Kemirgen Kalplerde Viral Transgen Ekspresyonu ve Kardiyak Aritmi Riskinin Değerlendirilmesi

Kardiyovasküler hastalık, dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve sadece 2017 yılında 18 milyon insanın hayatına mal olmuştur¹. Kemirgenler, özellikle fareler ve sıçanlar, kullanım kolaylığı ve çeşitli transgenik aşırı ekspresyon veya nakavt çizgilerinin mevcudiyeti nedeniyle kardiyovasküler araştırmalarda en yaygın kullanılan model haline gelmiştir. Kemirgen modelleri, hastalık mekanizmalarını anlamak ve miyokard enfarktüsü², hipertansiyon³, kalp yetmezliği⁴ ve ateroskleroz^5'te potansiyel yeni terapötik hedefleri belirlemek için temel olmuştur. Bununla birlikte, kardiyak aritmiler çalışmalarında kemirgenlerin kullanımı, insan veya büyük hayvan modellerine kıyasla küçük kalp boyutları ve daha hızlı kalp atış hızları ile sınırlıdır. Bu nedenle, miyokard enfarktüsü sonrası farelerde veya sıçanlarda spontan ölümcül aritmiler nadirdir². Araştırmacılar, aritmi yükünde veya pro-aritmik eğilimlerde anlamlı değişiklikler göstermeden, fibroz veya gen ekspresyonu gibi pro-aritmik bir substratı yansıtabilecek dolaylı ikincil değişikliklere odaklanmak zorunda kalmaktadır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, fare ve sıçan kalplerinin genetik modifikasyon ^6,7 veya miyokard enfarktüsü² sonrası ventriküler taşiaritmilere duyarlılığının güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan bir yöntem mevcut protokolde tanımlanmıştır. Bu yöntem, izole edilmiş, Langendorff perfüze^{edilmiş 8} fare ve sıçan kalplerinde ventriküler taşiaritmileri indüklemek için adrenerjik reseptör stimülasyonunu programlanmış elektriksel stimülasyonla birleştirir.

Kemirgen miyokard dokusunda viral gen transferi için standart yaklaşımlar genellikle kalbin torakotomi ^9,10,11 ile maruz kalmasını içerir^, bu da invaziv bir prosedürdür ve işlemden sonra hayvanların gecikmiş iyileşmesi ile ilişkilidir. Bu makalede, transgenlerin aşırı ekspresyonu için ultrason görüntüleme rehberliğinde doğrudan intramiyokard virüs enjeksiyonu yöntemi açıklanmaktadır. Bu daha az invaziv prosedür, torakotomi ile karşılaştırıldığında, viral enjeksiyondan sonra daha hızlı hayvan iyileşmesine ve daha az doku hasarına izin verir, hayvandaki ameliyat sonrası ağrı ve iltihabı azaltır ve böylece transgenik genlerin kalp fonksiyonu üzerindeki etkilerinin daha iyi değerlendirilmesini sağlar.

Açıklanan tüm yöntem ve prosedürler, Ottawa Üniversitesi'ndeki hayvan araştırmaları etik inceleme kurulu ve Ottawa Üniversitesi Kalp Enstitüsü'ndeki biyogüvenlik inceleme komitesi tarafından onaylanmıştır. Geliştirilen güvenlik protokolleri, rekombinant adenovirüs veya adeno ilişkili virüs (AAV) ile ilgili tüm prosedürlerin seviye II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirildiğini içerir. Virüsle temas eden tüm maddeler deneyden sonra iyice dekontamine edildi. Bu çalışmada Ctnnb1^flox/flox ve αMHC-MerCreMer fareleri (8-12 haftalık, her iki cinsiyetten) ve Sprague-Dawley sıçanları (200-250g, erkek) kullanılmıştır. Hayvanlar ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bkz. Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, kurumsal düzenleyici komiteler tarafından eğitilmiş ve onaylanmış personel tarafından gerçekleştirilmiştir. Tüm işlemler sırasında uygun kişisel koruyucu ekipmanlar kullanıldı.

1. Kemirgen ventrikül dokularında viral transgen ekspresyonu

NOT: Hedef geni ve ilgili kontrol virüsünü ifade eden Ad-GFP (1 x 10 10 PFU/mL titre) veya AAV9-GFP (^{1 x 10 13} GC/mL titre) gibi rekombinant adenovirüs veya AAV (bkz.

