Yöntem makalesi

Kriyo-Elektron Mikroskobu Yapısal Tayini için DNA Onarım Faktörleri ile Komplekslenmiş Nükleozom Çekirdek Parçacıklarının Hazırlanması

DOI:

10.3791/64061

⸱

17 Ağustos 2022

 ,  ,  ,  , 
1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, TEM ızgaralarının dondurulması için iki numune hazırlama yöntemi kullanılarak nükleozomal komplekslerin hazırlanmasını ayrıntılı olarak özetlemektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromatin bağlamında DNA onarımı tam olarak anlaşılamamıştır. Kromatinin temel tekrarlayan birimi olan nükleozom çekirdek parçacıklarını kullanan biyokimyasal çalışmalar, çoğu DNA onarım enziminin DNA hasarını serbest DNA'ya kıyasla daha düşük oranlarda giderdiğini göstermektedir. Baz eksizyon onarımı (BER) enzimlerinin nükleozomlardaki DNA hasarını nasıl tanıdığı ve giderdiğine dair moleküler detaylar açıklığa kavuşturulmamıştır. Bununla birlikte, nükleozomal substratların biyokimyasal BER verileri, nükleozomun DNA lezyonunun ve enzimin konumuna bağlı olarak farklı yapısal bariyerler sunduğunu göstermektedir. Bu, serbest DNA'daki DNA hasarını gidermek için bu enzimler tarafından kullanılan mekanizmaların, nükleozomlarda kullanılanlardan farklı olabileceğini göstermektedir. Genomik DNA'nın çoğunluğunun nükleozomlara monte edildiği göz önüne alındığında, bu komplekslerin yapısal bilgisine ihtiyaç vardır. Bugüne kadar, bilimsel topluluk, bu komplekslerin teknik olarak uygulanabilir yapısal çalışmalarını gerçekleştirmek için ayrıntılı protokollerden yoksundur. Burada, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) yapısal tayini için nükleozomun giriş-çıkışına yakın tek bir nükleotid boşluğuna bağlı iki genetik olarak kaynaşmış BER enziminden (Polimeraz β ve AP Endonükleaz1) oluşan bir kompleks hazırlamak için iki yöntem sunuyoruz. Her iki numune hazırlama yöntemi de daldırma dondurma yoluyla kaliteli ızgaraları vitrifiye etmek için uyumludur. Bu protokol, farklı BER faktörleri, öncü transkripsiyon faktörleri ve kromatin modifiye edici enzimlere sahip diğer nükleozomal kompleksleri hazırlamak için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotik DNA, histon proteinleri tarafından organize edilir ve sıkıştırılır ve kromatin oluşturur. Nükleozom çekirdek parçacığı (NCP), DNA onarımı, transkripsiyon ve replikasyon1 için DNA bağlayıcı proteinlere erişilebilirliği düzenleyen kromatinin temel tekrarlayan birimini oluşturur. NCP'nin ilk X-ışını kristal yapısı ilk olarak yirmi yıldan daha uzun bir süre önce çözülmüş olmasına rağmen2 ve NCP'nin daha birçok yapısı 3,4,5,6'dan beri yayınlanmış olmasına rağmen, nükleozomal substratlardaki DNA onarım mekanizmaları henüz tanımlanmamıştır. Kromatinde DNA onarımının altında yatan moleküler detayların ortaya çıkarılması, NCP'nin yerel yapısal özelliklerinin DNA onarım aktivitelerini nasıl düzenlediğini anlamak için katılımcı bileşenlerin yapısal karakterizasyonunu gerektirecektir. Bu, baz eksizyon onarımı (BER) bağlamında özellikle önemlidir, çünkü BER enzimleri ile yapılan biyokimyasal çalışmalar, kataliz için enzime özgü yapısal gereksinimlere ve DNA lezyonunun nükleozom içindeki yapısal konumuna bağlı olan nükleozomlarda benzersiz DNA onarım mekanizmaları önermektedir 7,8,9,10,11,12,13 . BER'in hayati bir DNA onarım süreci olduğu göz önüne alındığında, bu boşlukları doldurmaya ve aynı zamanda ilgili nükleozomal kompleksleri içeren diğer teknik olarak uygulanabilir yapısal çalışmaların gerçekleştirilebileceği bir başlangıç noktası oluşturmaya büyük ilgi vardır.

