Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Brandy N. Curtis; Ellysa J. D. Vogt; Kevin S. Cannon; Amy S. Gladfelter

doi:10.3791/64090

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

2.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64090

⸱

28 Temmuz 2022

Brandy N. Curtis^*¹ , Ellysa J. D. Vogt^*² , Kevin S. Cannon¹^,³ , Amy S. Gladfelter¹^,²^,³

¹Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, ²Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, ³Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Hücresiz resusyon, sitoiskelet düzeneğini anlamak için önemli bir araç olmuştur ve son on yıldaki çalışmalar, septin dinamiklerini minimal sistemlerde incelemek için yaklaşımlar oluşturmuştur. Burada septin montajını farklı membran bağlamlarında gözlemlemek için üç tamamlayıcı yöntem sunulmaktadır: düzlemsel çift katmanlılar, küresel destekler ve çubuk destekleri.

Özet

Çoğu hücre, temel hücre işlemlerini gerçekleştirmek için şekillerini algılayabilir ve değiştirebilir. Birçok ökaryotta, septin sitoiskeleti, sitokinezi, polarize büyüme ve göç gibi şekil değişikliklerini koordine etmede ayrılmaz bir bileşendir. Septinler, çeşitli üst düzey yapılar oluşturmak için bir araya gelen filament oluşturan proteinlerdir ve çoğu durumda, plazma zarının farklı bölgelerinde, özellikle mikron ölçeğinde pozitif eğrilik bölgelerinde bulunur. Septin montaj sürecinin in vivo olarak izlenmesi, hücrelerdeki ışık mikroskobunun sınırlamalarının yanı sıra hem membranlar hem de sitoiskelet elemanları ile etkileşimlerin karmaşıklığı nedeniyle engellenir ve bu da canlı sistemlerde septin dinamiklerini ölçmeyi zorlaştırır. Neyse ki, son on yılda, septin montajını kontrol eden mekanizmaları yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüklerde incelemek için septin sitoiskeletinin hücresiz bir sistemde yeniden yapılandırılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Septin montajının temel adımları, septin heterooligomer ilişkisi ve membran ile ayrışması, filamentlere polimerizasyon ve filamentler arasındaki etkileşimler yoluyla daha yüksek dereceli yapıların oluşumunu içerir. Burada, septin montajını farklı bağlamlarda gözlemlemek için üç yöntem sunuyoruz: düzlemsel çift katmanlar, küresel destekler ve çubuk destekleri. Bu yöntemler, montajın farklı aşamalarında septinlerin biyofiziksel parametrelerini belirlemek için kullanılabilir: membranı bağlayan tek oktamerler olarak, filamentler olarak ve filamentlerin montajları olarak. Bu parametreleri, eğrilik algılamanın çeşitli uzunluk ve zaman ölçeklerinde nasıl çalıştığını anlamak için eğrilik örneklemesi ve tercihli adsorpsiyon ölçümleriyle birlikte kullanıyoruz.

Giriş

Hücrelerin şekilleri ve iç bölmelerinin çoğu, onları çevreleyen lipit zarlarına bağlıdır. Membranlar, proteinlerle etkileşimler, lipit sıralama ve çeşitli şekiller üretmek için iç ve dış kuvvetlere etki ederek deforme olabilen viskoelastik yapılardır 1,2,3,4. Bu şekiller genellikle membran eğriliği açısından tanımlanır. Hücreler, hücre kaçakçılığı, sitokinezi ve migrasyon dahil olmak üzere süreçler üzerinde tanımlanmış mekansal-zamansal kontrol sağlamak için tercihen belirli membran eğriliklerine monte edilebilen veya "algılayabilen" çeşitli....