1. Virüs enjeksiyonu gününde, virüsü buz üzerinde çözün. Hedef geni ve kontrol virüsünü eksprese eden virüsü 30 G 1/2 iğne ile iki ayrı şırıngaya (hacim = 50 μL) aspire edin ve kullanıma kadar buz üzerinde tutun.
   NOT: Şırınga ve iğnedeki kabarcıklar dikkatlice çıkarılmalıdır.
2. Sıçanlara veya farelere buprenorfin uygulayın (sıçanlar için 0.05 mg / kg, fareler için 0.1 mg / kg, deri altı), 1 saat sonra% 3 izofluran kullanarak anesteziyi indükleyin ve sonraki prosedür için% 2'de (0.5-1.0 L / dak akış hızında% 100 oksijende) izofluranı koruyun.
3. Hayvanın vücudunu (örneğin kuyruğu) bir çift forseps ile hafifçe sıkıştırın ve hayvan sıkışmaya herhangi bir vücut hareketiyle cevap vermezse, uygun anestezi onaylanır.
4. Elektrikli ısıtma yastığı kullanarak vücut ısısını 37 ° C'de tutun. Göğüs bölgesindeki saçları saç kesme makinesi kullanarak tıraş edin.
   NOT: Potansiyel düzensiz ısı dağılımı nedeniyle elektrikli ısıtma yastığı kullanırken dikkatli olunmalıdır.
5. Korneanın kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
6. Hayvanı sırtüstü pozisyonda tutun ve kısa eksen oryantasyonunda hayvanın kalbinin ultrasonla görüntülenmesi için klinik öncesi bir görüntüleme sistemi kullanın (bkz.
   NOT: Aşağıdaki adımlar, steril bir ortam sağlayan seviye II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir. Güvenli iğne kullanımı olanlar da dahil olmak üzere standart güvenlik prosedürleri uygulanır.
7. Hayvanın sol alt göğüs bölgesini, dairesel bir hareketle üç kez iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir ovma ve alkolün alternatif turlarıyla sterilize edin.
8. Ultrason görüntüleme rehberliği altında, virüsü içeren şırınganın 30 G 1/2 iğnesini adım 1.1'de hazırlandığı gibi yerleştirin. Vücudun sol alt göğüs tarafından hayvanın göğsüne girer.
9. İğne ucunu sol ventrikül ön serbest duvarına yaklaştırın ve yavaşça 10-15 μL virüs enjekte edin. İğnenin ucuna yakın gelişmiş parlaklık ile ultrason görüntülerinde başarılı enjeksiyonu doğrulayın.
   NOT: Her bölgeye enjekte edilen virüs miktarı, miyokard dokularına fiziksel zarar gelmesini önlemek için 15 μL'den fazla değildir.
10. İğneyi kalpten çekin ve aynı miktarda virüsün ikinci ve üçüncü enjeksiyonu için sol ventrikülün diğer bölgelerine yerleştirin.
    NOT: Toplam enjeksiyon bölgesi sayısı deney tasarımı ile belirlenir. Fokal transgen ekspresyonu gerekiyorsa, sadece bir enjeksiyon gereklidir; Daha fazla difüzif transgen ekspresyonu gerekiyorsa, genellikle çoklu enjeksiyon bölgelerine (üç ila beş) ihtiyaç duyulur.
11. Enjeksiyonların tamamlanmasından sonra, hayvanı kafesine geri getirin.
12. Sternal yatışlığı korumak ve konut odasına geri döndürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı dikkatlice izleyin.
13. Buprenorfin HCl'yi (0.1 mg / kg, fareler için günde iki kez, 0.05 mg / kg, sıçanlar için günde iki kez, deri altı) sonraki 2 gün boyunca hayvana uygulayın. Hayvanları vivaryuma geri döndürün ve olağandışı ağrı veya sıkıntı belirtileri için günlük olarak izleyin ve bulunursa, Kurumsal hayvan bakım komitesi protokollerine göre hayvanları tedavi edin.