Cryo-EM, homojen numunenin büyük ölçekli hazırlanması zor olan komplekslerin üç boyutlu (3D) yapısını çözmek için hızla tercih edilen yöntem haline gelmektedir. Bir DNA onarım faktörü (NCP-DRF) ile kompleksleştirilmiş NCP'lerin tasarımı ve saflaştırılması muhtemelen özel optimizasyon gerektirecek olsa da, kararlı bir NCP-DRF kompleksi oluşturmak ve dondurmak için burada sunulan prosedür, numunenin ve kriyo-EM ızgara hazırlığının nasıl optimize edileceği hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Şekil 1'de gösterilen iki iş akışı (birbirini dışlamayan) ve protokoldeki belirli ayrıntılar kritik adımları tanımlar ve bu adımları optimize etmek için stratejiler sağlar. Bu çalışma, kromatin ve DNA onarım alanını, nükleozomal DNA onarımının moleküler mekanizmalarını daha iyi anlamak için biyokimyasalın yapısal çalışmalarla tamamlanmasının teknik olarak mümkün olduğu bir yönde ilerletecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nükleozom çekirdek parçacıklarını tuz-gardient diyalizi yoluyla birleştirin

NOT: Yapısal çalışmalar için rekombinant histon proteinleri kullanılarak nükleozom çekirdek parçacıklarının hazırlanması, diğerleri tarafından ayrıntılı olarak tanımlanmıştır14,15,16. Diğerleri tarafından tanımlanan rekombinant X. laevis histonlarının ve histon oktamer düzeneğinin saflaştırılmasını takip edin14,15 ve nükleozomal substratı aşağıda açıklandığı gibi birleştirin.

  1. Belirtilen ölçekte üç oligonükleotid ( Tablo 1'de listelenmiştir) satın alın: UND-197mer, 161mer, 35mer.
    1. PAGE,17'i açıklandığı gibi ultramerleri (197mer ve 161mer) saflaştırır.
      1. 1x tavlama tamponunda tavsal equimolar oligonükleotid miktarları (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl). Örneğin, 40 μL 161-mer [166,7 μM]; 8 μL 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL 197-mer comp ipliği [408,2 μM]; 10 μL 10x tavlama tamponu ve 10,9 μL dH2O.
        NOT: Tavlama reaksiyonunu bir sıcaklık gradyanı ile kontrol etmek çok önemlidir. Sıcaklık gradyanı ile ilgili ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın.
  2. DNA'nın histon oktamerine oranını belirlemek için küçük ölçekli sulandırmalar (50 μL'lik son hacim için aşağıda gösterilen örneğin 1/57'si ile ölçeklendirin) uygulayın (DNA: oktamer'in tipik başlangıç oranları aşağıdaki gibidir: 1: 0.9, 1: 1.1, 1: 1.2, 1: 1: 2, 1: 2; Şekil 2A'da gösterilmiştir); Bu oranın küçük ölçekli yeniden yapılanmalarla ampirik olarak belirlenmesi kritik öneme sahiptir.
    1. Bu oran belirlendikten sonra, büyük ölçekli bir yeniden yapılanma hazırlayın. Örneğin, 32.9 μL DNA-197 bp [99.4 μM] karıştırın; 1647,1 μL TE (1x); 1120 μL 5 M NaCl ve 62.3 μL WT histon oktamer [2.56 μM].
  3. Diyaliz tamponlarını yapın: RBsırasıyla Tablo 3 ve Tablo 4'te açıklandığı gibi düşük ve RByüksek; daha önce açıklandığı gibi yeniden yapılanmaları kurmak14.
    1. Diyaliz tüpünü RByüksekliği içeren beherin içine aktarın ve diyalizin hafifçe karıştırarak 16 saat boyunca veya 2 L RBdüşük atık kabına aktarılana kadar devam etmesine izin verin.
  4. Diyaliz tüpünü RB50mM tampon içeren 1 L'lik bir behere aktarın (Tablo 5) ve numunenin en az 3 saat veya gece boyunca diyalize girmesine izin verin.
    1. %6'lık bir poliakrilamid denatüre olmayan jel üzerinde sulandırma verimliliğini değerlendirerek,% 10'dan az serbest DNA ve tek bir NCP bandı olmasını sağlamak; NCP'leri 4 °C'de saklayın. Temsili optimal sulandırma sonuçları için Şekil 2A (şerit 5) ve Şekil 2B'ye bakınız.

