Yöntem makalesi

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

3.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64096

⸱

1 Ağustos 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, iDISCO + kullanarak bozulmamış fare beyinlerinin manyetik rezonans görüntüleme, temizleme ve immünoetiketleme yöntemlerini açıklar, ardından ışık tabakası mikroskobu kullanılarak görüntülemenin ayrıntılı bir açıklaması ve NuMorph kullanılarak aşağı akış analizleri yapılır.

Özet

Doku temizlemenin ardından ışık tabakası mikroskobu (LSFM), bozulmamış beyin yapısının hücresel çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayarak genetik veya çevresel bozulmaların neden olduğu yapısal değişikliklerin nicel analizine izin verir. Tüm beyin görüntülemesi, hücrelerin daha doğru bir şekilde ölçülmesi ve fiziksel olarak kesitlenmiş dokunun yaygın olarak kullanılan mikroskopisi ile gözden kaçırılabilecek bölgeye özgü farklılıkların incelenmesi ile sonuçlanır. Temizlenmiş beyinleri görüntülemek için ışık tabakası mikroskobu kullanmak, konfokal mikroskopiye kıyasla edinme hızını büyük ölçüde artırır. Bu görüntüler çok büyük miktarlarda beyin yapısal verisi üretmesine rağmen, temizlenmiş doku görüntülerinde özellik ölçümü yapan çoğu hesaplama aracı, tüm çekirdeklerden ziyade seyrek hücre popülasyonlarını saymakla sınırlıdır.

Burada, bir ışık tabakası mikroskobunda temizlendikten ve görüntülendikten sonra, doğum sonrası 4. gün (P4) fare beyninin açıklamalı bölgelerindeki tüm çekirdekleri ve nükleer belirteçleri ölçmek için bir grup analiz aracı olan NuMorph'u (Nükleer Tabanlı Morfometri) gösteriyoruz. Doku temizleme dehidrasyon adımlarının neden olduğu büzülmeden önce beyin hacmini ölçmek için manyetik rezonans görüntülemeyi (MRG), immünoetiketleme de dahil olmak üzere iDISCO + yöntemini kullanarak doku temizlemeyi ve ardından fare beyinlerini hücresel çözünürlükte görüntülemek için ticari olarak temin edilebilen bir platform kullanarak ışık tabakası mikroskobu kullanıyoruz. Daha sonra, yoğunluk farklılıklarını düzeltmek, görüntü döşemelerini dikmek, birden fazla kanalı hizalamak, çekirdekleri saymak ve genel kullanıma açık atlaslara kayıt yoluyla beyin bölgelerine açıklama eklemek için kullanılan NuMorph'u kullanarak bu görüntü analizi işlem hattını gösteriyoruz.

Bu yaklaşımı, gerekli mikroskop ve hesaplama kaynaklarına sahip herhangi bir araştırmacının bu teknikleri gerçekleştirmesine izin veren halka açık protokolleri ve yazılımları kullanarak tasarladık. Bu doku temizleme, görüntüleme ve hesaplama araçları, korteksteki hücre tiplerinin üç boyutlu (3B) organizasyonunun ölçülmesine ve nicelleştirilmesine izin verir ve herhangi bir vahşi tip / nakavt fare çalışması tasarımına yaygın olarak uygulanmalıdır.

Giriş

Tek hücreli çözünürlükte tüm beyin görüntüleme, nörobilimde önemli bir zorluktur. Hücresel çözünürlüklü beyin görüntüleri, beyin devresinin ayrıntılı analizine ve sistem düzeyinde haritalandırılmasına ve bu devrenin nöropsikiyatrik bozukluklar için genetik veya çevresel risk faktörleri, gelişmekte olan embriyolardaki hücresel davranış ve yetişkin beynindeki nöral devreler tarafından nasıl bozulduğuna izin verir 1,2,3. Yeniden yapılandırılmış 3D beynin yüksek çözünürlüklü görüntülerine izin veren birden fazla histolojik yöntem vardır; Bununla birlikte, bu teknikler pahalı, özel ekipman gerektirir, immünoetiketleme ile uyumlu olmayabilir ve bazı yöntemlerin iki boyutlu (2D) doğası, 4,5 kesiti sırasında doku hasarına ve kesmeye neden olabilir.