2. Kardiyak aritmi duyarlılığının değerlendirilmesi

NOT: Adenovirüs enjeksiyonundan 4-6 gün sonra ve AAV enjeksiyonundan 1-2 hafta sonra, 2.1.-2.2 adımlarını izleyerek hayvan kalplerinin kardiyak aritmilere duyarlılığını değerlendirin.

1. Sıçan veya fare kalbinin Langendorff perfüzyonunu gerçekleştirin.
   1. 1 L suya aşağıdakileri ekleyerek tirot çözeltisi hazırlayın: NaCl, 7.9 g (son = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl₂, 0,27 g (1,8 mM); MgCl 2, 0,24 g (_1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); ve glikoz, 1.8 g (10 mM). NaOH ile pH'ı 7,40'a ayarlayın ( bkz.
   2. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtre ve 2.1.6.-_2.2.8 adımları sırasında sürekli olarak %100 O2 kabarcığı ile filtreleyin.
   3. Heparini sıçan veya fareye uygulayın (500 U / kg, intraperitoneal enjeksiyon) ve 10 dakika sonra hayvanı% 3 izofluran ile uyuşturun. Vücutta hafif bir tutam ile yeterli anestezi sağlayın.
   4. Sol torakotomi için orta klaviküler çizgide 1-1.5 cm'lik dikey bir kesi yapmak ve kalbi açığa çıkarmak için bir neşter kullanın.
   5. Aort kemeri seviyesinde bir çift makasla keserek kalbi toplayın ve hemen kalbi buz gibi soğuk Tyrode çözeltisine koyun.
      NOT: Kalp toplanması sırasında kalbe zarar vermemek için dikkatli olunmalıdır.
   6. Kalbin aortunu, sabit akış hızı modunda modifiye edilmiş bir Langendorff perfüzyon sistemine (bakınız Malzeme Tablosu) bağlı künt bir iğne (sıçanlar için 18 G; fareler için 23 G) ile kanüle edin. Perfüzyon basıncını 70-80 mmHg'de tutmak için akış hızını ayarlayın.
      NOT: Perfüzyon iğnesindeki kabarcıklar aort kanülasyonundan önce çıkarılmalıdır. Diseksiyon mikroskobu kullanmak kanülasyonu kolaylaştırır.
   7. Kanüllenmiş kalbi, sol ventrikül yukarı bakacak şekilde silikon elastomer kaplı 9, 10 cm'lik plastik bir kaba yerleştirin ve kalbi ^9,12'yi 37 ° ^C'de O₂ kabarcıklı Tirode çözeltisi ile perfüze edin.
   8. Perfüzyonun başlangıcında, ilk iki ila üç kalp atışı sırasında kalpten kanın yıkanmasını ve kalp renginin kırmızıdan solukluğa değiştiğini gözlemleyerek doğru aort kanülasyonunu doğrulayın.
   9. Küçük bir hayvan EKG sisteminin elektrotlarını (bakınız Malzeme Tablosu) kabın içindeki silikon elastomer kaplamaya yerleştirerek kalbin etrafına yerleştirin (Şekil 1). Uyumlu bir yazılım kullanarak EKG'yi kaydedin.
2. Ventriküler taşiaritmileri indüklemek için adrenerjik reseptör stimülasyonu ve programlanmış elektriksel stimülasyon gerçekleştirin.
   1. Başarılı aort kanülasyonundan sonra, kalp hazırlığını stabilize etmek için kalbi 20 dakika boyunca Tyrode çözeltisi ile perfüze etmeye devam edin.
   2. Adım 2.2.3.-2.2.8'de kalp perfüzyonu için kullanılan Tyrode çözeltisine 1 μM izoproterenol ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   3. 10 dakikalık izoproterenol perfüzyonundan sonra, bir elektrik stimülatörüne bağlı iki platin elektrot ile tepedeki kalbi uyarın (bkz.
   4. 10 ardışık uyaranı (S1, 5 V, 100 ms aralıkları) içeren stimülasyon prosedürü (Şekil 2) ile başlayın ve bunu 80 ms'lik bir başlangıç aralığına sahip ekstra bir uyaran (S2) izler. Kalp atışı artık yakalanamayana kadar S2 aralığını her seferinde tekrar tekrar 2 ms azaltın (yani, kalbin etkili refrakter periyoduna, ERP'ye ulaşmak)¹³.
   5. İndüklenmiş ventriküler taşiaritmileri (ventriküler taşikardi ve fibrilasyon dahil) EKG ile izleyin.
   6. Yukarıdaki prosedür tarafından herhangi bir aritmi indüklenmezse, ERP'ye ulaşılana kadar S2'den sonra aynı başlangıç (80 ms) ve azalma (2 ms) aralıklarla başka bir ekstra uyaran (S3) ekleyin.
   7. Ventriküler taşiaritmiler hala indüklenmiyorsa, ERP'ye ulaşılana kadar S3'ten sonra aynı başlangıç ve azalma aralıklarıyla bir ekstra uyaran (S4) daha ekleyin.
   8. Ventriküler taşiaritmiler hala indüklenmiyorsa (kontrol sağlıklı kalplerde beklendiği gibi), elektriksel stimülasyon protokolünü durdurun ve kalbin indüklenemez olduğunu düşünün.