2. NCP-DNA onarım faktörü kompleksi (NCP-DRF) hazırlayın

  1. Hazırlayıcı jel elektroforezi ile saflaştırma
    NOT: Bu yöntem en emek yoğun olanıdır (tarif edilen ikisinden) ve yüksek moleküler ağırlıklı (HMW) türlerin (Şekil 6A) yüksek seyreltme faktörü nedeniyle, aşağıda gösterildiği gibi bazı sökülmelere neden olabilir. Şekil 7A (NCP hazırlık hücresi çıkış şeridi), DNA'yı serbest bırakır. Bununla birlikte,% 25'e kadar serbest DNA hala kriyo-EM çalışmaları ile uyumludur. Yüksek seyreltme nedeniyle, tüm kompleks yerine yalnızca NCP'yi saflaştırmak için bu yöntemi kullanın.
    1. Poliakrilamid jel çözeltisi 37.5: 1, akrilamid: bisakrilamid kullanarak, 0.2x TBE'de% 6 denatüre edici olmayan poliakrilamid jel çözeltisinin 70 mL'sini hazırlayın. Dış yarıçapı 28 mm olan silindirik bir jel dökün ve gece boyunca polimerize edin.
    2. Hazırlayıcı jel çalıştırma aparatını, 6-8 kDa MW kesimli bir diyaliz membranı kullanarak monte edin. Çalışan arabellek olarak 0,25x TBE ve 1x elüsyon arabelleği (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5) kullanın. Silindirik jeli 1 saat boyunca sabit bir 12 W'ta önceden çalıştırın ve peristaltik pompayı yaklaşık 1 mL / dak akış hızında çalıştıran fraksiyonları toplayın.
      NOT: DNA içeren fraksiyonları tanımlamak için bir UV dedektörü mevcut değilse, ilgilenilen fraksiyonları tanımlamak için 32P-NCP ile bir tarama deneyi yapılabilir. Tüm koşulları aynı tutarak, etiketsiz NCP'ler daha sonra bir UV dedektörü olmadan saflaştırılabilir.
    3. Bir santrifüj filtre kullanarak 2,8 mL NCP'yi 250 μL'ye konsantre edin (MW kesme 30 kDa) ve toplam 6 saat boyunca hazırlayıcı jel ve elektrofore üzerine yükleyin. 2 saatte, ksilen siyanol jelden tükendiğinde, 1.5 mL fraksiyonları toplamaya başlayın.
      NOT: 2.5 saatte, fraksiyonlar ksilen siyanolden temizlenecektir; DNA (197mer) yaklaşık 3-3.5 saatte ortaya çıkar ve NCP'nin 4.5-5 saat işaretinde ortaya çıkması beklenir.
    4. % 6'lık bir denatüre edici olmayan poliakrilamid jel üzerindeki ilgi fraksiyonlarını analiz edin. NCP içeren havuz fraksiyonları ve hemen bir santrifüj filtre (MW kesme 30 kDa) ile 1 mg / mL'ye konsantre edin. Ertesi gün, ilgilenilen DNA onarım faktörü (DRF) ile kompleksleşmeden önce% 6 poliakrilamid denatüre olmayan jel üzerinde NCP'nin kalitesini değerlendirin.
    5. NCP'yi ve DRF'yi buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin, spesifik kompleks için en uygun tamponu kullanın. Örneğin, 1.000 μL NCP [1,2 μM] karıştırın; 260 μL 5x bağlama tamponu (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL 3 M KCl ve 18 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM].
      NOT: Kompleksin yapıldığı sıcaklık ve iyonik mukavemet, farklı kompleksler için optimizasyona ihtiyaç duyabilir.
    6. Glutaraldehit ekleyin (taze açılmış; EM notu)% 0.005'lik bir nihai konsantrasyona. Bu nedenle, bu reaksiyona, 13.2 μLdH2O ile 26.8 μL% 0.25 glutaraldehit ekleyin İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 13 dakika boyunca inkübe edin.
