitesini kaydetmek önemlidir. Şimdiye kadar bu, reseptörlerin fonksiyonundaki patolojik değişiklikleri değerlendirmek için en yakın yaklaşımdır. Bu çalışmada, insan reseptörleri içeren donmuş insan beyin dokusundan sinaptik membranların Xenopus laevis oositlerinin membranına enjeksiyonu ve posterior füzyonu ile yeniden aktive edilmesinden oluşan sinaptik membranların mikrotransplantasyonunu gerçekleştirmek için bir metodoloji sunulmuştur. Protokol ayrıca, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) ve γ-aminobütirik asit (GABA) reseptörlerinin tutarlı ve güvenilir yanıtlarını elde etmek için metodolojik stratejinin yanı sıra normalizasyon ve titiz veri analizi için kullanılan yeni ayrıntılı yöntemler sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nörodejeneratif bozukluklar nüfusun büyük bir yüzdesini etkiler. Yıkıcı sonuçları iyi bilinmesine rağmen, beyin fonksiyonu için kritik olan nörotransmitter reseptörlerinin fonksiyonel değişiklikleri ile semptomatolojileri arasındaki bağlantı hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bireyler arası değişkenlik, hastalığın kronik doğası ve semptomların sinsi başlangıcı, kimyasal dengesizliklerin iyi belgelendiği birçok beyin bozukluğunun anlaşılmasını geciktiren nedenlerden sadece birkaçıdır 1,2. Hayvan modelleri, evrimsel korunmuş sistemlerde fizyoloji ve patofizyolojinin altında yatan mekanizmalar hakkında paha biçilmez bilgiler üretmiş ve bilgimizi genişletmiştir; Bununla birlikte, kemirgenler ve insanlar arasındaki çeşitli türler arası farklılıklar, hayvan modellerinden insan beynine reseptör fonksiyonunun doğrudan ekstrapolasyonunu engellemektedir3. Bu nedenle, yerli insan reseptörlerini incelemek için ilk çabalar, Ricardo Miledi'nin laboratuvarı tarafından cerrahi olarak çıkarılmış doku ve dondurulmuş örnekler kullanılarak geliştirilmiştir. Bu ilk deneylerde, nöronal sinaptik ve ekstra sinaptik reseptörlerin yanı sıra nöronal olmayan nörotransmitter reseptörlerini içeren tüm membranlar kullanılmıştır ve hastalıklı durumlar hakkında önemli bilgiler sağlamalarına rağmen, reseptörlerin karışımınınverilerin yorumlanmasını zorlaştırdığı endişesi vardır 4,5,6,7. Daha da önemlisi, sinapslar birçok nörodejeneratif bozuklukta ana hedeftir 8,9; Bu nedenle, etkilenen sinapsların fonksiyonel özelliklerini test etmek için yapılan testler, sinaptik iletişimi etkileyen hastalıkla ilgili değişiklikler hakkında bilgi edinmek için esastır. Burada, orijinal yöntemin bir modifikasyonu açıklanmaktadır: zenginleştirilmiş sinaptik protein preparatlarının fizyolojik karakterizasyonuna odaklanan ve sıçan ve insan sinaptozomlarını incelemek için başarıyla uygulanan sinaptik membranların mikrotransplantasyonu (MSM) 10,11,12,13,14,15 . Bu metodolojiyle, bir zamanlar insan beyninde çalışan, kendi doğal lipitlerine gömülü sinaptik reseptörleri ve kendi ilişkili protein kohortlarıyla nakletmek mümkündür. Ayrıca, MSM verileri nicel olduğundan, bu verileri büyük proteomik veya sıralama veri kümeleriyle tümleştirmek için kullanmak mümkündür10.

