Kabakta Interspesifik Hibridizasyon için Embriyo Kurtarma Protokolü

Cucurbita (2n = 40), Cucurbitaceae familyasında, beşi^1'i evcilleştirilmiş 27 farklı tür içeren oldukça çeşitli bir cinstir. Bunlar arasında, Cucurbita moschata, C. pepo ve C. maxima dünya çapında ekonomik açıdan en önemli olanlardır. ABD'de, C. moschata ve C. pepo, tarımsal üretimdeki en önemli iki türdür. C. pepo, crookneck, straightneck, meşe palamudu, tarak, cocozelle, sebze iliği, kabak ve balkabağı^2,3,4,5'in hem yaz hem de kış kabak çeşitlerini içeren dört alt türden (ovifera^, pepo^, kardeşlik ve gumala) oluşur. C. moschata öncelikle butternut, Dickinson ve peynir grubu¹ dahil olmak üzere kış kabağı pazar türlerinden oluşur. İki tür morfolojik ve fenotipik olarak çeşitlidir, C. pepo verimi, erkenciliği, çalı büyüme alışkanlığı ve meyve şekli, meyve büyüklüğü, et rengi ve kabuk deseni gibi çeşitli meyve özellikleri ile kabul edilir. Öte yandan, C. moschata, ısıya ve neme adaptasyonunun yanı sıra hastalık ve haşere direnci ^6,7 için de ödüllendirilmiştir. C. moschata ve C. pepo arasındaki interspesifik hibridizasyon, sadece iki tür arasında arzu edilen özelliklerin tanıtılması için önemli bir strateji değil, aynı zamanda ıslah programlarında genetik tabanın genişletilmesine de izin verir ^7,8.

C. moschata ve C. pepo arasındaki erken geçişler, uyumluluklarını ve / veya taksonomik bariyerlerini belirlemek için yapılmıştır^9,10,11, daha sonraki çalışmalar çoğunlukla arzu edilen özelliklerin aktarılmasına odaklanmıştır^12,13,14. İki tür arasındaki interspesifik hibridizasyon, bir çalı veya yarı çalı büyüme alışkanlığı gibi yeni özelliklerin transferini ve C. pepo'dan elde edilen verimin artmasını, hastalık direncini, abiyotik strese adaptasyonu ve C. moschata^14,15,16'dan artan canlılığı hedeflemiştir. Örneğin, C. pepo (P₅) ve C. moschata (MO₃) arasındaki spesifik haçlar daha yüksek meyve verimi 13 ile sonuçlanırken, C. moschata katılımları (Nijerya Yerel ve Menina), ekili C. pepo çeşitlerinde potyvirüslere karşı birincil direnç kaynağı olarak yaygın olarak kullanılmıştır^17,18.

Önceki çalışmalar, C. moschata ve C. pepo arasındaki hibridizasyonun mümkün ancak zor olduğunu göstermiştir^8,15. Spesifik haçlar meyve setinin (kürtaj), canlı tohumlardan yoksun partenokarpik meyvelerin (boş tohumlar), olgunlaşmamış embriyoların gelişemediği çekirdeksiz meyvelerin (stenospermokarpi) veya embriyo kurtarma yoluyla olgun bitkilere kurtarılabilecek az sayıda olgunlaşmamış embriyoya sahip meyvelerin^15,16 ile sonuçlanmasına neden olabilir. Örneğin, C. pepo'yu (sofra kraliçesi, anne) C. moschata (büyük peynir, baba) ile geçerek canlı tohumlar elde edilmedi, ancak karşılıklı haç 134 tozlaşmadan 57 canlı tohum verdi⁹. Hayase, C. moschata ve C. pepo haçlarından canlı tohumlar elde etti, ancak haçlar gece^19'da 10 ° C'de depolanan polenler kullanılarak sabah 04: 00'te yapıldığında. Baggett, C. pepo (delicata) ile sekiz farklı C. moschata çeşidini geçti ve toplam 103 tozlaşmadan normal görünen 83 meyvenin elde edildiğini, ancak hiçbirinin canlı tohum^{içermediğini} bildirdi. C. pepo (S179) ve C. moschata (NK) arasındaki bir haçta, Zhang ve ark. 2.994 tohumla 15 meyve elde ettiler, ancak bu tohumlardan sadece 12'si yaşayabilirken, geri kalanlar sadece ilkel gelişim gösterdi. Bu çalışmalar, C. moschata ve C. pepo arasındaki interspesifik geçişin oldukça faydalı olmasına rağmen, haçlardan canlı tohumlarla meyve elde etmenin¹⁶ talep ettiğini göstermektedir.