    7. 1 M Tris-Cl, pH 7.5 ile 20 mM Tris-Cl, pH 7.5'lik nihai konsantrasyona kadar söndürün. ~50 μL'ye kadar konsantre edin ve tamponu 1x dondurma tamponu ile değiştirin: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 tuzdan arındırma sütunu kullanarak.
      DİKKAT: Glutaraldehit ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir; Yutulması halinde zararlıdır ve solunması halinde toksiktir. Bir laboratuvar önlüğü, gözlük, eldiven giyin ve glutaraldehiti duman başlığında tutun ve maske takın.
      NOT: Çapraz bağlama reaksiyonunu NCP ile bu düşük konsantrasyonda büyük bir hacimde gerçekleştirmek çok önemlidir. Bu glutaraldehit konsantrasyonunda bile, ancak 10 kat daha yüksek konsantre NCP'de bile, önceki çapraz bağlama girişimleri, numunenin toplanmasına ve SDS PAGE ve boyut dışlama kromatografisinde belirtildiği gibi aşırı çapraz bağlanmaya yol açmıştır. Bu ızgaraların sadece kümelere sahip ayırt edilebilir parçacıkları yoktu (Şekil 5D, E).
    8. OD280 ve OD 260'taki absorbansları belirleyin ve OD 280'e dayanarak 1.3-3 mg / mL'ye ulaşmak için gerekirse daha fazla konsantre edin (OD260 / OD 280 = 1.7-2'nin tipik oranı iyi parçacıklar verir). 50 μL'lik bu küçük hacim için, numune kaybını azaltmanın en iyi yöntemi, bir diyaliz membranı ile kaplı 1,7 mL'lik bir tüpün kapağına sahip bir diyaliz düğmesi yapmak (6-8 kDa MW kesme), tüpün tabanını kesmek ve zarı kapağın üstüne kapatmak için tüpün kenarını kullanmaktır.
    9. Numuneyi içeren diyaliz düğmesini, membran aşağı bakacak şekilde bir polietilen glikol yatağının üzerine yerleştirin (her 2 dakikada bir ilerlemeyi kontrol edin). Bu yöntem, konsantratördeki numunenin seyreltilmesini veya kaybolmasını önlemek için ihtiyaç duyulan konsantrasyonun 2,5 kattan az veya 2,5 kata eşit olduğu durumlarda tercih edilir. Bu adımdan sonra kompleksin kriyo-EM ızgaralarını hemen hazırlamak çok önemlidir.
  2. Boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırma
    1. Donmadan önceki gün, bir boyut dışlama kolonunu 60 mL dH2O ile yıkayın ve dengeleyin, ardından 80 mL dondurma tamponu (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) gece boyunca 0,4 mL / dak hızında yıkayın ve dengeleyin. NCP'leri sulandırmadan hemen sonra kullanarak, aynı kompleksi aşağıdaki gibi 2,5 kat daha fazla miktarda kullanarak hazırlayın: 2.500 μL NCP [1.2 μM] karıştırın; 650 μL 5x bağlama arabelleği; 45 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM] ve 55 μL 3M KCl.
    2. Karışımı çapraz bağlayıcı olmadan buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, preparatif jel yönteminde tarif edildiği gibi% 0.005'lik bir nihai konsantrasyona glutaraldehit ekleyin. Bununla birlikte, bu durumda, kompleksi yaklaşık 120 μL'ye kadar önceden dengelenmiş (dondurucu tamponlu) bir santrifüj filtrede yoğunlaştırın.
    3. Tepe fraksiyonlarını hemen analiz edin ve daha önce belirtildiği gibi histonları ve MBP-Pol β-APE1'i içeren fraksiyonları konsantre edin. Boyut dışlama yöntemini kullanarak başarılı sonuçlar için Şekil 5A,B,C'ye ve her iki yöntemi kullanarak Şekil 7'ye bakın.