Sinaptik reseptörlerin birçok farmakolojik ve biyofiziksel analizinin rekombinant proteinler üzerinde yapıldığını belirtmek önemlidir16,17. Bu yaklaşım, reseptörlerin yapı-fonksiyon ilişkileri hakkında daha iyi bir fikir verirken, nöronlarda bulunan karmaşık multimerik reseptör kompleksleri ve bunların hastalıktaki değişiklikleri hakkında bilgi sağlayamaz. Bu nedenle, doğal ve rekombinant proteinlerin bir kombinasyonu, sinaptik reseptörlerin daha kapsamlı bir analizini sağlamalıdır.

Bir laboratuvarın gereksinimlerine göre ayarlanabilen10,11,12,13,14,15 sinaptozomlarını hazırlamak için birçok yöntem vardır. Protokol, sinaptozomal zenginleştirilmiş preparatların izole edildiği ve mikrotransplantasyon deneyleri için işlenmeye hazır olduğu varsayımıyla başlar. Laboratuvarda, üretici talimatlarını izleyerek Syn-Per yöntemi kullanılır. Bu, elektrofizyolojik deneylerde yüksek tekrarlanabilirlik nedeniyle yapılır10,11. Ayrıca, enjeksiyon20 için hazır olarak satın alınabilen Xenopus oositleri 18,19'un nasıl izole edileceğini açıklayan çok sayıda literatür vardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm araştırmalar kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilir ve California Irvine Üniversitesi (IACUC-1998-1388) ve Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi (IACUC-1803024) kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanır. Alzheimer hastalığı olmayan (AD) bir beyinden (kadın, 74 yaşında, ölüm sonrası aralık 2.8 saat) ve bir AD beyninden (kadın, 74 yaşında, ölüm sonrası aralık 4.5 saat) temporal korteks, California Üniversitesi Irvine Alzheimer hastalığı araştırma merkezi (UCI-ADRC) tarafından sağlanmıştır. Beyin bağışı için bilgilendirilmiş onam UCI-ADRC tarafından alındı.

NOT: Sabit olmayan insan beyin dokusu, kan yoluyla bulaşan patojenlerin (BBP) kaynağı olarak tedavi edilmelidir. Buna göre, deneylere başlamadan önce BBP eğitimine ihtiyaç vardır. Bu protokol, BSL2 gereklilikleri kapsamında bir biyogüvenlik seviye 2 (BSL2) laboratuvarında gerçekleştirilir. Laboratuvardaki kılavuz ilkeler ve önlemler şunları içerir: laboratuvarda yiyecek veya içeceklere izin verilmemesi, iyi laboratuvar uygulamalarına uyulması, kişisel koruma ekipmanı (eldiven, önlük, açık parmaklı ayakkabı) gerekmemesi ve kapının her zaman kapalı olması gerekir.

