Yöntem makalesi

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

2.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64090

⸱

28 Temmuz 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Hücresiz resusyon, sitoiskelet düzeneğini anlamak için önemli bir araç olmuştur ve son on yıldaki çalışmalar, septin dinamiklerini minimal sistemlerde incelemek için yaklaşımlar oluşturmuştur. Burada septin montajını farklı membran bağlamlarında gözlemlemek için üç tamamlayıcı yöntem sunulmaktadır: düzlemsel çift katmanlılar, küresel destekler ve çubuk destekleri.

Özet

Çoğu hücre, temel hücre işlemlerini gerçekleştirmek için şekillerini algılayabilir ve değiştirebilir. Birçok ökaryotta, septin sitoiskeleti, sitokinezi, polarize büyüme ve göç gibi şekil değişikliklerini koordine etmede ayrılmaz bir bileşendir. Septinler, çeşitli üst düzey yapılar oluşturmak için bir araya gelen filament oluşturan proteinlerdir ve çoğu durumda, plazma zarının farklı bölgelerinde, özellikle mikron ölçeğinde pozitif eğrilik bölgelerinde bulunur. Septin montaj sürecinin in vivo olarak izlenmesi, hücrelerdeki ışık mikroskobunun sınırlamalarının yanı sıra hem membranlar hem de sitoiskelet elemanları ile etkileşimlerin karmaşıklığı nedeniyle engellenir ve bu da canlı sistemlerde septin dinamiklerini ölçmeyi zorlaştırır. Neyse ki, son on yılda, septin montajını kontrol eden mekanizmaları yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüklerde incelemek için septin sitoiskeletinin hücresiz bir sistemde yeniden yapılandırılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Septin montajının temel adımları, septin heterooligomer ilişkisi ve membran ile ayrışması, filamentlere polimerizasyon ve filamentler arasındaki etkileşimler yoluyla daha yüksek dereceli yapıların oluşumunu içerir. Burada, septin montajını farklı bağlamlarda gözlemlemek için üç yöntem sunuyoruz: düzlemsel çift katmanlar, küresel destekler ve çubuk destekleri. Bu yöntemler, montajın farklı aşamalarında septinlerin biyofiziksel parametrelerini belirlemek için kullanılabilir: membranı bağlayan tek oktamerler olarak, filamentler olarak ve filamentlerin montajları olarak. Bu parametreleri, eğrilik algılamanın çeşitli uzunluk ve zaman ölçeklerinde nasıl çalıştığını anlamak için eğrilik örneklemesi ve tercihli adsorpsiyon ölçümleriyle birlikte kullanıyoruz.

Giriş

Hücrelerin şekilleri ve iç bölmelerinin çoğu, onları çevreleyen lipit zarlarına bağlıdır. Membranlar, proteinlerle etkileşimler, lipit sıralama ve çeşitli şekiller üretmek için iç ve dış kuvvetlere etki ederek deforme olabilen viskoelastik yapılardır 1,2,3,4. Bu şekiller genellikle membran eğriliği açısından tanımlanır. Hücreler, hücre kaçakçılığı, sitokinezi ve migrasyon dahil olmak üzere süreçler üzerinde tanımlanmış mekansal-zamansal kontrol sağlamak için tercihen belirli membran eğriliklerine monte edilebilen veya "algılayabilen" çeşitli protein paketlerini kullanır 5,6. Membrandaki hücre makinelerinin dinamiklerini, zamanı ve mekansal çözünürlüğü hücre sağlığı ile dengelemenin zorluğu nedeniyle gözlemlemek özellikle zordur. Süper çözünürlük teknikleri bu tür yapıların ayrıntılı bir görünümünü sunabilse de, çoğu makine için montaj / demontaj zaman çizelgelerine uygun olmayan uzun kazanımlar gerektirir. Ek olarak, bu montajların doğal ortamlarındaki moleküler karmaşıklığı ve tek bir bileşenin oynayabileceği rollerin çokluğu, minimal sulandırma sistemlerini moleküllerin fonksiyonel kapasitesini incelemek için değerli bir araç haline getirmektedir.

