İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Aktin sitoiskeleti, moleküler düzeyde kontraktiliteyi ve kuvvet üretimi ^1,2,3'ü koordine ederek hücrenin hücre içi mimarisinin oluşturulmasında temel bir rol oynar. Sonuç olarak, hücre deformasyonu^4,5, bölüm⁶, göç ^7,8 ve yapışma⁹ dahil olmak üzere çok sayıda temel hücresel aktiviteye aracılık eder. Aktin ağlarının in vitro yeniden yapılanması son yıllarda^{10,11,12,13,14,15,16,17} gibi büyük ilgi görmüştür. Yeniden yapılanmanın amacı, canlı hücrelerde var olan karmaşık biyokimyasal düzenlemeden yoksun minimal bir hücre modeli oluşturmaktır. Bu, spesifik hücre içi aktiviteleri araştırmak için kontrol edilebilir bir ortam sunar ve aktin sitoiskeletinin farklı bileşenlerinin tanımlanmasını ve analizini kolaylaştırır^18,19. Ayrıca, fosfolipid dev unilamellar veziküller (GUV'ler, lipozomlar) içindeki in vitro aktin ağlarının kapsüllenmesi, yarı geçirgen bir sınıra sahip sınırlı fakat deforme edilebilir bir alan sağlar. 9,20,21,22 hücresi içindeki aktin makinesinin fizyolojik ve mekanik mikro çevresini taklit eder.

Lipozomları hazırlamak için çeşitli yöntemler arasında, lipit filmi hidrasyon yöntemi (şişme yöntemi olarak da bilinir) en eski tekniklerden biridir²³. Kuru lipit filmi, tamponların eklenmesiyle hidratlanır ve sonunda vezikül haline gelen membranöz kabarcıklar oluşturur²⁴. Daha yüksek verime sahip daha büyük veziküller üretmek için, elektroformasyon yöntemi²⁵ olarak bilinen film hidrasyon yönteminden ilerleyen geliştirilmiş bir yöntem, hidrasyon işlemini verimli bir şekilde teşvik etmek için bir AC elektrik alanı uygular²⁶. Aktin kapsülleme için bu hidrasyon bazlı yöntemlerin başlıca sınırlamaları, yüksek konsantrasyonlu proteinlerin düşük kapsülleme verimliliğine sahip olması ve sadece spesifik lipit bileşimleri ile uyumlu olmasıdır²⁴. Tersine çevrilmiş emülsiyon tekniği, karşılaştırıldığında, lipit bileşenleri ve protein konsantrasyonları^20,27,28,29 için daha az sınırlamaya sahiptir. Bu yöntemde, kapsülleme için bir protein karışımı, daha sonra lipit içeren bir mineral yağ çözeltisinde emülsifiye edilen ve lipit-tek katmanlı damlacıklar oluşturan iç sulu tampona eklenir. Tek katmanlı lipit damlacıkları daha sonra iki katmanlı lipit vezikülleri (lipozomlar) oluşturmak için santrifüjleme yoluyla başka bir lipit / yağ-su arayüzünden geçer. Bu tekniğin aktin kapsülleme^24,30 için en başarılı stratejilerden biri olduğu kanıtlanmıştır. Ayrı olarak, darbeli püskürtme^31,32, geçici membran ejeksiyonu ³³ ve cDICE yöntemi³⁴ dahil olmak üzere bazı mikroakışkan cihaz yöntemleri vardır. Ters emülsiyon yöntemi ile mikroakışkan yöntem arasındaki benzerlikler, kullanılan lipit çözücü (yağ) ve lipozomların dış broşürünün oluşumu için lipit/yağ-su arayüzünün kullanılmasıdır. Buna karşılık, mikroakışkan yöntemle lipozomların üretilmesi, mikroakışkan cihazların kurulmasını gerektirir ve iki katmanın iki yaprağı arasında sıkışmış yağ eşlik eder, bu da yağın çıkarılması için ekstra bir adım gerektirir³⁵.