Embriyo kurtarma, erken kürtaj veya az gelişmiş embriyolardan kaynaklanan sorunların üstesinden gelmek için uygun bir yöntem olarak önerilmiştir ve olgunlaşmamış embriyoların rejenerasyonu için en erken ve en başarılı in vitro kültür tekniklerinden biridir^16,20. Embriyo kurtarma, az gelişmiş / olgunlaşmamış embriyoların in vitro kültürünü ve ardından fidelerin ve nihayetinde olgun bitkilerin geri kazanılmasını kolaylaştırmak için steril bir besin ortamına transferini içerir²¹. Embriyo kurtarma, kabak yetiştiriciliğinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen, rutin uygulamasına izin verecek uygun metodolojinin ayrıntılı bir açıklaması eksiktir. Cucurbita türlerinde interspesifik hibridizasyon engellerinin üstesinden gelmek için embriyo kurtarma tekniğinin kullanılması, 1954 gibi erken bir tarihte rapor edilmiştir²². Bununla birlikte, erken çalışmalarda embriyo kurtarmanın başarısı ya bildirilmemiş ya da çok düşüktü. Metwally ve ark., C. pepo ve C. martinezii²³ arasındaki bir haçtan kurtarılan 100 interspesifik hibrid embriyo arasında% 10'luk bir başarı oranı (olgun bitkilere rejenerasyon) bildirmiştir. Sisko ve ark., farklı çapraz kombinasyonlardan elde edilen embriyolar arasında embriyo rejenerasyonunun değişken bir başarı oranını bildirmişlerdir: C. maxima (Bos. Max) ve C. pepo'yu (Altına Hücum) geçerek elde edilen melezlerin rejenerasyon oranı %15.5, C. pepo (Kabak) ve C. moschata (Hokaido) için %20, C. pepo (Altına Hücum) ve C. moschata (Dolga) için ise %37.5 ²⁴ idi. Genotipe ek olarak, media ve in vitro kültür koşulları tekniğin başarısı için önemli faktörlerdir^25,26. Bu çalışmada, C. moschata ve C. pepo arasındaki çeşitli çapraz kombinasyonlar test edilmiş ve kabakta embriyo kurtarma tekniğini kullanmak için basit bir metodoloji geliştirilmiştir. Basit ve kolayca tekrarlanabilir bir embriyo kurtarma tekniğinin geliştirilmesi, kabak ıslah programlarında interspesifik hibridizasyonu ve germplazma geliştirmesini kolaylaştıracaktır.

1. Dikim ve tozlaşma

NOT: Hibridizasyonu meyve tutumu ve canlı embriyoların üretimi ile sonuçlanacak uyumlu genotiplerin tanımlanması önemlidir.

1. Dikim koşulları ve bakım
   1. Hibridizasyon için kabak genotiplerinin tohumlarını (çeşitler/katılımlar) elde edin (Tablo 1).
   2. 50 hücreli başlangıç düzlüklerini (25 cm genişlik x 50 cm uzunluk), 1,38 g/kg N, 1,38 g/kg P ve 1,38 g/kg K içeren komple NPK gübre ile değiştirilmiş saksı ortamıyla doldurun.
   3. Tohumları uzunluklarına eşit bir derinliğe kadar ekin ve saksı ortamı ile örtün. Durağan su oluşturmadan daireleri sulayın. Daha sonra, medyayı günde bir kez elle sulayarak nemli tutun.
   4. İkinci gerçek yaprak aşamasında, fideleri 3 yemek kaşığı / tencerede tam bir NPK gübre ile değiştirilmiş 25 cm ila 30 cm çapında saksılara nakledin. Bitkileri haftada bir kez, galon su başına 1 g konsantrasyona eklenen NPK 20:20:20 içeren 500 mL / sıvı gübre kabı ile gübreleyin.
   5. Seradaki bitkileri doğal ışık rejimi altında 22-28 °C arasındaki sıcaklıklarda tutun. Vining genotipleri için, serada destekleyici bir kafes sağlayın (Şekil 1).
2. Tozlaşmaların gerçekleştirilmesi
   1. Tipik olarak, kabakta çiçeklenme, çeşide bağlı olarak tohumlamadan 6 ila 8 hafta sonra başlar (Şekil 2A, B). Bitkiler çiçeklenmeye başlar başlamaz kontrollü hibridizasyon (haçlar) yapmaya başlayın. Sera koşullarında, tozlaşma yıl boyunca yapılabilir.
   2. Ertesi gün tozlaşmaya hazır olacak C. pepo ve C . moschata çeşitlerinin erkek ve dişi çiçeklerini tanımlayın. Bu tür çiçekleri tanımlamak için, yaprakları sarı bir renk tonuna sahip olan ancak açık olmayan çiçekleri kontrol edin. Kazara böcek tozlaşmasını önlemek için maskeleme bandı kullanarak üstten kapatılan çiçekleri nazikçe bantlayın (Şekil 2C, D).
   3. Ertesi günün sabahı, çiçekler tozlaşmaya hazırdır. Hibridizasyon başarı oranını artırmak için saat 10: 00'dan önce tozlaşma yapın²⁷.
   4. Yaprakların bantlanmış üst kısmını nazikçe çıkararak dişi ve erkek çiçekleri açın. Yaprakları erkek çiçekten çıkarın ve panteri dişi çiçeğin damgasına hafifçe sürterek poleni aktarın (Şekil 3A).
   5. Tozlaşmadan sonra, tozlaşan dişi çiçeği hemen maskeleme bandı ile kapatın. Tozlaşma tarihini kaydetmek ve çarmıhta kullanılan baba ve anne babalarını belirtmek için bir etiket kullanın (Şekil 3B).
   6. Başarılı bir haç, 1 hafta içinde hızla küçük bir meyve oluşturan genişlemiş bir yumurtalık ile gösterilir (Şekil 4A). Bitki daha sonra tozlaşma^28'den 45-55 gün sonra hasat için hazırdır (Şekil 4B).