Membran özelliklerini ve hücre dışındaki protein-membran etkileşimlerini incelemek için minimal membran mimetiği geliştirilmiştir. Membran mimetiği, lipozomlar veya dev unilamellar veziküller gibi serbest duran lipit çift katmanlarından, desteklenen lipit çift katmanlarına (SLB'ler) kadar değişir7,8,9,10. SLB'ler, tipik olarak cam, mika veya silika 11,12'den oluşan, altta yatan desteğe tutturulmuş biyomimetik membranlardır. Düzlemsel yüzeyler, küreler, çubuklar ve hatta hem içbükey hem de dışbükey eğrilikler üzerindeki protein-membran etkileşimlerini aynı anda araştırmak için dalgalı veya mikro desenli substratlar dahil olmak üzere çeşitli geometriler kullanılabilir1 3,14,15,16,17,18 . Çift katmanlı oluşum, hidrofilik bir yüzeye vezikül adsorpsiyonu ile başlar, ardından sürekli bir çift katmanlı oluşturmak için füzyon ve kopma ile devam eder (Şekil 1)19. Desteklenen çift katmanlar, ışık ve elektron mikroskobuna özellikle uygundur ve hücrelerde sıklıkla elde edilebilenden daha iyi zaman ve uzamsal çözünürlük sağlar. Kavisli SLB'ler özellikle önemli membran deformasyonunun yokluğunda protein eğrilik hassasiyetini araştırmak için çekici bir araç sağlar ve serbest sistemlerde ayrılması genellikle imkansız olan eğrilik algılama ve eğrilik indüksiyonu arasında ayrım yapılmasına izin verir.

Septinler, pozitif kavisli membranlar üzerinde birleşme yetenekleri ile iyi bilinen bir filament oluşturan sitoiskelet proteinleri sınıfıdır 6,18,20. Mayadaki hücre döngüsü boyunca, septinler bir halka halinde toplanır ve sırasıyla tomurcuk oluşumu ve sitokinezi ile ilişkili kum saati ve çift halka yapılarını oluşturmak için yeniden düzenlenmelidir21. Değişen hücre döngüsü aşamaları22'de septin mimarisini gözlemlemek için platin replika elektron mikroskobu kullanılarak güzel çalışmalar yapılmış olsa da, mayada ışık mikroskobu kullanarak zaman içinde septin montajını izlemek sınırlı uzamsal çözünürlükle karşılanmıştır. İletim elektron mikroskobu (TEM) ile görselleştirilen lipit monokatmanlarını kullanan septinler üzerinde yapılan önceki çalışmalar, halkalar, demetler ve gazlı bezler gibi birkaç ilginç septin yapısını yeniden oluşturabildi23. Bununla birlikte, EM teknikleri, floresan mikroskobundan farklı olarak, zamansal çözünürlüklerinde de sınırlıdır. Çok ölçekli septin montajı sürecinin kinetik parametrelerini daha iyi çözmek için, membran geometrisini, numune koşullarını ve görüntüleme modalitesini dikkatlice kontrol edebilen desteklenen membran mimetiğine yöneldik.

Burada açıklanan protokoller düzlemsel veya kavisli SLB'ler, saflaştırılmış protein ve mikroskopi tekniklerinin bir kombinasyonunu kullanır. Kantitatif floresan konfokal mikroskopi ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM), hem çeşitli membran eğriliklerine bağlı dökme proteini ölçmek hem de tek moleküllerin bağlanma kinetiğini ölçmek için kullanıldı. Ayrıca, bu protokol, farklı membran eğriliklerinde protein ultrayapısını incelemek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Bu protokollerin odak noktası septin sitoiskeleti üzerinde olsa da, protokoller okuyucunun ilginç bulduğu herhangi bir proteinin eğrilik duyarlılığını araştırmak için kolayca değiştirilebilir. Ek olarak, endositoz veya veziküler kaçakçılık gibi alanlarda çalışanlar, bu teknikleri çoklu protein komplekslerinin eğriliğe bağlı gruplarını araştırmak için yararlı bulabilirler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Desteklenen lipit çift katmanlarının oluşturulması, monodisperse küçük unilamellar veziküllerin (SUV'lar) hazırlanmasını gerektirir. Lütfen SUV oluşumu hakkında daha önce yayınlanmış bir protokololan 24'e bakın. Kısaca, tüm SUV'lar 12 dakika boyunca prob sonikasyonu ile oluşturulur toplamda% 70 genlikte, 4 dakikalık sonikasyon dönemleri ve ardından buzlu suda 2 dakikalık dinlenme süreleri. SUV çözümleri iyi açıklığa kavuşturulmalı ve boyut olarak monodispers edilmelidir. SUV'ların boyut dağılımları, örneğin dinamik ışık saçılması25 ile ölçülebilir.