1. Xenopus oosit mikroenjeksiyon hazırlığı

  1. Enjeksiyon iğneleri yapmak için, bir mikropipet çektirme makinesi kullanarak 3,5 inç borosilikat tüpleri çekin. Mikroenjeksiyon iğneleri çekildikten sonra, mikroenjeksiyonun yapılabilmesi için iğnenin ucundan yeterince kesmek için bir mikroskop ve bir tıraş bıçağı kullanın.
    NOT: İğnenin kesilecek ucunun uzunluğu değişebilir.
  2. 800 mL damıtılmış suya 200 mL Barth's Stock Solution (5x) ekleyerek 1x Barth'ın çözeltisini hazırlayın. 24 delikli, düz tabanlı bir doku kültürü plakasını 18 °C 1x Barth çözeltisi ile doldurun.
    1. 5x Barth'ın stok çözümünü aşağıdaki gibi hazırlayın. 1 L damıtılmış suya 25.71 g NaCl (sodyum klorür), 0.372 g KCl (potasyum klorür), 0.301 g CaCl 2 (kalsiyum diklorür), 0.389 g Ca(NO 3)2 (4H2O) (kalsiyum nitrat tetrahidrat), 1.01 g MgSO4 (7H 2 O) (magnezyum sülfat heptahidrat), 1.008 g NaHCO3 (sodyum bikarbonat), ve 11.91 g HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit).
  3. Ksenopus oositlerini18,19'da açıklanan protokolleri kullanarak ve 2x büyütülmüş stereoskop kullanarak, sağlıklı görünümlü, evre V-VI oositleri seçerek izole edin. Kuyu başına yaklaşık 10 oosit yerleştirin ve kayıtları gerçekleştirirken kontrol hücresi olarak kullanılmak üzere enjekte edilmemiş yumurtaları barındırmak için kuyulardan birini kullanın.
  4. 1 cm boyunda ve 6 cm çapında küçük bir Petri kabı alın ve içine Naylon ağı, kabın tabanını kaplayacak şekilde yerleştirin. Daha sonra, oositlerin mikroenjeksiyonlarını gerçekleştirmek için kullanılmak üzere 15 mL 1x Barth çözeltisi dökün.
  5. Mikroskop platformunun orta hattı boyunca bir nanoenjektör yerleştirin. Mıknatısı Kapalı konuma getirin ve nanoenjektörü dikkatlice desteklerken yavaşça istenen konuma getirin. Nanoenjektör düzgün bir şekilde konumlandırıldığında, mıknatısı tamamen Açık konumuna geri getirin ve güvenli olduğundan emin olun.
  6. 50.6 nL'lik bir numune boyutu için, nanoenjektörün yanında aşağıdaki ayarları kullanın: 1 D (aşağı), 2 D, 3 U (yukarı), 4 D ve 5 U. Mikroskop standı üzerinde nanoenjektörün yörüngesiyle hizalayarak kendinden sızdırmaz bir termoplastik parçası veya mikrosantrifüj tüp kapağı yerleştirin.
    NOT: 50 nL, sitoplazmanın dayanabileceği maksimum enjekte edilen materyal miktarınayakındır 21.
  7. Bir insülin şırıngasını hacminin yaklaşık yarısını mineral yağ (yaklaşık 0.5 mL / cc) ile doldurun. Bu şırıngayı kullanarak, mikroenjeksiyon iğnesini mineral yağ ile doldurun. İğnenin ucunda görünür bir yağ boncuğu göründüğünden emin olun.
  8. Nanoenjektör pistonunu en az 1-2 cm'ye maruz bırakın. Bunu, piston istenen uzunlukta görünene kadar BOŞ düğmesini basılı tutarak yapın. Piston açığa çıktıktan sonra, mineral yağ dolu mikroenjeksiyon cam iğnesini nanoenjektör pistonuna yavaşça ve dikkatlice yerleştirin ve siyah direnç O-ringine iyi oturduğundan ve beyaz direnç halkasında durduğundan emin olun. İşlem sırasında nanoenjektör pistonunu bükmediğinizden emin olun.
  9. Mikroenjeksiyon cam iğnesi güvenli ve yerinde olduğunda, olası hava kabarcıklarını boşaltmak için BOŞ tuşuna basın. Nazikçe, bir kağıt mendille, fazla mineral yağı temizleyin.

2. Numunenin yüklenmesi

  1. 10,11,12,13,14,15'te açıklandığı gibi insan beyninin ilgilendiği bölgeden sinaptozomal zenginleştirilmiş preparatlar (örnekler) hazırlayın ve enjeksiyon anına kadar -80 ° C'de yaklaşık 5 μL'lik alikotlarda saklayın.
  2. Enjeksiyondan önce, aliquot'u ıslak buza aktarın ve sonikasyon ve geri alma dışında her zaman buz üzerinde tutun. Örneklerin sayısı ve türleri deneysel tasarım ile belirlenecektir.
  3. Numunenin ısınmasını önlemek için seçilen örnekleri yüzen ıslak buzlu bir banyoda 3x sonikleştirin. Her seferinde 5 s döngü kullanın, döngüler arasında ıslak buzda 1 dakika bekleyin.
  4. Termoplastik üzerine 1 μL numune yerleştirin. Numunenin hareketini önlemek için numune yerleştirmeden önce, gerekirse, yüzeyde bir girinti yapın.
  5. İğneyi konumlandırmak ve doldurulacak numuneye doğru hareket ettirmek için nanoenjektörü tutan manipülatörün düğmelerini kullanın. İğne ucu numuneye girdikten sonra, yeterli numune alınana kadar FILL düğmesini basılı tutun. 10 oosit için yaklaşık 0.5 μL gereklidir. Düğmeleri kullanarak, nanoenjektörün iğnesini en yüksek konuma geri getirin.

