Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

4.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64026

⸱

25 Ağustos 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

Bu makalede

Özet

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

Özet

Hücredeki başlıca mekanik mekanizma olan aktin sitoiskeleti, hücre deformasyonu, bölünme, göç ve yapışma dahil olmak üzere çok sayıda temel fiziksel hücresel aktiviteye aracılık eder. Bununla birlikte, aktin ağının dinamiklerini ve yapısını in vivo olarak incelemek , canlı hücrelerdeki biyokimyasal ve genetik düzenleme ile karmaşıktır. Hücre içi biyokimyasal düzenlemeden yoksun minimal bir model oluşturmak için, aktin dev unilamellar veziküllerin (lipozomlar olarak da adlandırılan GUV'lar) içinde kapsüllenir. Biyomimetik lipozomlar hücre büyüklüğündedir ve sitoiskelet ağının mekanik ve dinamik özelliklerine nicel bir bakış açısı kazandırarak aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji için uygun bir yol açar. Kapsülleme için lipozomlar üretmek için, çeşitli hücre taklit sistemleri hazırlamak için karmaşık çözeltileri lipozomlara kapsüllemek için en başarılı tekniklerden biri olan ters emülsiyon yöntemi (emülsiyon transfer yöntemi olarak da adlandırılır) kullanılır. Bu yöntemle, daha sonra tek katmanlı lipit damlacıkları oluşturmak için fosfolipit içeren bir mineral yağ çözeltisinde emülsifiye edilen iç tampona ilgili proteinlerin bir karışımı eklenir. İstenilen lipozomlar, lipit/yağ-su arayüzünden geçen tek katmanlı lipit damlacıklarından üretilir. Bu yöntem, konsantre aktin polimerlerinin istenen lipit bileşenleri ile lipozomlara kapsüllenmesini sağlar ve biyomimikting bir sitoiskelet ağının in vitro olarak yeniden sulandırılmasının yolunu açar.

Giriş

Aktin sitoiskeleti, moleküler düzeyde kontraktiliteyi ve kuvvet üretimi 1,2,3'ü koordine ederek hücrenin hücre içi mimarisinin oluşturulmasında temel bir rol oynar. Sonuç olarak, hücre deformasyonu4,5, bölüm6, göç 7,8 ve yapışma9 dahil olmak üzere çok sayıda temel hücresel aktiviteye aracılık eder. Aktin ağlarının in vitro yeniden yapılanması son yıllarda10,11,12,13,14,15,16,17 gibi büyük ilgi görmüştür. Yeniden yapılanmanın amacı, canlı hücrelerde var olan karmaşık biyokimyasal düzenlemeden yoksun minimal bir hücre modeli oluşturmaktır. Bu, spesifik hücre içi aktiviteleri araştırmak için kontrol edilebilir bir ortam sunar ve aktin sitoiskeletinin farklı bileşenlerinin tanımlanmasını ve analizini kolaylaştırır18,19. Ayrıca, fosfolipid dev unilamellar veziküller (GUV'ler, lipozomlar) içindeki in vitro aktin ağlarının kapsüllenmesi, yarı geçirgen bir sınıra sahip sınırlı fakat deforme edilebilir bir alan sağlar. 9,20,21,22 hücresi içindeki aktin makinesinin fizyolojik ve mekanik mikro çevresini taklit eder.