1. Düzlemsel lipit çift katmanlı

  1. Slaytların plazma temizliği
    NOT: Plazma temizliği organik kirleticileri giderir ve camın hidrofilikliğini artırarak verimli lipit adsorpsiyonu sağlar. Aşağıdaki adımlar, plazma temizleyiciye ve kullanılan cam kapaklara bağlı olarak değişebilir veya optimize edilmesi gerekebilir.
    1. Havayı hatlardan ve odadan uzaklaştırmak için plazma temizleyiciyi 5 dakika boyunca oksijenle temizleyin. Bu, plazma temizleyici çalıştırıldığında, hatlarda ve odada öncelikle oksijen bulunduğundan ve daha tutarlı çift katmanlı preparatlar sağladığından emin olmak içindir.
    2. Temizleme sırasında, toz ve partikülleri gidermek için mikro kapak camı kızaklarının üzerinden N2 veya Ar gibi inert bir gaz akışı sağlayın.
      İSTEĞE BAĞLI: Kapak camı kızakları, her iki tarafa% 100 izopropanol ve ardından su püskürtülerek yıkanabilir. İzopropanol su yıkamayı 3x tekrarlayın ve ardından birN2 akışı ile kurulayın.
    3. Kuru kapak camı slaytlarını seramik bir kızağa yerleştirin. Beşiği plazma odasının arkasına yerleştirin, böylece kapaklar odanın uzun kenarına paralel olacaktır (bu, plazma temizliği sırasında onları yerinde tutar). Plazma temizleyiciyi maksimum güçte oksijenle 15 dakika boyunca çalıştırın.
  2. Oda hazırlığı
    NOT: Burada açıklanan yöntem, reaksiyon hacimlerini desteklemek için plastik PCR tüplerinden ev yapımı odalar kullanır, ancak silikon kuyucuklar gibi diğer düşük yapışma malzemeleri de uygun olabilir.
    1. Bir tıraş bıçağı veya makas kullanarak, 0,2 mL'lik bir PCR tüpünün buzlu kısmının hemen altındaki kapağı kesin (Şekil 2).
    2. PCR tüpünün kenarını UV ile aktive edilen yapıştırıcı ile boyayın, tüpün içini önleyin. PCR tüpü tutkalını nazikçe plazma ile temizlenmiş bir kapak kapağının ortasına yerleştirin.
      NOT: Odanın içinde tutkaldan kaçınmak için, bir conta elde etmek için minimum miktarda yapıştırıcı kullanın ve odayı çarpmadan veya rahatsız etmeden derhal UV ile tedavi edin.
    3. Yapıştırıcıyı kürlemek için odayı 5-7 dakika boyunca uzun dalga boylu UV ışığı altına yerleştirin.
  3. Çift katmanlı oluşum
    NOT: Verimli çift katmanlı oluşum için bu adımda monodispers SUV'lar kullanılmalıdır. Tablo 1 , stok ve nihai tampon konsantrasyonları da dahil olmak üzere çift katmanlı oluşumda kullanılan tüm tamponlar için tarifler sunmaktadır.
    1. 40 μL destekli lipit çift katmanlı tampon ekleyin (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2; Tablo 1), kuyuya 5 mM SUV'un 10 μL'si ve 100 mM'lik CaCl2'nin 1 μL'si. SUV'ları bozmak için odaları bir yandan diğer yana yavaşça sallayın ve ardından 20 dakika boyunca 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.
      NOT: Buharlaşmayı sınırlamak için, ıslak mendille kapalı bir Petri kabında inkübe edin.
  4. Fazla lipitlerin yıkanması
    NOT: Bu adım, fazla SUV'ları kaldırır ve tampon değiştirme adımı görevi görür. Yıkarken çift katmanı pipet ucuyla kazımamak çok önemlidir; Cam açığa çıkarsa, septinler ve diğer birçok protein geri dönüşümsüz olarak bağlanacak ve etkili protein konsantrasyonunu azaltacaktır.
    1. Kuluçkadan sonra, çift katmanlı 6x'i 150 μL SLBB ile durulayın, kabarcıklardan kaçınırken her seferinde karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
      NOT: Reaksiyon kuyusunda toplam 200 μL için zaten mevcut olan 50 μL tampon ve SUV'lara doğrudan 150 μL ekleyin.
    2. Septinler veya tercih edilen farklı bir protein ile inkübe etmeye hazır olduğunuzda, çift katmanlı 6x'i 150 μL reaksiyon tamponu (RXN: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1.4 mg / mL BSA,% 0.14 metilselüloz, 1 mM BME) ile yıkayın.
      NOT: En iyi sonuçlar için, reaksiyon tamponunu taze tutun ve kabarcıkları önlemek için reaksiyonu iyice karıştırırken çok dikkatli olun.
    3. Son yıkama adımında, 125 μL reaksiyon tamponunu çıkarın ve kuyucukta 75 μL bırakın. TIRF mikroskobu 26 ile istenen konsantrasyonda ve görüntüde septin depolama tamponunda (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM BME) seyreltilmiş25 μL septin ekleyin.
      NOT: Bu testi ilk kez kurarken veya yeni bir lipit bileşimi eklerken, fotobeyazlatma sonrası floresan geri kazanımı (FRAP) kullanılarak lipitlerin yüzeyde serbestçe yayılmasını sağlamak iyi bir uygulamadır. İyileşme oranı farklı lipit bileşimleri için farklı ve doğal olarak serbest duran sistemlerden daha düşük olsa da, lipitler hareketsiz olmamalıdır.

Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Tampon (SLBB)
StokHacimSon konsantrasyon
2 M KCl1,5 mL300 mM
1 M HES200 μL20 mM
500 mM MgCl2 20 μL1 mM
Su8 mL
Reaksiyon Öncesi Tampon (PRB)
StokHacimSon konsantrasyon
2 M KCl166 μL33,3 mM
1 M HES500 μL50 mM
Su9,33 mL
Reaksiyon Tamponu
StokHacimSon konsantrasyon
2 M KCl166 μL33,3 mM
1 M HES300 μL50 mM
10 mg/mL BSA1,39 milyon L1.39 mg/mL
% 1 Metilselüloz1,39 milyon L0.0014
Su10 mL'ye kadar
Bme0,7 μL1 mM
Septin Depolama Arabelleği (SSB)
StokHacimSon konsantrasyon
2 M KCl1,5 mL300 mM
1 M HES500 μL50 mM
Su10 mL'ye kadar
Bme0,7 μL1 mM

Tablo 1: Desteklenen lipid çift katmanlı ve reaksiyonların hazırlanması için tampon bileşenleri. Tamponlara dahil edilen stok çözeltilerinin hacimleri ve her bir bileşenin nihai konsantrasyonları gösterilir. SLB ve PRB oda sıcaklığında saklanabilir ve deneyler arasında tekrar kullanılabilir. Reaksiyon tamponu ve SSB her deney için taze yapılır.

2. Küresel destekli lipit çift katmanlı

NOT: Bu protokol, ultra saf suda %10 yoğunlukta asılı duran silika mikrosferleri kullanır. Protein montajının kinetik parametreleri üzerine yapılan herhangi bir çalışma için, deneyler ve eğrilikler arasındaki toplam membran yüzey alanını kesinlikle kontrol etmek önemlidir. Tablo 2, toplam membran yüzey alanının 5mm2'sini korumak için düzeltilmiş boncuk ve tampon hacimlerini göstermektedir. Bu protokol daha önce yayımlanmış bir yöntem olan 8,18'i genişletir.