2. Embriyo kurtarma tekniği

1. Medya hazırlama
   1. Antibiyotik stokları hazırlayın: Sefotaksim (sodyum tuzu) için, antibiyotiği 4 mL deiyonize veya damıtılmış suda çözün, steril bir 0.22 μm şırınga filtresinden süzün ve 0.5 mL alikotlar yapın. -20 °C'de saklayın. Elde edilen stok çözeltisi 250 mg / mL'lik bir konsantrasyona sahip olacaktır.
   2. Ampisilin (sodyum tuzu) için, tozu 10 mL suda çözün, steril bir 0.22 μm şırınga filtresinden süzün ve 100 mg / mL'lik bir son konsantrasyonda 1 mL stokta aliquot. -20 °C'de saklayın.
   3. Murashige ve Skoog (MS) ortamını, 1 L'lik bir şişede 500 mL damıtılmış suda 2.45 g ortamı (4.91 g / L konsantrasyon) çözerek yapın. 1,5 g gellan sakızı ekleyin ve 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav ekleyin. Gellan zamkı otoklavlama sırasında tamamen çözülür.
   4. Otoklavlamadan sonra, şişeyi 50 ° C'de bir su banyosuna yerleştirerek ortamı soğutun. Antibiyotik stoklarını dondurucudan çıkarın ve laminer akış kabininde çözün.
   5. Orta şişeyi laminer akış başlığına aktarın. Orta şişeye 0.6 mL sefotaksim stok çözeltisi (250 mg / mL) ve 0.25 mL ampisilin stoğu (100 mg / mL) ekleyin ve iyice karıştırın. Ortamın yaklaşık 7 mL'sini steril bir Petri kabına (60 mm x 15 mm) dökün.
   6. Ortamın Petri kaplarında yaklaşık 15-20 dakika katılaşmasına izin verin. Petri tabaklarını sızdırmazlık sargısı ile kapatın ve bir saklama kutusuna yerleştirin. Oda sıcaklığında saklayın.
2. Embriyo kurtarma
   1. Başlamadan önce, laminer hava akış kabinini% 70 etil alkol ile temizleyin ve sterilize edin.
   2. Kabak meyvesini ana asmayı kırarak / keserek hasat edin ve tüm gevşek kirler temizlenene kadar laboratuvar lavabosunda sıvı deterjanla (örneğin,% 0.3 kloroksilenol) yıkayarak meyve yüzeyini dezenfekte edin (Şekil 5A).
   3. Bol musluk suyuyla durulayın. Meyveyi temiz kağıt havlularla kurulayın. Meyveyi laminer-hava-akış kabinine taşıyın (Şekil 5B).
   4. Steril laminer-hava akış kabininde meyvenin üzerine% 70 etanol püskürterek meyveyi sterilize edin. Meyveyi steril bir bıçakla ikiye bölün (Şekil 5C) ve tohumları çıkarın.
   5. Tohum kabuğunu aseptik olarak açmak ve olgunlaşmamış embriyoları ortaya çıkarmak için steril forseps kullanın (Şekil 6). Olgunlaşmamış embriyoları, sefotaksim ve ampisilin ile desteklenmiş MS besiyeri içeren bir Petri kabına dikkatlice yerleştirin (Şekil 7A). Petri kabını kapatın ve sarma filmi ile kapatın.
      NOT: Embriyonun büyüklüğüne bağlı olarak, bir Petri kabına beş veya altı embriyo sığdırmak mümkündür.
   6. Mühürlenmiş Petri kaplarını embriyolarla birlikte 25 °C ve %70 bağıl nemde 16 saatlik fotoperiyotun altındaki bir büyüme odasına yerleştirin. Kontaminasyon meydana gelirse, kontamine edilmemiş embriyoları derhal aynı ortama sahip yeni bir plakaya yerleştirin.
   7. Kotiledonlar 4 gün sonra genişlemeye başlayacak ve 10 gün içinde yeşile dönecektir (Şekil 7B). Bu noktada, gerekirse, doku genişlemesine izin vermek için aynı ortamı içeren yeni plakalara alt kültürleme yapın. Kökler 14 günde ortaya çıkmaya başlayacaktır (Şekil 7C) ve 21 günde plantletler genişletilmiş köklere ve kotiledonlara sahip olacaktır (Şekil 7D).
      NOT: Protokolde kullanılan kültür ortamı, ek büyüme düzenleyicileri olmadan sürgünlere ve köklere farklılaşma için uygundur.
   8. Bu aşamada, plantletleri Petri bulaşıklarından çıkarın ve ortamı musluk suyuyla köklerden yavaşça yıkayın (Şekil 8). Plantletleri plastik bir kaba (14 cm x 9 cm x 4 cm) yerleştirin ve kökleri ıslak kağıt havlularla örtün (Şekil 9A). Kabı örtün ve kağıt havluları gerektiği gibi nemlendirin.
   9. Kapları oda sıcaklığında (25-28 °C) ve 16 saatlik fotoperiyotta saklayın. Bu adım plantletleri iklimlendirecektir. Kapta 7-10 gün boyunca iklimlendirmeden sonra, fideler yaklaşık 3-4 uzunluğunda olacaktır. Bu süre zarfında, kağıt havluları gerektiği gibi nemlendirin.
   10. Fideleri, daha önce tarif edildiği gibi gübre ile değiştirilmiş 50 hücreli başlangıç düzlüklerine (25 cm genişlik x 50 cm uzunluk) aktarın ve seraya taşıyın (Şekil 9B). Çürümeyi önlemek için fideleri aşırı su ile doldurmayın; gerektiğinde hücre başına yaklaşık 10-20 mL ekleyin.
   11. İkinci ila üçüncü gerçek yaprak aşamasında, fideleri daha önce tarif edildiği gibi gübre ile değiştirilmiş saksı ortamı ile doldurulmuş 30 cm çapında saksılara nakledin (Şekil 10A). Asma bitkileri için kafes desteği sağlayın ve daha önce tarif edildiği gibi bitkiler çiçeklenmeye başladığında kontrollü hibridizasyon gerçekleştirin (Şekil 10B).
   12. Seradaki bitkileri doğal ışık rejimi altında 22-28 °C arasındaki sıcaklıklarda muhafaza edin. Bitkileri meyve ve tohum özellikleri açısından değerlendirin.