3. Yumurtaların enjekte edilmesi

NOT: Standartlaştırılmış sıçan korteksi sinaptozomal membranları, farklı oosit grupları arasındaki füzyon kapasitesindeki değişiklikleri ölçmek için tüm deneylerde bir dizi oosite enjekte edilir.

  1. Seçilen oositleri, takılı naylon ağa ve Barth çözeltisine (yaklaşık 10 oosit) sahip küçük Petri kabına yerleştirin. Yumurtaları birbirlerinin üstünde olmayacak şekilde düzenleyin; bu, enjeksiyon işlemi sırasında yardımcı olacaktır.
  2. Nanoenjektörü tutan manipülatördeki düğmeleri kullanarak, iğneyi oositlere doğru hareket ettirin. İğne Barth'ın çözeltisine batırıldıktan sonra, mikroenjeksiyon iğnesinin numuneyi serbest bıraktığından emin olmak için nanoenjektör için ayak pedalını kullanın. Örnek serbest bırakılıyorsa, mikroskop görünümünden görülebilecektir.
  3. Numunenin serbest bırakıldığı güvenle belirlendikten sonra, yumurtayı mikroenjekte etmeye geçin. Örnek serbest bırakılmıyorsa, iğneyi doldurma işlemini tekrarlayın.
  4. Yumurtayı yüzeyin hemen altındaki iğneyle nüfuz edin, daha derin değil ve numuneyi enjekte etmek için ayak pedalını kullanın. Ayak pedalı, örnek serbest bırakıldığında bir bip sesi çıkarır. Yaklaşık 2-3 s bekleyin. Enjeksiyon başarılı olursa, hücre genişleyecektir. Bu gerçekleştiğinde, hücreden çıkmak için manipülatördeki düğmeleri kullanın.
    NOT: Oositteki membranların füzyonu polarize bir işlemdir; bu nedenle, oosit, zar füzyonunu en üst düzeye çıkarmak için hücrenin hayvan tarafına, tercihen ekvatorun üstüne, iğnenin hayvan tarafına doğru açısıyla enjekte edilmelidir.
  5. Petri kabını, bir sonraki yumurta iğne ile aynı hizaya gelecek şekilde hareket ettirin ve çanaktaki tüm yumurtalar enjekte edilene kadar işlemi tekrarlayın. İstenilen sayıda yumurta enjekte edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Bir yumurta kuyucuğunun kontrol olarak kullanılmak üzere enjekte edilmeden bırakıldığından emin olun.
  6. Tüm yumurtalar enjekte edildikten sonra, nanoenjektörü orijinal konumuna geri çekin ve iğneyi çıkarın.