  1. Çift katmanlı oluşum
    NOT: Düzlemsel çift katmanlı modellere gelince, sağlam çift katmanlı oluşum için yüksek kaliteli SUV'lara sahip olmak önemlidir. Tablo 2, %10'luk bir yoğunluk çözeltisinden boncukların hacmini ve bir dizi boncuk çapı için 5mm2'lik bir nihai yüzey alanı elde etmek için kullanılan ilgili SLBB hacimlerini listeler.
    1. Silika mikrosferleri (boncuk olarak da adlandırılır) birbirine yerleşme ve kümelenme eğilimindedir; boncukları karıştırmak ve herhangi bir kümeyi parçalamak için, şişeyi 15 s için vorteks, daha sonra 1 dakika boyunca banyo sonikat ve 15 s için tekrar vorteks.
    2. Uygun boncuk hacmini (Tablo 2), 0,5 mL'lik düşük yapışkanlı bir mikrosantrifüj tüpünde karşılık gelen SLBB hacmi ve 10 μL 5 mM SUV ile karıştırın.
    3. Boncuk-lipit karışımını oda sıcaklığında 1 saat boyunca uçtan uca sallayın. Sedimantasyonu önlemek için bu inkübasyonun bir rotatörde yapıldığından emin olun.
  2. PEGylated coverslips üzerinde hazneler hazırlayın
    NOT: Düzlemsel çift katmanlara gelince, reaksiyon hacimlerini desteklemek için plastik PCR tüplerinden ev yapımı odalar kullanılır, ancak silikon kuyucuklar gibi diğer düşük yapışma malzemeleri de aynı şekilde çalışabilir.
    1. Boncuklar sallanırken, PEGylated bir kapak kaymasını oda sıcaklığında çözün. 0,2 mL'lik bir PCR tüpü kesin ve adım 1.2'de açıklandığı gibi kapak kapağına yapıştırın. 24 mm x 50 mm slaytlar için, 10 adede kadar hazne bir slayta uygun şekilde sığabilir.
      NOT: Bu protokol, önceden hazırlanmış 24 mm x 50 mm PEGile cam kapaklar kullanır. Kısaca, cam kapaklar aseton, metanol ve 3 M KOH'da sonikasyon yoluyla iyice temizlenir. Kapaklar daha sonra n-2-aminoetil-3-aminopropiltrimetoksisilan ile işlevselleştirilir ve kovalent olarak mPEG süksinimidil valerata bağlanır. Bitmiş PEGile kapak kapakları -80 ° C'de vakumla kapatılmış olarak saklanır. Benzer bir pasivasyon protokolü için lütfen Gidi ve ark.27'nin çalışmalarına bakınız. PEGile cam kapaklar burada önerilse de, BSA veya poli-L-lizin yöntemleri gibi diğer pasivasyon yöntemleri etkili olabilir.
  3. Fazla lipitlerin yıkanması
    NOT: Bu adım, fazla SUV'ları çıkarmak ve tampon değişimi gerçekleştirmek için çalışır. Boncuklar reaksiyon öncesi tampon ile toplamda 4 kat yıkanır (PRB: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4). Tablo 3 , bir dizi boncuk çapı için RCF'deki sıkma hızlarını listeler.
    1. Belirlenen RCF'de boncukları 30 sn için döndürün (Tablo 3). Birden fazla boncuk boyutu kullanıyorsanız, yıkanma zamanı gelene kadar boncukları sallamaya devam edin.
      NOT: Zamandan tasarruf etmek için daha büyük boncukları, daha küçük boncuk çökeltme hızına sahip küçük boncuklarla aynı dönüşte tortulamaya değmez. Bu, boncukların birbirine yapışmasına ve çift katmanın bütünlüğünü tehlikeye atmasına neden olabilir.
    2. İlk spinden sonra, 50 μL süpernatant çıkarın ve 200 μL PRB ekleyin. İkinci ve üçüncü spinlerden sonra, 200 μL'yi çıkarın ve 200 μL PRB ekleyin. Dördüncü spinden sonra, 200 μL'yi çıkarın ve 220 μL PRB ekleyin. Her yıkama için kuvvetli bir şekilde pipetleyin.
      NOT: Son süspansiyon hacmi, yıkamalardan farklıdır. Kuluçkadan sonra boncukları lipitlerle vortekse etmeyin, çünkü bu çift katmanlarda boşluklar bırakabilir. Diğer boncuk boyutlarıyla çalışırken veya tahlilin diğer kısımlarını kurarken çökelmeyi önlemek için, boncuk karışımlarını uçtan uca döndürücüye geri yerleştirin.
  4. Reaksiyonun hazırlanması
    NOT: Bu reaksiyon, reaksiyonun toplam membran yüzey alanını 5mm2'de korumak ve 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, %0,1 metilselüloz ve 1 mM BME nihai reaksiyon koşulu üretmek üzere tasarlanmıştır.
    1. Birden fazla boncuk boyutunda bir yarışma testi yapıyorsanız, her boncuk boyutunun eşit hacimlerini karıştırarak 1: 1'lik bir karışım yapın. Daha sonra, istenen boncuk karışımının (veya tek bir boncuğun) 29 μL'sini 721 μL RXN tamponu ile karıştırın.
      NOT: Yoğun boncuk kümelerini önlemek için boncukları her adımda bir pipetle iyice karıştırmak önemlidir; bu, daha eşit bir boncuk dağılımı ve doğru toplam yüzey alanı ile sonuçlanacaktır.
    2. 75 μL seyreltilmiş boncuk ve SSB'de seyreltilmiş 25 μL proteini kuyucuklara karıştırın.
      NOT: Yazarlar tipik olarak maya septin komplekslerini 1-50 nM'de görüntülerler.
    3. Septinleri kararlı bir durumda ölçüyorsanız, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin ve ardından TIRF'ye yakın veya konfokal mikroskopi ile görüntüleyin.
Boncuk Çapı (μm)İyi karıştırılmış boncukların hacmi (μL)SLB tampon birimi (μL)SUV hacmi (μL)
6.468.9461.110
5.0676310
3.174.3965.610
0.961.3368.710
0.540.7569.310
0.310.4369.610