3. Nükleozomal kompleksi dondurun

  1. Daldırma dondurucuyu açtıktan ve nemlendiriciyi 50 mL dH2 O ile doldurduktan sonra, oda sıcaklığını22° C'ye ve HR'yi (nem)% 98'e ayarlayın. Etan kabını ve sıvı azot kabını (etiketli bir ızgara kutusu içeren) ilgili alan tutucularına yerleştirin.
  2. Etan kabını etan kapağı dağıtıcısı ile örtün ve üzerine dikkatlice sıvı azot (LN2) dökün, aynı zamanda LN 2 kabını LN2 ile doldurun. LN2 seviyesi stabilize olduğunda ve% 100'e ve -180 ° C'lik bir sıcaklığa ulaştığında, etan valfini dikkatlice açın ve etan kabını şeffaf kapakta bir kabarcık oluşturana kadar doldurun. Etan dağıtıcıyı çıkarın.
  3. Kurutma cihazına iki filtre kağıdı yerleştirin ve bunları metal bir halka ile sabitleyin. Kuruluma gidin ve lekeleme için aşağıdaki parametreleri kullanın: 0 leke öncesi, 3 s leke, 0 leke sonrası; A-plunge'u seçin ve Tamam'a tıklayın.
  4. Ana ekranda, Forseps Yükle'ye tıklayın ve bunları karbon / uygulama tarafı sola bakacak şekilde (daha önce olduğu gibi hazırlanmış) bir ızgara ile yükleyin. Forsepsleri kalibre edin, katı bir leke sağlamak için Z eksenini ayarlayın. Alt Odacık'a tıklayın ve kompleksin 3 μL'sini (1.3-3 mg / mL; OD280). Blot/A-plunge'a tıklayın. Bu, ızgarayı önden lekelenmek üzere döndürecek ve donduracaktır.
  5. Izgarayı LN2 odasındaki ızgara kutusuna aktarın ve saklayın. Dört ızgaranın tümü dondurulduğunda ve ızgara kutusuna yerleştirildiğinde, kapağı tüm ızgaraların kapakla kaplandığı nötr konuma döndürün ve vidayı sıkın. Izgaralar, tarama başlatılana kadar LN2'de saklanabilir.

4. Ekran ızgaraları

  1. Numuneleri mikroskopa yüklemeden önce, vitrifiye ızgaraları bir halka üzerine yerleştirin ve bir C-klipsi kullanarak sabitleyin. Buz kontaminasyonunu önlemek için bu kırpma işlemini LN2 altında nem kontrollü bir odada gerçekleştirin.
  2. Mikroskopu yüklerken, ızgaraları 12 yuvalı bir kasete yerleştirin. Kaseti bir nanocab kapsülüne yerleştirin ve otomatik yükleyiciye yükleyin. Otomatik yükleyici robotik mekanizması işlemi başlatır.
  3. Izgarayı kasetten mikroskop aşamasına aktarın. Sahneyi 10° sallayarak ve aynı anda görüntülerde minimum düzlemsel kayma gözlenene kadar Z yüksekliğini hareket ettirerek sahne alanını ösentrik yüksekliğe ayarlayın.
  4. Ösentrik yüksekliğe ulaşıldığında, görüntülemeye başlayın. İlk olarak, her montajın 62x büyütmede çekildiği ızgaranın 3 x 3 montaj görüntüsünü alarak atlası elde edin. Farklı boyutlarda üç kare seçin; Ösentrik yüksekliği alın ve ardından 210x büyütmede görüntü alın.
  5. Bir kare görüntülendikten sonra, karelerin kenarından, ortasından ve aralarından birer delik seçin. Her deliği 2600x büyütmede görüntüleyin.
  6. Bu yüksek büyütmeli görüntüyü çekmeden önce, otomatik odaklama görüntüleme alanının bir ofsetinde gerçekleşir. Yüksek büyütmeli görüntüyü deliğin merkezinden 36.000x büyütme ve 7,1 s pozlama süresinde, 60 karede, 1,18 piksel boyutunda ve 3 μm bulanıklaştırmada çekin. Şekil 5, Şekil 6 ve Şekil 7'deki temsili tarama görüntülerine bakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MBP-Polβ-APE1'in rekombinant füzyon proteini ile bir kompleks yapmak için uygun şekilde monte edilmiş NCP'ler (Şekil 2) kullanıldı (Şekil 3). NCP'nin MBP-Polβ-APE1'e oranını kararlı bir kompleks oluşturmak için belirlemek için, NCP'nin MBP-Polβ-APE1'in 5 kat azı dişi fazlalığı ile tek başına kaymış bir bandını gösteren elektroforetik hareketlilik kayma testleri (EMSA) (Şekil 4) gerçekleştirdik. Bu kompleksin optimizasyonu sırasında,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA onarım faktörünü saflaştırmak için özel bir protokol, ilgilenilen enzime bağlı olacaktır. Bununla birlikte, protein ekspresyonu ve saflaştırma için rekombinant yöntemlerin kullanılması da dahil olmak üzere bazı genel öneriler vardır18; İlgilenilen protein çok küçükse (<50 kDa), kriyo-EM ile yapı tayini, füzyon sistemleri19, nanogövde bağlayıcı iskeleler20 ve görüntüleme stratejilerinin optimize edilmesi21 ile daha yakın za...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü'ndeki cryo-EM çekirdeğinden Dr. Mario Borgnia'ya ve Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'nden Dr. Joshua Strauss'a kriyo-EM ızgara hazırlığındaki mentorlukları ve eğitimleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende'ye bu projenin ilk aşamalarındaki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Merhum Dr. Samuel H. Wilson ve laboratuvar üyelerinin, özellikle de Dr. Rajendra Prasad ve Dr. Joonas Jamsen'in genetik olarak kaynaşmış APE1-Polβ kompleksinin saflaştırılması için kilit katkılarını ve desteklerini takdir ediyoruz. Araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir [hibe numaraları Z01ES050158, Z01ES050159 ve K99ES031662-01].