Lipozomları hazırlamak için çeşitli yöntemler arasında, lipit filmi hidrasyon yöntemi (şişme yöntemi olarak da bilinir) en eski tekniklerden biridir23. Kuru lipit filmi, tamponların eklenmesiyle hidratlanır ve sonunda vezikül haline gelen membranöz kabarcıklar oluşturur24. Daha yüksek verime sahip daha büyük veziküller üretmek için, elektroformasyon yöntemi25 olarak bilinen film hidrasyon yönteminden ilerleyen geliştirilmiş bir yöntem, hidrasyon işlemini verimli bir şekilde teşvik etmek için bir AC elektrik alanı uygular26. Aktin kapsülleme için bu hidrasyon bazlı yöntemlerin başlıca sınırlamaları, yüksek konsantrasyonlu proteinlerin düşük kapsülleme verimliliğine sahip olması ve sadece spesifik lipit bileşimleri ile uyumlu olmasıdır24. Tersine çevrilmiş emülsiyon tekniği, karşılaştırıldığında, lipit bileşenleri ve protein konsantrasyonları20,27,28,29 için daha az sınırlamaya sahiptir. Bu yöntemde, kapsülleme için bir protein karışımı, daha sonra lipit içeren bir mineral yağ çözeltisinde emülsifiye edilen ve lipit-tek katmanlı damlacıklar oluşturan iç sulu tampona eklenir. Tek katmanlı lipit damlacıkları daha sonra iki katmanlı lipit vezikülleri (lipozomlar) oluşturmak için santrifüjleme yoluyla başka bir lipit / yağ-su arayüzünden geçer. Bu tekniğin aktin kapsülleme24,30 için en başarılı stratejilerden biri olduğu kanıtlanmıştır. Ayrı olarak, darbeli püskürtme31,32, geçici membran ejeksiyonu 33 ve cDICE yöntemi34 dahil olmak üzere bazı mikroakışkan cihaz yöntemleri vardır. Ters emülsiyon yöntemi ile mikroakışkan yöntem arasındaki benzerlikler, kullanılan lipit çözücü (yağ) ve lipozomların dış broşürünün oluşumu için lipit/yağ-su arayüzünün kullanılmasıdır. Buna karşılık, mikroakışkan yöntemle lipozomların üretilmesi, mikroakışkan cihazların kurulmasını gerektirir ve iki katmanın iki yaprağı arasında sıkışmış yağ eşlik eder, bu da yağın çıkarılması için ekstra bir adım gerektirir35.

Bu yazıda, daha önce kullanıldığı gibi polimerize bir F-aktin ağını kapsülleyen lipozomları hazırlamak için ters emülsiyon tekniğini kullandık22. Kapsülleme için protein karışımı ilk önce aktinin küresel (G) formunda kalması için polimerize olmayan koşullara sahip bir tampona yerleştirildi. Tüm işlem, daha sonra numunenin oda sıcaklığına ısınmasına izin verilerek tetiklenen erken aktin polimerizasyonunu önlemek için 4 ° C'de gerçekleştirildi. Oda sıcaklığına ulaştığında, aktin filamentli (F) formuna polimerize olur. Protein işlevlerini ve özelliklerini incelemek için iç sulu tampon çözeltisine çeşitli aktin bağlayıcı proteinler eklenebilir, böylece aktin ağı ve membran yüzeyi ile etkileşimi hakkında daha fazla bilgi sağlar. Bu yöntem aynı zamanda ilgilenilen çeşitli proteinlerin36 ve son lipozomların büyüklüğüne yakın büyük nesnelerin (mikropartiküller, kendinden tahrikli mikroyüzücüler, vb.)kapsüllenmesine de uygulanabilir 28,37.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Tamponların ve protein çözeltilerinin hazırlanması