Tablo 2: Normalleştirilmiş mikrosfer hacimleri. Her boncuk boyutunda eşit bir yüzey alanını korumak ve toplam membran yüzey alanını deneyler arasında tutarlı tutmak için, toplam yüzey alanını normalleştiren her boncuk boyutu ve tampon için hacimler hesaplanmıştır.

Boncuk çapı (μm)Sedimantasyon hızı (RCF)
0.314.5
0.544.5
0.962.3
3.170.8
5.060.3

Tablo 3: Farklı çaplardaki mikrosferler için çökeltme hızları. Her boncuk çapı için, gösterilen minimum çökeltme hızları, bağlanmamış lipozomları yıkamak için boncukları peletlemek için kullanıldı.

3. Çubuk destekli lipit çift katmanlı

NOT: Burada sunulan diğer testlerin aksine, çubuk testi toplam membran yüzey alanının dikkatli bir şekilde kontrol edilmesine izin vermez. Deneyler arasındaki miktar ve hacimlerde tutarlı olabilir, ancak bu farklı uzunluk ve çaplarda çubuklarla sonuçlandığından, reaksiyondaki toplam membran yüzey alanını tahmin etmek zordur. Bu nedenle, bu, tek bir yüzeyde birden fazla eğrilikle eğrilik algılamayı keşfetmek için mükemmel bir test olsa da ve septin ultrayapısını keşfetmek için yararlı olsa da, kinetik ölçümler için önerilmez. Bu yöntem daha önce18 olarak bildirilmişti ve burada genişletiliyor.