Bu yazıda, daha önce kullanıldığı gibi polimerize bir F-aktin ağını kapsülleyen lipozomları hazırlamak için ters emülsiyon tekniğini kullandık²². Kapsülleme için protein karışımı ilk önce aktinin küresel (G) formunda kalması için polimerize olmayan koşullara sahip bir tampona yerleştirildi. Tüm işlem, daha sonra numunenin oda sıcaklığına ısınmasına izin verilerek tetiklenen erken aktin polimerizasyonunu önlemek için 4 ° C'de gerçekleştirildi. Oda sıcaklığına ulaştığında, aktin filamentli (F) formuna polimerize olur. Protein işlevlerini ve özelliklerini incelemek için iç sulu tampon çözeltisine çeşitli aktin bağlayıcı proteinler eklenebilir, böylece aktin ağı ve membran yüzeyi ile etkileşimi hakkında daha fazla bilgi sağlar. Bu yöntem aynı zamanda ilgilenilen çeşitli proteinlerin³⁶ ve son lipozomların büyüklüğüne yakın büyük nesnelerin (mikropartiküller, kendinden tahrikli mikroyüzücüler, vb.)^{kapsüllenmesine de uygulanabilir 28,37}.

1. Tamponların ve protein çözeltilerinin hazırlanması

1. Sulu İç Polimerizasyon Olmayan (INP) Tamponunu, 0,1 mM CaCl₂, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM sakkaroz ve 0,2 mM ATP'yi karıştırarak toplam 5 mL hacimde hazırlayın.
2. Aşağıdaki konsantrasyonlarda 4 ° C'de INP tamponuna proteinler ekleyerek Protein Karışımını (PM) hazırlayın: 11.2 μM floresan olmayan G-aktin, 2.8 μM floresan etiketli aktin ve 0.24 μM Arp2/3 (Malzeme Tablosu). Bir F-aktin tabakası oluşturmak için, PM'ye 100 nM gelsolin, 4 μM kofilin ve 2.2 μM VCA-His ekleyin. Bir kontrol deneyi olarak, PM'yi 100 μg / mL floresan boya ile değiştirin (Malzeme Tablosu).
3. Sulu İç Polimerizasyon (IP) Tamponunu (sulu), 100 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 10 mM ATP ve 80 mM sakkarozu karıştırarak toplam 5 mL hacimde hazırlayın.
4. İç sulu çözeltiyi lipozom içinde kapsüllenecek toplam 30 μL'lik bir hacimde elde etmek için INP tamponunu (PM içeren) ve IP tamponunu 1: 1 hacim oranında karıştırarak Son Tamponu (FB) hazırlayın.
5. Sulu Dış Tamponu (OB) 10 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM KCl, 2mM MgCl 2, 0.2 mM CaCl_{2, 2mM} ATP, 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco,₂₁₂ mM glikoz ve 0.1 mg/mL β kazein karıştırarak toplam 150 μL hacimde hazırlayın.
   NOT: OB'nin ozmolaritesi, OB'nin ozmotik basıncının FB'ninkinden (20-60 mOsm) biraz daha büyük olmasını sağlamak için glikoz ile ayarlanabilir. FB'nin yoğunluğu OB'den biraz daha yüksek olmalıdır.