Burada açıklanan protokolü izleyerek perfüze edildiğinde (Şekil 1), izole edilmiş bir sıçan veya fare kalbi en az 4 saat boyunca ritmik ve kararlı bir şekilde atar. Deneysel tasarım daha uzun bir kalp perfüzyonu süresi gerektiriyorsa, uzun süreli perfüzyondan sonra miyokard ödemi oluşumunu azaltmak için perfüzyon çözeltisine albümin eklemek yararlıdır14. İzoproterenolün perfüzyon çözeltisine dahil edilmesi, miyokard enfarktüsü ve kalp yetmezliği gibi birçok aritmojenik durumda ortaya çıkan sempatik sinir sisteminin aktivasyonunu taklit eder. Programlanmış elektriksel stimülasyon sırasında, kalbin başarılı temposu (1) ardışık S1 uyaranları sırasında kalp atışının 1: 1 yakalanması ve (2) S1 pacing sırasında uzun süreli (veya daha geniş) QRS kompleksi (Şekil 3 ve Şekil 4) ile doğrulanır. İkincisi, kalbin tepede tempolu olması ve ventriküler dokulardaki aktivasyonun daha yavaş iletilmesinin QRS kompleks süresini arttırmasıdır.

Yayınlanan veri 2,7'de (Şekil 3 ve Şekil 4) gösterildiği gibi, bu kombine adrenerjik ve elektriksel stimülasyonlar, sağlıklı fare kalplerinde (Şekil 3'te sahte olarak ameliyat edilen vahşi tip kalpler) veya kontrol sıçan kalplerinde (Şekil 4'te Ad-GFP enjekte edilen sıçan kalplerini kontrol edin) ventriküler taşiaritmilere (en az üç ardışık prematüre ventrikül kompleksi, PVC'ler olarak tanımlanan) indüklememiştir. ). Buna karşılık, aynı protokol, miyokard enfarktüsünden sonra vahşi tip fare kalplerinin% 77'sinde (Şekil 3B) ve Ad-Wnt3a'nın intramiyokard enjeksiyonundan sonra dört sıçan kalbinden üçünde ventriküler taşiaritmileri indükledi (Şekil 4). Bu, bu ventriküler aritmi indükleyici yaklaşımın yüksek sadakatini göstermektedir.

Virüs enjeksiyonundan sonra başarılı intramiyokardiyal transgen ekspresyonu, gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR, batı lekesi veya immünohistokimya ile tanımlanan miyokard dokularındaki transgenin yukarı regüle edilmiş mRNA ve protein seviyeleri ile doğrulanabilir. Virüs, GFP gibi bir floresan muhabir geni ifade ederse, başarılı viral transdüksiyon, GFP9 ekspresyonuyla izole edilmiş, canlı, tek kardiyomiyositlerde de doğrulanabilir.