  1. Cam mikrofiber filtrelerden borosilikat çubukların elde edilmesi
    1. Tek bir 42,5 mm kalite GF/C cam mikrofiber filtreyi küçük parçalara ayırın ve 60 mL% 100 etanol içeren 100 mL'lik bir beherin içine yerleştirin. Çözelti opak hale gelene kadar banyo-sonikat; bu, ince parçalanmış bir filtreyle 20-30 dakika kadar kısa sürebilir.
      NOT: Büyük parçaları parçalamak için iyice sonikasyon; ne kadar ayrışmış/opak olursa o kadar iyidir.
    2. Çözeltiyi filmle örtün ve çözeltiyi gece boyunca oda sıcaklığında saklayın.
  2. Çubuklar üzerinde çift katmanlı oluşturma
    NOT: Bu adım, bu yöntemde toplam yüzey alanını ölçmek mümkün olmadığından tam çubuk kapsamı elde etmek için fazla lipitlerle gerçekleştirilir.
    1. Ertesi gün etanol çözeltisi yerleşecektir (adım 3.1.2.), bu yüzden kullanmadan önce iyice karıştırın. 10 μL çubuk çözeltisi ve 70 μL SLBB'yi birleştirin.
    2. 30 sn'lik mini bir santrifüjde en yüksek hızda döndürün ve süpernatanın 50 μL'sini çıkarın. Başka bir 50 μL SLBB'de tekrar askıya alın ve etanolün seyreltilmesi için toplam dört yıkama için spini tekrarlayın.
      NOT: Çubuk destekleri, tüpün dibinde katı bir pelet oluşturmaz. Bunun yerine tüpün yan tarafına bulaşır; bu, yıkama sırasında tamamen korunmalarını zorlaştırır. Bu tahlildeki toplam yüzey alanı kontrol edilmediğinden, rahatsız edilmeleri durumunda sorun olmaz.
    3. 10 μL iyi karıştırılmış çubuk çözeltisini 50 μL 5 mM SUV ve 20 μL SLBB ile birleştirin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin, mikrosferlerde çift katmanlar oluştururken olduğu gibi uçtan uca döndürün.
  3. Fazla lipitlerin yıkanması
    1. Adım 3.2.2.'ye benzer şekilde, membran kaplı çubukları çözeltiden çıkarmak için lipit çubuğu çözeltisini 30 sn'lik mini bir santrifüjde en yüksek hızda döndürün.
    2. İlk spinden sonra, süpernatantın 50 μL'sini çıkarın ve 200 μL PRB ekleyin. İkinci ve üçüncü spinlerden sonra, 200 μL'yi çıkarın ve 200 μL PRB ekleyin. Dördüncü spinden sonra 200 μL'yi çıkarın, 220 μL PRB ekleyin ve karıştırmak için kuvvetli bir şekilde pipet ekleyin.
  4. Reaksiyonun hazırlanması
    1. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 721 μL reaksiyon tamponunu 29 μL çubuk çözeltisi ile karıştırın. İyice karıştırın.
    2. 0.2 mL'lik bir PCR tüpünde, SSB'de seyreltilmiş 75 μL çubukları reaksiyon tamponunda ve 25 μL septinleri istenen konsantrasyonda birleştirin. Oda sıcaklığında en az 1 saat inkübe etmesine izin verin.
  5. Taramalı elektron mikroskobu için hazırlık
    1. Kuluçkadan sonra, 100 μL septin-çubuk karışımını yuvarlak, PEG kaplı 12 mm'lik bir kapak kayması üzerine ekleyin ve kapalı bir Petri kabında 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
    2. Petri kabının tabanını (10 mL yeterli olmalıdır) 0,05 M sodyum kakodidat (NaCo), pH 7,4'te 30 dakika boyunca% 2,5 glutaraldehit ile doldurarak numuneyi sabitleyin. Sıvıyı bir cam pipetle aspire edin. Numuneyi 5 dakika boyunca 10 mL 0,05 M NaCo ile inkübe ederek yıkayın ve toplam iki yıkama için tekrarlayın.
    3. 30 dakika boyunca %0,5 OsO4 kakodilat tamponunda son ek ve ardından 0,05 M NaCo'da (5 dakika/yıkama) 3x yıkayın.
    4. Numuneyi 15 dakika boyunca% 1 tanik asitle inkübe edin ve ardından NaCo 3x'te yıkayın. % 0,5 OsO4'te 15 dakika boyunca inkübe edin ve NaCo ile 3 kat yıkayın.
    5. Artan etanol konsantrasyonları kullanarak numuneleri kurutun: 5 dakika, 2x için% 30 EtOH; 5 dakika boyunca% 50 EtOH; 5 dakika boyunca% 75 EtOH; ve 5 dakika, 2x için% 100 EtOH. Başka bir 10 dakikalık inkübasyon ile takip edin.
    6. Geçiş sıvısında (hekzametildilazana) 3x (5 dakika, 10 dakika, sonra 5 dakika) inkübe edin.
    7. Hava kurumasına izin verin, ardından numuneleri püskürtme kaplamasına kadar bir kurutucuya yerleştirin. 4 nm tabakayı bir altın/paladyum alaşımı ile püskürtün ve ardından taramalı elektron mikroskobunda görüntüleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Her SLB'nin hazırlanmasını takiben, septinler veya ilgilenilen protein istenen destekle inkübe edilebilir ve TIRFM, konfokal mikroskopi veya SEM ile görüntülenebilir. Burada gösterilen sonuçlar, E. coli17'den rekombinant olarak eksprese edilen ve saflaştırılan septinleri kullanır. Düzlemsel SLB'lerde TIRFM kullanılarak, filamentlerin uzunluğunu ve esnekliklerini belirlemek, difüzyon katsayılarını ölçmek ve zaman içinde montajı gözlemlemek mümkündür28,29<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hücre zarları birçok farklı şekil, eğrilik ve fizikokimyasal özellik kazanır. Hücrelerin mikrometre ölçeğinde montajlar oluşturduğu nanometre ölçekli makineleri incelemek için, membran mimetiklerinin minimal sulandırma sistemlerini tasarlamak gerekir. Bu protokol, hem membran eğriliğini hem de bileşimi hassas bir şekilde kontrol eden teknikler sunarken, kullanıcının yaygın olarak bulunan mikroskopi tekniklerini kullanarak kantitatif floresan ölçümlerini kolayca almasını sağlar.