4. İki elektrot voltaj kelepçesi kullanarak iyon akımlarının kaydedilmesi

  1. İki elektrot voltaj kelepçesi (TEVC) elektrot iğnesi yapmak için, mikropipet çektirme makinesini kullanarak 15 cm uzunluğunda ateşle parlatılmış borosilikat cam tüpleri çekin. Çekme işlemi tamamlandıktan sonra, uzun kılcal iğneler kullanarak 3 M KCl ile doldurun veya alternatif olarak, iğneleri sürekli bir vakum altında 15 dakika boyunca 3 M KCl çözeltisinde batırın ve kaynatın. Yüksek sıcaklık, elektrotların doldurulmasına ve hava kabarcıklarının giderilmesine yardımcı olur.
    1. Kristal formda ve deiyonize suda KCl kullanarak ve elektrotların referans potansiyelinin değişmemesi için bu adımları dikkatlice izleyerek 3 M KCl elektrot dolum çözeltisi hazırlayın. KCl'yi 2-3 saat boyunca bir fırında dikkatlice kurulayın. Analitik terazi kullanarak 223,68 g KCl'yi dikkatlice tartın. Gümüş elektrot tellerini klorlamak için bu çözeltiyi kullanın.
      NOT: Cam elektrotları çekmek için pipet yemek kitabı buradan indirilebilir: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
  2. İyon akımlarının kaydedilmesi için kullanılan tüm ekipmanları açın: ana sistemler, çözelti valfleri, mikroskop ışığı, valf sistemleri, yumurta kelepçesi ve vakum sistemi. Masaüstü bilgisayarı açın, WinEDR V3.9.1.'de oturum açın ve programın çalıştığından ve kurulum değerlerinin aşağıdaki gibi doğru olduğundan emin olun: diske kaydedin, kayıt süresini ayarlayın ve simülatör seçeneğini temizleyin.
    1. Amplifikatör için aşağıdaki başlangıç ayar değerlerini sağlayın: voltaj elektrodu (Vm) bölümü için negatif kapasite telafisi (-C) seçeneğini kapatın; banyo elektrotları (Im) bölümü için, kazanç seçici anahtarı (0,1 ila 10 aralığı) 10'a ve kazanç çarpanını (x0,1, x1,0 ve x10) seçen üç konumlu geçiş anahtarını x1,0'a ayarlayın. LED ışıkları kazanç çarpanı seçimini gösterecektir; kelepçe bölümü için kelepçe modu seçiciyi kapatın, DC kazanç kontrolünü GİRİŞ olarak ayarlayın ve kazanç kontrolü tam bant genişliği açık döngü (0 ila 2000 aralığı) yaklaşık 1200 arasında; komutlar için 40mV'ye ayarlayın ve tutma kontrollerini negatif ve ölçek çarpanını x2 olarak ayarlayın; akım elektrodu için, oositi etkilemeden önce sıfır referans oluşturmak için Ve ofsetini kullanın.
    2. Kaydetmek için WinEDR V3.9.1 yazılımını açın, üst menüye gidin ve Dosya > Yeni Dosya Aç'ı seçin. Kendi klasörünüzü oluşturun ve dosyayı kaydedin.
    3. Ardından, ana menüde Kaydet'i seçin > Diske Kaydet. İki elektrot ooktilin içindeyken, VC-8 valf denetleyicisindeki zil sesini açın ve OC-725C amplifikatöründe kelepçeyi Yavaş'a çevirin. Ardından, WinEDR yazılımına geri dönün ve ekranın sol üst köşesindeki Kaydet'i seçin.