  1. Sulu İç Polimerizasyon Olmayan (INP) Tamponunu, 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM sakkaroz ve 0,2 mM ATP'yi karıştırarak toplam 5 mL hacimde hazırlayın.
  2. Aşağıdaki konsantrasyonlarda 4 ° C'de INP tamponuna proteinler ekleyerek Protein Karışımını (PM) hazırlayın: 11.2 μM floresan olmayan G-aktin, 2.8 μM floresan etiketli aktin ve 0.24 μM Arp2/3 (Malzeme Tablosu). Bir F-aktin tabakası oluşturmak için, PM'ye 100 nM gelsolin, 4 μM kofilin ve 2.2 μM VCA-His ekleyin. Bir kontrol deneyi olarak, PM'yi 100 μg / mL floresan boya ile değiştirin (Malzeme Tablosu).
  3. Sulu İç Polimerizasyon (IP) Tamponunu (sulu), 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 10 mM ATP ve 80 mM sakkarozu karıştırarak toplam 5 mL hacimde hazırlayın.
  4. İç sulu çözeltiyi lipozom içinde kapsüllenecek toplam 30 μL'lik bir hacimde elde etmek için INP tamponunu (PM içeren) ve IP tamponunu 1: 1 hacim oranında karıştırarak Son Tamponu (FB) hazırlayın.
  5. Sulu Dış Tamponu (OB) 10 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM KCl, 2mM MgCl 2, 0.2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco,212 mM glikoz ve 0.1 mg/mL β kazein karıştırarak toplam 150 μL hacimde hazırlayın.
    NOT: OB'nin ozmolaritesi, OB'nin ozmotik basıncının FB'ninkinden (20-60 mOsm) biraz daha büyük olmasını sağlamak için glikoz ile ayarlanabilir. FB'nin yoğunluğu OB'den biraz daha yüksek olmalıdır.

2. Ters emülsiyon tekniklerine dayalı lipozomların hazırlanması

  1. Lipid-yağ karışımını hazırlayın
    1. Bir cam şişeye 100 μL 25 mg / mL L-α-fosfatidilkolin (% 1 DHPE dahil olmak üzere EPC olarak da adlandırılan floresan olmayan Yumurta PC) ekleyin. Kloroformu argon gazı ile buharlaştırın, şişenin dibinde kuru bir katı lipit filmi (2.5 mg) bırakın.
      1. Bir F-aktin tabakası oluşturmak için, EPC'nin DOGS-NTA-Ni'ye 10: 1 oranında 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n (5-amino-1-carboxypentiyl) iminodiasetik asit] süksinil} nikel tuzu (DOGS-NTA-Ni) ekleyin ve kloroformun buharlaşmasından önce karıştırın.
    2. 2 mL mineral yağ ekleyin ve lipitleri yeniden askıya almak için 1 saat boyunca bir banyoda oda sıcaklığında lipit-yağ karışımını sonikleştirin.
      NOT: Sonikasyondan sonra lipit-yağ karışımı 4 ° C'de 1 hafta boyunca saklanabilir. Kullanımdan önce yeniden sonikasyon önerilir.
  2. İlgilenilen proteini içeren tek katmanlı lipit damlacıkları hazırlamak için yağ (FB / yağ) emülsiyonunda bir Son Tampon hazırlayın.
    1. Plastik bir tüp içinde alınan 100 μL lipit-yağ karışımına, 10 μL FB ekleyin. FB'nin bir damlacıkta olduğundan emin olun.
    2. Bir cam şırınga kullanarak, lipit-yağ-FB karışımını çekin ve emülsifiye etmek için birkaç kez yavaşça yukarı ve aşağı aspire edin; önce az miktarda lipit-yağ karışımı çekin ve daha sonra şırınganın ucunu damlacığın çevresine yerleştirerek FB damlacığını küçük damlacıklara ayırın. Beyazımsı ve bulutlu bir emülsiyon oluşana kadar yukarı ve aşağı aspirasyonu tekrarlayın.
  3. Ayrı bir plastik tüpe 30 μL OB koyun. OB'nin üzerine 30 μL lipit-yağ karışımı yerleştirin ve arayüzde bir lipit tek katmanı geliştirmek için ~ 10 dakika bekletin.
    NOT: Lipitler yüklenmişse veya protein dahil edilmişse, bu adımın süresi38 uzatılmalıdır.
  4. Lipozomları hazırlayın
    1. 50 μL FB/yağ emülsiyonunu (adım 2.2) 2.3. adımdan itibaren tüpün üst yağ fazına dikkatlice ekleyin.
    2. Plastik tüpü 4 °C'de 15 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın. Lipozom oluşumunu optimize etmek için zamanı ve santrifüjleme hızını değiştirin.
      NOT: Santrifüjlemeden sonra, üst yağ fazı açık olmalı ve alt OB (lipozomlar içeren) hafif bulutlu olmalıdır.
    3. Yağ fazını pipetle dikkatlice çıkarın. Gerekirse ekstra hacim aspire edin. Lipozom fazının üstünde bir yağ menisküsü oluşturmamak için pipet ucunu tüpün yanına koymadığınızdan emin olun.
    4. Yeni bir pipetle, pipet ucunu yavaşça kalan alt faza yapıştırın ve lipozomları toplamak için sulu hacmi aspire edin.
      NOT: Hacmi kaybetmek, yağı dahil etmekten daha iyidir. Yağın dahil edilmesi lipozomların yırtılmasına neden olur ve iç bileşenler dış tampona salınır. Makası azaltmak için pipetin ucunu kesin.