Resim 1: İzole edilmiş bir sıçan kalbinin Langendorff perfüzyonu. Kalp hayvandan toplanır ve aort künt bir 18 G iğne ile kanüle edilir. İğne, 70-80 mmHg basınçta 37 °C Tyrode çözeltisi ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırıngaya bağlanır. Kalp, sol ventrikül yukarı bakacak şekilde silikon elastomer kaplı, 10 cm'lik plastik bir kaba yerleştirilir. Küçük bir hayvan EKG sisteminin elektrotları (kırmızı, yeşil ve siyah renkler), çanaktaki silikon elastomer kaplamaya yerleştirilerek kalbin etrafına yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Langendorff perfüze edilmiş kalbin adrenerjik ve elektriksel stimülasyonları. (A) Sıçan veya fare kalbi, Şekil 1'de gösterildiği gibi bir Langendorff sistemi üzerinde perfüze edilir ve kalbin β1 adrenerjik reseptörlerini uyarmak için perfüze edici Tirod çözeltisine 1 μM izoproterenol eklenir. Kalp daha sonra tepede bir uyarıcıya bağlı iki platin elektrot tarafından uyarılır. (B) Programlanmış elektriksel stimülasyonun temsili. Ayrıntılar için adım 2.2'ye bakın. Şekil Wang ve ark.2'nin izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Miyokard enfarktüsünden sonra fare kalplerinde indüklenen ventriküler taşiaritmiler. (A) Bir ekstra uyaranla (S2) uyarıldığında vahşi tip (WT) fare kalbinde (miyokard enfarktüsünden 8 hafta sonra, MI) uyarıldığında programlanmış elektriksel stimülasyona (PES) bağlı ventriküler taşikardi (VT, üç veya daha fazla ardışık prematüre ventriküler kompleks, PVC olarak tanımlanır) gösteren temsili ex vivo EKG (Lead II) β-katenin nakavt (KO) fare kalbi (MI'den 8 hafta sonra) üç ekstra uyaranla (S4) uyarıldığında. İzoproterenol (1 μM), PES stimülasyonu sırasında perfüze edici Tirode çözeltisine dahil edildi. Kardiyak-spesifik β-katenin (Ctnnb1) nakavt fareleri, αMHC-MerCreMer fareleri ile melezleme Ctnnb1flox / flox fareleri (ekzonları 2 ila 6 floksed ile) tarafından üretildi. 8-12 haftalıkken, Ctnnb1 flox/flox;αMHC-MerCreMer+/− fareler (KO) ve çöp arkadaşı Ctnnb1 flox/flox; αMHC-MerCreMer−/− fareler (kontrol vahşi tip fareler olarak kullanılır), MI veya sahte gruba atanmadan önce art arda 5 gün boyunca günlük deri altı tamoksifen enjeksiyonları (20 mg / kg / gün) aldı. (B) M'DEN 1 hafta veya 8 hafta sonra WT ve KO kalplerinde PES kaynaklı PVC'lerin ve VT'lerin özeti. Sol tablodaki kriterlere göre her kalbe bir aritmi skoru atandı. MI'den 8 hafta sonra, VT, WT kalplerinin% 77'sinde, ancak KO kalplerinin sadece% 18'inde başarıyla indüklendi. Veriler iki yönlü ANOVA ve Bonferroni post-hoc karşılaştırma ile analiz edildi. Hata çubukları standart hatayı (SE) gösterir. Şekil, Wang ve ark.2'nin izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Wnt3a eksprese eden bir virüsün intramiyokard enjeksiyonundan sonra sıçan kalplerinde indüklenen ventriküler taşiaritmiler. (A) PES, Wnt3a (Ad-Wnt3a, alt) eksprese eden bir adenovirüsün intramiyokard enjeksiyonundan sonra 4-6. günde sıçanların kalplerinde (200-250 g, erkek, Sprague-Dawley) ventriküler aritmilere neden oldu, ancak GFP eksprese eden kontrol adenovirüsü enjekte edilen kalplerde (Ad-GFP, üstte) değil. Kalpler izole edildi ve Langendorff sistemi üzerinde perfüze edildi. İzoproterenol (1 μM), PES stimülasyonu sırasında perfüze edici Tirode çözeltisine dahil edildi. Ex vivo PES stimülasyonu sırasında EKG sürekli olarak kaydedildi. Bu deneyde 11 ardışık S1 uyaranının (mavi renk) kullanıldığını unutmayın. (B) Panel (A)'daki çalışmaların özeti: Ventriküler taşikardi (VT), Ad-Wnt3a enjeksiyonu ile dört kalpten üçünde PES tarafından indüklendi, ancak kontrol Ad-GFP'li dört kalbin hiçbirinde PES ile indüklendi. Şekil, Lu ve ark.7'nin izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.