    4. Sol alttaki işaret grafiğinde, ilk membran potansiyelinizi not edin ve Enter tuşuna basın. Deney devam ettikçe, kullanılan ilaçların adını yazabilirsiniz. Deneme bittikten sonra, ekranın sol üst köşesindeki Durdur'u seçin.
      NOT: TEVC'yi gerçekleştirmek için WinEDR veya WinWCP yazılımı kullanıyoruz, çünkü bunlar ücretsizdir ve deneyler için çok uygundur, ancak mevcut olan diğer yazılımlar kullanılabilir.
  3. Deneyi gerçekleştirmek için gereken tüm ilaç çözeltilerini (örneğin, GABA, Kainate) oluşturun ve çözelti valflerini açıp kapatarak ve sıkıştırma valflerinin yer değiştirmesini gözlemleyerek düzgün çalıştığını onaylayın.
  4. Tüpleri, ilgili çözeltiyi tüpe bağlı şırınga kabına dökerek doldurun ve valf kontrolörünü çözelti tüpleriyle ilişkilendirilecek şekilde etiketleyin. Çözelti akışının sabit olduğundan, kabarcık olmadığından ve vakum sisteminin düzgün çalıştığından emin olun.
  5. Mikroskop ve kayıt odası alanını ayarlayın. Agar köprülerini (aşağıya bakınız) kayıt odasının arkasındaki ilgili dairesel deliklere (taşıma alanından distal) yerleştirin, zemin referansı olarak kullanılan elektrotlar ve kayıt odası için kuyuları birbirine bağlayın. Ringer'ın çalışma çözümünü (1x) kayıt odasına ve toprak referans elektrodu kuyularına ekleyin.
    1. Agar köprüleri, Ringer çözeltisinde% 3 agar ile doldurulmuş, 2-3 cm uzunluğunda U şeklinde borosilikat tüplerdir. 15 cm uzunluğundaki tüpleri keserek, açık alev üzerinde bükerek ve daha sonra bir insülin şırıngası kullanarak sıcak% 3 agar ile doldurarak U şeklinde tüpler yapın. Ringer'ın solüsyonunda dolu agar köprülerini kullanana kadar buzdolabında saklayın.
    2. 20x Ringer'ın stok çözeltisini aşağıdaki gibi yapın: 1 L damıtılmış suda, 134.4 g NaCl, 2.982 g KCl, 5.29 g CaCl 2 ve 23.83 g HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit) ekleyin. 1x Ringer'ın çalışma çözümü için, hacimsel bir şişede, 3.800 mL damıtılmış suya 200 mL Ringer'ın stok çözeltisini (20x) ekleyin.
  6. Her deneyden önce gümüş telleri 3 M KCl çözeltisine yerleştirerek ve gümüş elektrodu 9 V'luk bir pilin pozitif terminaline bağlayarak elektroliz yoluyla klorlu gümüş elektrotlar hazırlayın. Yaklaşık 3 dakika sonra elektrot içine katı kahverengi bir AgCl tabakası biriktirilir. Klorlu gümüş elektrot tellerini elektrot muhafazasına yerleştirin.
    NOT: Toprak referansı ve kayıt klorlu elektrotlar gümüş/gümüş klorür (Ag/AgCl) elektrotlarıdır.