3. Mikroskopi gözlemi

  1. Bir kuluçka odasının kuyucuğuna 100 μL OB dökün (12 mm yuvarlak kapaklar içeren 4 delikli plaka). Toplanan lipozomları (adım 2.4.4) yavaşça OB'ye yatırın ve ardından odanın üstüne başka bir örtü parçası yerleştirin.
    NOT: OB, cam yüzeyi pasifleştirmek ve lipozomlar20 arasındaki yapışmayı en aza indirmek için β kazein içerir.
  2. 63x yağ daldırma hedefi kullanarak lipozomları konfokal mikroskopla gözlemleyin. Floresan olarak etiketlenmiş lipit, kapsüllenmiş floresan boya ve kapsüllenmiş floresan etiketli aktini gözlemlemek için sırasıyla 488 nm, 647 nm ve 561 nm lazer çizgileri kullanın. İlgilendiğiniz kareleri yakalayın ve görüntüleri TIFF formatında kaydedin.
  3. ImageJ/Fiji39'da görüntüleri işleyin ve analiz edin. ImageJ/Fiji'nin yeni kullanıcıları için çevrimiçi bir öğretici mevcuttur (bkz.
    1. ImageJ/Fiji yazılımını kullanarak TIFF dosyasını açın.
    2. Git Görüntü > Parlaklığı / Kontrastı > Ayarla. Minimum ve Maksimum ayarlarını, Parlaklık ve Kontrast kaydırıcılarını ayarlayarak görüntünün parlaklığını ve karşıtlığını istediğiniz ölçeğe ayarlayın.
    3. Araç çubuğundaki Dikdörtgen seçim aracına tıklayın ve ilgilenilen bölgeyi (YG) seçin. YG'yi kırpmak için Görüntü > Kırpma'ya gidin.
    4. Ölçeği Analiz > Ayarla'ya gidin. Açılır pencerede, Piksel En Boy Oranı alanına 1.0 girin ve μm'yi Uzunluk Birimi olarak ayarlayın. Piksel Cinsinden Uzaklık alanına görüntü genişliğini piksel cinsinden girin. Bilinen Uzaklık alanına, gerçek görüntü genişliğini mikron cinsinden girin.
    5. Lipozomun boyutunu ölçmek için, araç çubuğundaki Oval seçim aracını kullanarak, lipozomun kenarı boyunca bir daire çizin. Lipozomun çapının hesaplanabileceği dairenin alanını ölçmek için Analiz > Ölçüm'e gidin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İnverted emülsiyon tekniğine dayalı lipozomların hazırlanması Şekil 1'de grafiksel ve şematik olarak gösterilmiştir.

İlk olarak, fosfolipid (EPC) ve floresan lipidden (DHPE) oluşan boş (çıplak) lipozomlar (~5-50 μm çapında) hazırlandı. Parlak, çok kırmızı bir floresan boya, bir kontrol deneyi olarak çıplak lipozomların içinde kapsüllendi. Damlacığın periferiğinde bir lipit tek katmanının başarılı bir şekilde oluşup oluşmadığı, Şekil 2A'da