2. Ters emülsiyon tekniklerine dayalı lipozomların hazırlanması

1. Lipid-yağ karışımını hazırlayın
   1. Bir cam şişeye 100 μL 25 mg / mL L-α-fosfatidilkolin (% 1 DHPE dahil olmak üzere EPC olarak da adlandırılan floresan olmayan Yumurta PC) ekleyin. Kloroformu argon gazı ile buharlaştırın, şişenin dibinde kuru bir katı lipit filmi (2.5 mg) bırakın.
      1. Bir F-aktin tabakası oluşturmak için, EPC'nin DOGS-NTA-Ni'ye 10: 1 oranında 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n (5-amino-1-carboxypentiyl) iminodiasetik asit] süksinil} nikel tuzu (DOGS-NTA-Ni) ekleyin ve kloroformun buharlaşmasından önce karıştırın.
   2. 2 mL mineral yağ ekleyin ve lipitleri yeniden askıya almak için 1 saat boyunca bir banyoda oda sıcaklığında lipit-yağ karışımını sonikleştirin.
      NOT: Sonikasyondan sonra lipit-yağ karışımı 4 ° C'de 1 hafta boyunca saklanabilir. Kullanımdan önce yeniden sonikasyon önerilir.
2. İlgilenilen proteini içeren tek katmanlı lipit damlacıkları hazırlamak için yağ (FB / yağ) emülsiyonunda bir Son Tampon hazırlayın.
   1. Plastik bir tüp içinde alınan 100 μL lipit-yağ karışımına, 10 μL FB ekleyin. FB'nin bir damlacıkta olduğundan emin olun.
   2. Bir cam şırınga kullanarak, lipit-yağ-FB karışımını çekin ve emülsifiye etmek için birkaç kez yavaşça yukarı ve aşağı aspire edin; önce az miktarda lipit-yağ karışımı çekin ve daha sonra şırınganın ucunu damlacığın çevresine yerleştirerek FB damlacığını küçük damlacıklara ayırın. Beyazımsı ve bulutlu bir emülsiyon oluşana kadar yukarı ve aşağı aspirasyonu tekrarlayın.
3. Ayrı bir plastik tüpe 30 μL OB koyun. OB'nin üzerine 30 μL lipit-yağ karışımı yerleştirin ve arayüzde bir lipit tek katmanı geliştirmek için ~ 10 dakika bekletin.
   NOT: Lipitler yüklenmişse veya protein dahil edilmişse, bu adımın süresi³⁸ uzatılmalıdır.
4. Lipozomları hazırlayın
   1. 50 μL FB/yağ emülsiyonunu (adım 2.2) 2.3. adımdan itibaren tüpün üst yağ fazına dikkatlice ekleyin.
   2. Plastik tüpü 4 °C'de 15 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın. Lipozom oluşumunu optimize etmek için zamanı ve santrifüjleme hızını değiştirin.
      NOT: Santrifüjlemeden sonra, üst yağ fazı açık olmalı ve alt OB (lipozomlar içeren) hafif bulutlu olmalıdır.
   3. Yağ fazını pipetle dikkatlice çıkarın. Gerekirse ekstra hacim aspire edin. Lipozom fazının üstünde bir yağ menisküsü oluşturmamak için pipet ucunu tüpün yanına koymadığınızdan emin olun.
   4. Yeni bir pipetle, pipet ucunu yavaşça kalan alt faza yapıştırın ve lipozomları toplamak için sulu hacmi aspire edin.
      NOT: Hacmi kaybetmek, yağı dahil etmekten daha iyidir. Yağın dahil edilmesi lipozomların yırtılmasına neden olur ve iç bileşenler dış tampona salınır. Makası azaltmak için pipetin ucunu kesin.

3. Mikroskopi gözlemi

1. Bir kuluçka odasının kuyucuğuna 100 μL OB dökün (12 mm yuvarlak kapaklar içeren 4 delikli plaka). Toplanan lipozomları (adım 2.4.4) yavaşça OB'ye yatırın ve ardından odanın üstüne başka bir örtü parçası yerleştirin.
   NOT: OB, cam yüzeyi pasifleştirmek ve lipozomlar²⁰ arasındaki yapışmayı en aza indirmek için β kazein içerir.
2. 63x yağ daldırma hedefi kullanarak lipozomları konfokal mikroskopla gözlemleyin. Floresan olarak etiketlenmiş lipit, kapsüllenmiş floresan boya ve kapsüllenmiş floresan etiketli aktini gözlemlemek için sırasıyla 488 nm, 647 nm ve 561 nm lazer çizgileri kullanın. İlgilendiğiniz kareleri yakalayın ve görüntüleri TIFF formatında kaydedin.
3. ImageJ/Fiji^39'da görüntüleri işleyin ve analiz edin. ImageJ/Fiji'nin yeni kullanıcıları için çevrimiçi bir öğretici mevcuttur (bkz.
   1. ImageJ/Fiji yazılımını kullanarak TIFF dosyasını açın.
   2. Git Görüntü > Parlaklığı / Kontrastı > Ayarla. Minimum ve Maksimum ayarlarını, Parlaklık ve Kontrast kaydırıcılarını ayarlayarak görüntünün parlaklığını ve karşıtlığını istediğiniz ölçeğe ayarlayın.
   3. Araç çubuğundaki Dikdörtgen seçim aracına tıklayın ve ilgilenilen bölgeyi (YG) seçin. YG'yi kırpmak için Görüntü > Kırpma'ya gidin.
   4. Ölçeği Analiz > Ayarla'ya gidin. Açılır pencerede, Piksel En Boy Oranı alanına 1.0 girin ve μm'yi Uzunluk Birimi olarak ayarlayın. Piksel Cinsinden Uzaklık alanına görüntü genişliğini piksel cinsinden girin. Bilinen Uzaklık alanına, gerçek görüntü genişliğini mikron cinsinden girin.
   5. Lipozomun boyutunu ölçmek için, araç çubuğundaki Oval seçim aracını kullanarak, lipozomun kenarı boyunca bir daire çizin. Lipozomun çapının hesaplanabileceği dairenin alanını ölçmek için Analiz > Ölçüm'e gidin.