  7. Borosilikat iğnelerini KCl çözeltisinden çıkarın. Elektrot iğnesinin açık ucundan az miktarda KCl çözeltisi çıkarmak için bir şırınga kullanın ve KCl çözeltisini mineral yağ ile değiştirin; bu, suyun buharlaşmasını ve iğne içindeki KCl konsantrasyonundaki değişiklikleri önleyecektir. Cam iğneyi klorlu gümüş elektrot telinin üzerine kaydırın ve yerine sıkın.
  8. Elektrotları tutan sağ ve sol manipülatörleri kullanarak, elektrot iğnelerini Ringer's Solution ile doldurulmuş kayıt odasına yönlendirin.
  9. Vm ve Ve ofset düğmelerini sıfırlayarak ve ardından Elektrot Test düğmelerine basarak her elektrotun direncini kontrol edin. Direnç 0,5-3 MΩ arasında olmalıdır (ekranda doğrudan 5-30 mV olarak okunur). Direnç aralığın dışındaysa, yeni mikroelektrotlar kullanarak değiştirin.
  10. Kayıt odasını taze Ringer solüsyonuyla doldurun. Bir cam pipet kullanarak, kayıt odasının ortasına enjekte edilmemiş veya mikrotransplante edilmiş bir oosit yerleştirin. Yumurtanın mikroskop altında, hayvan tarafı yukarıda olacak şekilde açıkça görülebildiğinden emin olun (bkz. adım 3.4'teki NOT).
  11. Elektrotu, oosit zarına dokunana kadar Ringer çözeltisine yönlendirin. Hayvan tarafındaki oosit zarını her iki elektrotla da nazikçe delin (bkz. adım 3.4'teki NOT) ve dinlenme zarı potansiyelini kaydedin. Ringer'ın çözüm akışını açın.
  12. Yumurta kelepçesi amplifikatörünü kullanarak, modu Voltaj Kelepçesi olarak değiştirin ve -80 mV tutma voltajını ayarlayın. Monitördeki akım negatif olmalı, genellikle 0 ila 0,4 mikroamper arasında olmalıdır.
  13. Kaydı Dosya > Yeni > olarak kaydetmek için yeni bir dosya oluşturun Kaydı yazılıma kaydedin. Kayda başlayın, Kaydet > Diske Kaydet'e basın. İşaret kutusu iletişim kutusunu kullanarak dosyaya ilgili bilgileri ekleyin (test adı, kullanılan ilaçlar vb.).
  14. Valfleri açarak ve bunları 15 sn boyunca kayıt odasına perfüze ederek kimyasal stimülasyon için agonistleri (örneğin, GABA, glutamat veya kainat) uygulayın. Genellikle, maksimum puan sayısını çizmek ve yanıtı yeniden oluşturmak için 10x'lik bir kazanç kullanın. Akımlar çok küçükse, değerlendirilmeleri ve görülebilmeleri için amplifikasyonu veya kazancı artırın. Bu değişiklikleri her zaman not edin.
    NOT: Perfüzyonun süresi deneysel paradigmaya bağlıdır. Ana amaç maksimum genliği ölçmekse, GABA için zirveye veya kainat için platoya ulaşmak için 15 s yeterli olacaktır.
  15. Çözüm düzeylerini her zaman izleyin. Ringer'ın çözeltisinin, tüm çözüm kullanımları arasında kullanıldığı için sık sık yeniden doldurulması gerekecektir. Kayıt tamamlandıktan sonra, voltaj kelepçesini KAPALI konuma getirin ve Zil Anahtarının çözüm valfini kapatın. Yumurtayı çıkarın. Kaydı durdurun ve dosyayı kaydedin. Enjekte edilen tüm oositler için bu adımları tekrarlayın.