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Birkaç önemli adım, hazırlık sürecinde yüksek miktarda lipozomun başarısını belirler. Lipit filmini yağda tamamen çözmek için, cam şişenin altındaki lipit filmi tamamen kaybolana kadar numune sonikleştirilmelidir. Sonikasyondan sonra, lipit-yağ karışımı, lipit moleküllerinin daha fazla dağılması için karanlık koşullar altında oda sıcaklığında gece boyunca saklanmalıdır29. Karışım 4 ° C'de bir haftaya kadar saklanabilir. İlgilenilen proteini içeren tek katmanlı lipit damlacıkları ile bir FB / yağ e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

ARO MURI W911NF-14-1-0403'ün M.P.M.'ye, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 1R01GM126256'dan M.P.M.'ye, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, Michigan Üniversitesi / Genentech, SUBK00016255 ve İnsan Sınırları Bilim Programı (HFSP) hibe numarası RGY0073/2018'den M.P.M.'ye fon sağladığını kabul ediyoruz. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya öneri yazar(lar)a aittir ve mutlaka ARO, NIH veya HFSP'nin görüşlerini yansıtmaz. S.C., V. Yadav, C. Muresan ve S. Amiri ile verimli tartışmalar yaptığını kabul eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,2-dioleoil-sn-glisero-3-{[n(5-amino-1-karboksipentil)iminodiasetik asit]süksinil} nikel tuzu (DOGS-NTA-Ni) Avanti Polar Lipidler A.Ş.231615773Nikel Lipid
1,4-Diazabisiklo [2.2.2] oktanSigmaD27802-25GDABCO
Aktin proteini (% >99 saf): tavşan iskelet kasıHücre iskeleti, IncAKL99-Dfloresan olmayan G-aktin
Aktin proteini (rodamin): tavşan iskelet kasıCytoskeleton, IncAR05floresan etiketli aktin
Adenozin 5 ve prime; -trifosfat disodyum tuzu hidratSigmaA2383-10GATP
Alexa Fluor 647 boyaThermoFisherfloresan boya
Andor iQ3Andor Technologieskonfokal mikroskop için kontrol ve edinim yazılımı
Arp2/3 Protein Kompleksi: Domuz BeyinHücre İskeleti, IncRP01P-AArp 2/3
Kalsiyum klorür dihidratSigma10035048CaCl2
Chamlide Odaları (12 mm yuvarlak lamel için 4 kuyulu)Quorum Technologieskuluçka odası
Kofilin proteini: insan rekombinantCytoskeleton, IncCF01-Ckofilin
Konfokal Mikroskop (63 kez; yağa daldırma objektifi)Andor TechnologiesLEICA DMi8
D-(+)-GLUKOZ BIOXTRASigmaG7528glikoz
DithiothreitolDOT Scientific DSD11000-10DTT
Jelsolin Proteini: Homo Sapiens RekombinantHücre İskeleti, IncHPG6jelsolin
Hamilton 1750 Gaz Geçirmez Şırınga, 500 ve mikro; L, çimentolu iğne, 22 G, 2" konik uçluCole-ParmerUX-07940-53cam şırınga
HEPESAmericanBio7365-45-9
ImageJ/Fijihttps://imagej.net/tutorials/
L-alfa-FosfatidilkolinAvanti Polar Lipids Inc.97281442
EPC Magnezyum klorürSigma7786303MgCl2
Mineral yağ, BioReagent, moleküler biyoloji için, hafif yağSigma8042475mineral yağ
N-WASP parçası WWA (aa400– 501, VCA-His)VCA-His, laboratuvar protokolü kullanılarak saflaştırılır. Protokol makul talepler üzerine sağlanabilir
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Fosfoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)Thermo FisherO12650DHPE
Potasyum klorürSigma7447407KCl
SükrozSigma57-50-1sükroz
ve beta; - Sığır sütünden kazeinSigmaC6905-250MG
:

Kaynaklar

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103(2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745(2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103(2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282(2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245(2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243(2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ters Emülsiyon YöntemiLipozom EnkapsülasyonuHücre İskeleti RekonstitüsyonuKonfokal MikroskopiAktin Ağı DinamikleriARP2/3 KompleksiFloresan EtiketlemeSentetik Hücre Modeli
İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.