İnverted emülsiyon tekniğine dayalı lipozomların hazırlanması Şekil 1'de grafiksel ve şematik olarak gösterilmiştir.

İlk olarak, fosfolipid (EPC) ve floresan lipidden (DHPE) oluşan boş (çıplak) lipozomlar (~5-50 μm çapında) hazırlandı. Parlak, çok kırmızı bir floresan boya, bir kontrol deneyi olarak çıplak lipozomların içinde kapsüllendi. Damlacığın periferiğinde bir lipit tek katmanının başarılı bir şekilde oluşup oluşmadığı, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, emülsiyonda floresan boya içeren tek katmanlı lipit damlacıkları gözlemlenerek belirlenebilir. Başarılı lipozom üretimi, konfokal mikroskopi kullanılarak 488 nm lazer altında yeşil-floresan lipit çift katmanlı (DHPE ile lipitlerin konjugasyonu) olan ince dairesel halkanın görselleştirilmesiyle doğrulanabilir (Şekil 2A, en sağdaki panel). Floresan boyanın kapsüllenmesini doğrulamak için, lipozomların iç ortamı, uzak kırmızı floresan boya (Malzeme Tablosu) nedeniyle 647 nm lazer altında düzgün bir şekilde floresan olmalıdır (Şekil 2A; kaplama görüntüsü).

Tek katmanlı lipit damlacığı içindeki farklı kapsüllenmiş aktin formları Şekil 2B'de gösterilmiştir. Soldan sağa doğru görüntüler, küresel aktin (G-aktin), filamentli aktin (F-aktin), aktinin son tampona VCA-His ve membrana Nikel-lipid ilavesiyle ince bir F-aktin tabakası oluşturduğunu ve aktinin son tampona VCA-His, kofilin ve jelsolin ilavesiyle ince bir F-aktin tabakası oluşturduğunu ve membrana Nikel-lipid ilavesiyle aktini göstermektedir.

Daha sonra, saflaştırılmış G-aktin ve ilişkili F-aktin bağlayıcı proteinler lipozom içinde kapsüllendi. Yukarıdaki gibi aynı membran bileşenlerinden oluşan (DHPE ile karıştırılmış EPC), buradaki lipozomlar ~ 5-50 μm çapındaydı. Lipozomların oluşumu, Şekil 3A,B'de gösterilen ince yeşil dairesel halkalarla görselleştirilebilir. Aktin polimerizasyonu, numunenin oda sıcaklığına ısınmasına izin verilerek tetiklendi. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, lipozomların içindeki yeniden yapılandırılmış F-aktin ağları (% 20 floresan etiketli aktin ile) heterojendir ve aktin filamentlerinin dallanmış ağ yapıları olarak kendini gösterir. Dallanmış mimari, VCA-His 40,41,42,43,44,45 ile birlikte aktin filamentlerinin çekirdeklenmesini ve dallanmasını aynı anda kontrol eden Arp2/3 kompleksinin tanıtılmasıyla tetiklendi.

Son olarak, bir F-aktin korteks-biyomimikking sistemi oluşturuldu. Lipozomların çift katmanlı22'sinin iç broşüründe, floresan bir kabuk olarak görselleştirilebilen ince, ancak yoğun dallanmış bir F-aktin tabakası oluşturuldu (Şekil 3C). Bu durumda, ek olarak, VCA-His, kofilin ve jelsolin lipozomlara kapsüllendi. Lipid membranının bileşeninde nikel-lipidler gerekliydi. Bir WASP parçası olan VCA-His, lipit zarının Nikel-lipitleri ile etkileşime giren bir histidin etiketi taşır. Bu arada, Arp2/3 kompleksi 20,46,47,48'i işe alır. Sonuç olarak, Arp2/3 kompleksi tarafından çekirdeklendirilen aktin, kofilin ve jelsolin varlığında membranın iç tabakası boyunca kaplanmış bir F-aktin tabakası oluşturur.