Bu protokolün e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibe No tarafından desteklenmiştir. R01 GM-130934 ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) MCB-2016022 hibe eder. B.N.C, E.J.D.V. ve K.S.C., T32 GM119999 ödülü kapsamında Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden bir hibe ile kısmen desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Düz kapaklı 0,2 mL PCR Tüpleri, NaturalWatson137-211C(EX)
0,5 mL düşük yapışma tüpleriUSA Scientific1405-2600
Beta merkaptoetanol (BME)Sigma-AldrichM6250-100ML
Sığır Serumu Albümini (BSA)Sigma-AldrichA4612-25G
PEGile lamel yapmak için kapak camıThermo Bilimsel152450Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Kapak Camı 24x50 # 1.5
DOPCAvanti Polar Lipidler850375
Yumurta Liss Rhodamine PEAvanti Polar Lipidler810146
EMS Glutaraldehit Sulu %25, EM SınıfıVWR16220
EMS Sodyum Kakodilat TamponuVWR11652
Etanol, 200 kanıtFisher Scientific04-355-223EA
HEPESSigma AldrichH3375-1KG
HeksametildisilazanenSigma-Aldrich440191
Magnezyum klorürVWR7791-18-6
Metil selüloz 4000cpSigma-AldrichM052-100G
Düzlemsel çift katmanlıMatsunamiiçin mikrocam lamellerÜretimi Durdurulan22x22
Mini Santrifüj
İşlevselleştirilmemiş Silika MikrokürelerBangs Laboratories, Inc.Boyuta bağlıdır: SS0200 * -SS0500 *Sulu süspansiyonda silika
Optik YapıştırıcıNorland ThorlabsNOA 68Cam veya plastikler için esnek yapıştırıcı
Osmiyum tetroksitMillipore Sigma20816-12-0
ParafilmVWR52858-000
Plazma TemizleyiciPlazma AşındırmaPE-25Voltaj: 120V, 60Hz. Akım: 15 AMPER
Potasyum klorürVWR0395-1kg
Yuvarlak kapak camı, #1.5 12mm   VWR64-0712
Sonikatör banyosuBranson1510R-MTBransonic Ultrasonik temizleyici. 50-60 Hz. Çıkış: 70W
Soy PIAvanti Polar Lipidler840044
Masaüstü santrifüjEppendorf22331
UV LambasıSpektrolineENF-260C115 Volt, 60 Hz, 0.20 AMPER
WhatmanGlass Mikrofiber Filtre KağıdıVWR28455-03042,5 mm çap, Grade GF/C

Kaynaklar

  1. Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
  2. Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
  3. Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
  4. Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
  5. Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  6. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
  7. Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
  8. Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
  9. Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916(2014).
  10. Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
  11. Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
  12. Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
  13. Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118(2021).
  14. Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
  15. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420(2019).
  16. Lou, H. -Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  17. Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
  18. Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
  19. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  20. Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511(2021).
  21. Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
  22. Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
  23. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  24. Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
  25. Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
  26. Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29(2012).
  27. Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
  28. Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
  29. Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
  30. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457(2016).
  31. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
  32. Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
  33. Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
  34. Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
  35. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
  36. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Membran Rekonstit syonuDestekli Lipid ift TabakalarProtein Membran Etkile imiSeptin Filament Olu umuE rilik Alg lamasTIRF MikroskopisiKonfokal MikroskopiLipozom Haz rlama

İlgili makaleler