Meyve seti ve tohum canlılığı
Çeşitli çapraz kombinasyonlarda meyve tutumunu ve tohum canlılığını belirlemek için ilk test yapıldı. Dört C. pepo ve 11 C. moschata olmak üzere toplam 15 kabak genotipi seçildi (Tablo 1). Denenen 24 interspesifik çapraz kombinasyondan, meyve setinde genel olarak% >92'lik bir başarıyı temsil eden 22 (Tablo 2) için bir meyve seti elde edilmiştir. O ve M ile E ve J'yi geçerek olgun meyveler elde edilmezken, en fazla meyve sayısı (n=6) F ve J'yi geçerek elde edilmiştir (Tablo 2). Farklı çapraz kombinasyonlar için tozlaşan çiçek sayısı bir ila 11 arasında değişiyordu ve tozlaşmanın başarı oranı% 0 ila% 100 arasında değişiyordu. Farklı çapraz kombinasyonlarda tozlaşan çiçek sayısı, çiçek setlerinin sayısına ve erkek ve dişi çiçekler arasında çiçeklenme senkronizasyonuna bağlı olarak değişmiştir. İki haç hariç tüm haçlardan meyve elde edilmesine rağmen, meyvelerin kesildikten sonra değerlendirilmesi, meyvelerin çoğunun canlı tohumları olmayan embriyoları iptal ettiğini ortaya koymuştur. Haçların çoğundan elde edilen meyveler normal görünüyordu, ancak tohumlardan yoksundu ya da ilkel embriyolara sahip tohumlardan oluşuyordu. Tüm çapraz kombinasyonlardan toplam 44 meyve üretildi ve C ve J'yi geçerek geliştirilen sadece bir meyve, embriyo kurtarma tekniği ile geri kazanılabilecek zayıf gelişmiş embriyolara sahipti.

Embriyo kurtarma ve daha fazla ilerleme
C ve J'yi geçerek geliştirilen F1

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.