Şekil 1: Ters emülsiyon tekniğine dayalı lipozomların hazırlanması. (A) Lipozom preparatı iki adımdan oluşur. Birinci adım: İlgilenilen proteinleri taşıyan 10 μL Son Tampon (FB) damlacığı, fosfolipit-yağ karışımının 100 μL'sine 1:10 oranında ilave edildi ve bir cam şırınga ile hafifçe yukarı ve aşağı aspire edilerek askıya alındı. Tek katmanlı lipit damlacıkları içeren çözeltiler, ileri geri aspirasyondan sonra beyazımsı hale geldi. İkinci adım: Ayrı bir plastik tüpte, lipit-yağ karışımının birkaç mikrolitresi aynı miktarda OB'nin üzerine yerleştirildi ve OB / yağ arayüzünde bir lipit tek katmanlı geliştirmek için ~ 10 dakika oturmasına izin verildi. Birinci adımdaki emülsiyon, ikinci adımdan itibaren yağ fazının üzerine döküldü ve 4 ° C'de santrifüj edildi (100 x g; 15 dakika). Santrifüjlemeden sonra, üst yağ çözeltisi berrak olmalı ve alt naklen yayın çözeltisi (lipozomlar içeren) hafif bulutlu olmalıdır. (B) Ters çevrilmiş bir emülsiyondan lipozom preparatının şemaları. Üstteki beyazımsı emülsiyon, içinde dallanmış bir aktin ağı içeren tek katmanlı lipit damlacıkları içeriyordu. Santrifüjleme sırasında, tek katmanlı lipit damlacıkları, plastik tüpün dibinde lipozomların oluşturulduğu ve biriktiği bir dış broşür oluşturmak için OB / yağ arayüzünden geçti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Tek katmanlı lipit damlacığının mikroskobik görüntüleri. (A) Emülsiyonda floresan boya içeren tek katmanlı lipit damlacığı. Soldan sağa doğru görüntüler, DIC kanalının altında tek katmanlı bir lipit damlacığı, floresan 640 nm kanal, DIC ve 640 nm kanalının bindirmesi ve floresan 488 nm kanalını göstermektedir. (B) Floresan 561 nm kanal altında tek katmanlı lipit damlacığı içindeki farklı kapsüllenmiş aktin formları. Soldan sağa doğru görüntüler, küresel aktin (G-aktin), filamentli aktin (F-aktin), aktinin Son Tampona VCA-His ve membrana Nikel-lipid ilavesiyle ince bir F-aktin tabakası oluşturduğunu ve aktinin Son Tampona VCA-His, kofilin ve jelsolin ve membrana Nikel-lipit ilavesiyle ince bir F-aktin tabakası oluşturduğunu göstermektedir. Ölçek çubukları 63x büyütmede 10 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Lipozomların içindeki aktin ağlarının kapsüllenmesinin mikroskobik görüntüleri. (A) Polimerize dallı (Arp 2/3 çekirdekli) F-aktin ağını kapsülleyen bir lipozom. Soldan sağa: floresan 488 nm kanal (solda), floresan 561 nm kanal (ortada), bindirme (sağda). (B) Polimerize dallanmış (Arp 2/3 çekirdekli) F-aktin ağlarını kapsülleyen lipozomların süspansiyonlarının temsili bir sonucu. Soldan sağa: floresan 488 nm kanal (solda), floresan 561 nm kanal (ortada) ve bindirme (sağda). (C) Bir lipozomun lipit zarının iç tabakası boyunca kaplanmış ince fakat yoğun bir F-aktin tabakasının oluşumunun ortaya çıkması. Yukarıdan aşağıya: floresan 488 nm kanal (üstte), floresan 561 nm kanal (ortada), bindirme (altta). Ölçek çubukları 63x büyütmede 10 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.