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 M HEPES; pH 7.5Thermo Fisher Scientific15630080
1 M MgCl2Thermo Fisher ScientificAM9530G
10x TBEBio-rad1610733
%25 glutaraldehitFisher Scientific50-262-23
3 M KClTermo Fisher Scientific043398.K2
491 hazırlık hücresiBio-rad1702926
Amicon Ultra 15 santrifüj filtre (MW kesme 30 kDa)Millipore SigmaZ717185
Amicon Ultra 4 santrifüj filtre (MW kesme 30 kDa)Millipore SigmaUFC8030
AutoGrid CımbızTed Pella47000-600
Otomatik Dalma DondurucuLeicaLeica EM GP
C-1000 dokunmatik termodöngüleyiciBio-rad1851148
C-klipsler ve halkalarThermo Fisher6640--6640
Kırpma istasyonuSubAngostromSCT08
Diyaliz Membranı (MW cufoff 6-8 kDa)Fisher Scientific15370752
Elmas CımbızTechni-Pro758TW0010
dsDNAEntegre DNA TeknolojilerN/A
FEI Titan KriosThermo FisherKRIOSG4TEM
FPLC arıtma sistemiAKTA Saf29018224
Fraksiyon toplayıcı Model 2110Bio-rad7318122
Kızdırma Deşarjı Temizleme SistemiTed Pella91000S
Izgara KutularıSubAngostromPB-E
Izgara Depolama Aksesuar PaketiSubAngostromGSAX
Sıvı EtanN/AN/A
Sıvı NitrojenN/AN/A
Minipuls 3 peristaltik iki kafalı pompaGilsonF155008
NanodropThermo Fisher ScientificND-2000
Novex %16, Trisin, 1.0 mm, Mini Protein JelleriTermo Fisher ScientificEC6695BOX
PipetmanGilsonFA10002M
Pipet uçları (VWR) Düşük TutmaVWR76322-528
Poliakrilamid jel çözeltisi (37.5:1)Bio-rad1610158
polietilen glikol (PEG)Millipore SigmaP4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500Millipore Sigma
Saflaştırılmış rekombinant DNA onarım faktörüN/AN/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh IzgaralarQuantifoilN1-C14nCu30-01
Rekombinant histon oktamerN/AN/A
Yaylı kırpma araçlarıSubAngostromCSA-01
Superdex 200 sütun 10/300Millipore SigmaGE28-9909-44
Transmisyon Elektron MikroskobuThermo FisherTalos Arctica 200 kV
Cımbız Komplesi FEI Vitrobot Mark IV-ITed Pella47000-500
UltraPure GliserolThermo Fisher Scientific15514011
VitrobotThermo FisherMark IV Sistemi
Whatman Filtre kağıdı (55 mM)Cytiva1005-055
Ksilen siyanolThermo Fisher Scientific440700500
Zeba Mikro Spin Tuz Giderme Kolonları, 7K MWCO, 75 & LTermo Balıkçı Bilimsel89877
PURX35050

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
  4. Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
  5. Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
  6. McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
  7. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
  8. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
  9. Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
  10. Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
  11. Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
  12. Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
  13. Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
  14. Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  15. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
  16. McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
  17. Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
  18. Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
  19. Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909(2016).
  20. Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118(2021).
  21. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).
  22. Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255(2018).
  23. Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Baz Eksizyon Onar mKromatin Yap sNumune Haz rlamaBoyut Ay rma KromatografisiElektroforetik Mobilite Kaymasapraz Ba lanma Ko ullarok Dondurma

İlgili makaleler