5. TEVC kayıtlarının analizi

  1. Kayıtların bir kopyasını bir USB sürücüsüne kaydedin. Oradan, analiz edilecek istenen dosyayı açın. Açılan dosyada kayıt görüntülenebilir, işaretlenebilir ve ölçülebilir. En yaygın analiz, maksimum genliğin, aktivasyon süresinin, duyarsızlaştırmanın ve tekrarlayan uygulamaların tükenmesinin ölçülmesini içerir.
  2. AMPA maksimum yanıtını ve GABA tepe yanıtını ölçün. Bu ölçümleri elde etmek için, önce imleçle kırmızı çizgiyi bulup Ringer uygulaması veya taban çizgisi tarafından oluşturulan akıma sürükleyerek sıfır düzeyi veya taban çizgisi oluşturun.
  3. Sıfır düzeyi oluşturulduktan sonra, yeşil, dikey okuma imlecini grafik izleyicinin istenen bölümüne sürüklemek için fareyi kullanarak yanıt ölçümlerini belirleyin. İstenirse, analiz edilecek izleri tercih edilen başka bir yazılımda dışa aktarın
    NOT: Sıfır düzeyi tanımlanamıyorsa veya izleyicide çok fazla gürültü belirtiliyorsa, WinEDR dosyasını çevrimdışı bir analitik yazılıma aktarın, bu da bir düzey temeli sağlamak için değişikliklere ve gürültüyü azaltmak için filtrelerin eklenmesine olanak tanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enjeksiyondan birkaç saat sonra, nörotransmitter reseptörlerini ve iyon kanallarını taşıyan sinaptik membranlar, oosit plazma zarı ile kaynaşmaya başlar. Şekil 1, Xenopus oositlerine mikrotransplante edilenAMPA ve GABA A reseptörlerinin kayıtlarını göstermektedir. Analizin çoğu için, numune başına iki veya üç oositten gelen yanıtlar, farklı kurbağalardan iki veya üç grup oosit kullanılarak, numune başına toplam altı ila dokuz oosit için ölçülmüştür. Bu, grup farklılıkları...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin bozukluklarında homeostatik ve patolojik süreçleri anlamak ve hastalıkları önlemek veya tedavi etmek için terapötik stratejiler geliştirmek için insan beyninden doğal protein komplekslerinin analizi gereklidir. Bu nedenle, çıtçıtlı dondurulmuş örnekler içeren beyin bankaları, büyük ve çoğunlukla kullanılmayan fizyolojik bilgi zenginliğinin paha biçilmez bir kaynağıdır29,30. Postmortem dokuyu kullanmak için ilk endişe, verilerin yorumlanmasını karıştırabilec...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, AL'ye NIA/NIH hibeleri R01AG070255 ve R01AG073133 tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu makalede gösterilen insan dokusunu sağladığı için California Üniversitesi Irvine Alzheimer hastalığı araştırma merkezine (UCI-ADRC) teşekkür ederiz. UCI-ADRC, NIH / NIA hibesi P30 AG066519 tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Mikroenjeksiyon için
3.5" Cam Kılcal DamarlarDrummond3-000-203-G/X
24 kuyulu, düz tabanlı Doku Kültürü PlakasıThermofisherFB012929
Alevli/Kahverengi tip mikropipet çektirmeSutterP-1000
Enjeksiyon KabıThermofisher08-772B
Mikrosantrifüj TüpleriThermofisher02-682-002
Madeni YağThermofisherO121-1
Nanoject IIDrummond3-000-204
Naylon örgüEndüstriyel AğWN0800
ParafilmThermofisherS37440
StereoskopFisher Scientific03-000-037
ŞırıngaThermofisher14-841-31
Ultrasonik temizleme banyosuThermofisherFS20D
Xenopus laevis kurbağalarıXenopus 14217
İki Elektrot İçin Gerilim kelepçesi< / güçlü>
15 cm uzunluğunda ateş cilalı borosilikat cam kılcaldamarlar SutterB200-116-15
Herhangi bir PC bilgisayar veya dizüstü bilgisayar
Alçak Geçişli Bessel FiltreWarner InstrumentsLPF-8
StereoskopFisher Scientific03-000-037
İki elektrotlu voltaj kelepçesi iş istasyonuWarner InstrumentsTEV-700
ValveLink 8.2 Perfüzyon Kontrol CihazıBilimsel SKU'yu Otomatikleştirin:01-18
WInEDR Ücretsiz yazılımStrathclyde Üniversitesi Glasgowhttps://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Serisi Çok İşlevli DAQUlusal AletlerNI USB-6341
Reaktifler< / güçlü >
Kalsiyum diklorürThermofisherC79
Kalsiyum nitrat tetrahidratThermofisherC109
KollajenazSigma-AldrichC0130
GABASigma-AldrichA2129
HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit)ThermofisherBP310
Kainik asitTocris0222
Magnezyum sülfat heptahidratThermofisherM63
Potasyum klorürThermofisherP217
Sodyum bikarbonatThermofisherS233
Sodyum klorürThermofisherS271-1
Ultrafree-0.1 & mikro; m MC filtresi,Amicon

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
  2. Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
  3. Hodge, R. vD., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  4. Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
  5. Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
  6. Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
  7. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
  8. Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
  9. Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138(2018).
  10. Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
  11. Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer's disease. Nature Communications. 12 (1), 2603(2021).
  12. Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
  13. Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
  14. Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
  15. Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
  16. Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
  17. Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
  18. Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
  19. Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
  20. Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  22. Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
  23. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  24. Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
  25. Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
  26. Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
  27. Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
  28. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
  29. C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
  30. Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
  31. Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
  32. Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
  33. Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
  34. Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
  35. Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  36. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  37. Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
  38. Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
  39. Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
  40. Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
  41. Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sinaptik Membran Mikrotransplantasyonuyonotropik Resept rlerXenopus OositleriVoltaj KlempiAMPA Resept rleriGABA Resept rleriBeyin Dokusu EnjeksiyonuElektrofizyolojik Kay tN rodejeneratif Hastal k

İlgili makaleler