Son gelişmeler, doku kesiti gerektirmeyen tüm beyinleri görüntülemek için alternatif bir yaklaşım sağlamıştır; beyinleri şeffaf hale getirmek için doku temizlemeyi kullanmayı içerirler. Çoğu doku temizleme yönteminde şeffaflık, hem ışık saçılmasının önemli bir kaynağı oldukları için lipitlerin çıkarılması hem de görüntüleme sırasında nesnenin kırılma indisinin (RI) numune daldırma çözeltisinin RI ile eşleştirilmesi ile sağlanır. Işık daha sonradağılmadan malzemeler arasındaki sınırdan geçebilir 6,7,8,9.

İDISCO+ gibi doku temizleme yöntemleri genellikle LSFM 6,7,10 gibi tek foton uyarma mikroskobu kullanılarak hızlı 3D görüntüleme ile birleştirilir. Florofor ile etiketlenmiş şeffaf dokular içinde, ışık tabakası floresan mikroskopi, ince bir ışık düzlemi ile uyarılarak bölümlerhalinde görüntülenir 11. LSFM'nin temel avantajı, bir seferde tek bir optik bölümün aydınlatılması, bu bölümdeki moleküllerden gelen tüm floresanların uyarılması ve bu da fotobeyazlatmayı en aza indirmesidir. Dahası, tüm optik dilimin görüntülenmesi, bu heyecanlı dilimin kamera tabanlı algılanmasını sağlayarak nokta tarama12'ye göre hızı artırır. LSFM, tahribatsız bir şekilde, 3D rekonstrüksiyon için uygun olan iyi kaydedilmiş optik bölümler üretir.

iDISCO + yöntemi ~ 3 hafta içinde ucuz doku temizlemeye izin verirken, protokoldeki dehidrasyon adımları doku büzülmesine ve numune morfolojisinin potansiyel olarak değişmesine neden olabilir, böylece hacimsel ölçümleri etkileyebilir 6,10. Doku temizleme prosedüründen önce kullanılacak MRI gibi ikincil bir görüntüleme yönteminin eklenmesi, numune boyunca doku temizlemeye bağlı büzülme derecesini ölçebilir. Dehidrasyon aşamaları sırasında, gri ve beyaz cevher arasındaki mekanik özelliklerdeki farklılıklar, düzgün olmayan beyin maddesi deformasyonlarına yol açabilir, bu da vahşi tip ve mutant numuneler arasında farklı doku temizlemeye bağlı hacim deformasyonlarına neden olabilir ve bu numunelerdeki hacimsel farklılıkların yorumlarını karıştırabilir10,13 . MRG, ilk önce hayvanı bir kontrast madde (örneğin, gadolinyum) ile perfüze ederek, ardından görüntüleme14'ten önce ekstrakte edilen dokuyu bir daldırma çözeltisinde (örneğin, fomblin) inkübe ederek gerçekleştirilir. MRG, doku temizleme ve aynı numune üzerinde LSFM yapılması ile uyumludur.

LSFM genellikle beyin yapısının nicel olarak değerlendirilmesinden ziyade, ilgilenilen beyin dokusunun kalitatif görselleştirmesi için büyük ölçekli mikroskopi görüntüleri oluşturmak için kullanılır (Şekil 1). Nicel değerlendirme olmadan, genetik veya çevresel hakaretlerden kaynaklanan yapısal farklılıkları göstermek zordur. Doku temizleme ve görüntüleme teknolojileri geliştikçe, depolama ve hesaplama gücünün maliyetlerinin azalmasıyla birlikte, ilgilenilen doku içindeki hücre tipi lokalizasyonlarını ölçmek daha erişilebilir hale geliyor ve daha fazla araştırmacının bu verileri çalışmalarına dahil etmesine izin veriyor.

Fare beynindeki 100 milyondan fazla hücre15 ve terabaytlarca veri üretebilen tüm beyin görüntüleme oturumlarıyla, hücreler gibi görüntülerdeki özelliklerin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayan gelişmiş görüntü analiz araçlarına olan talep artmaktadır. Nükleer boyama yoğunluğu için eşik uygulayan ve önceden tanımlanmış şekil, boyut veya yoğunluklara sahip nesneleri filtreleyen doku temizlenmiş görüntüler için bir dizi segmentasyon yöntemi mevcuttur10,16,17,18. Bununla birlikte, sonuçların yanlış yorumlanması, hücre boyutu, görüntü kontrastı ve etiketleme yoğunluğu gibi parametrelerdeki değişikliklerden kaynaklanabilir. Bu makale, fare beynindeki hücre çekirdeklerini ölçmek için kurulan protokolümüzü açıklamaktadır. İlk olarak, P4 fare beyninin doku toplanması için adımları detaylandırıyoruz, ardından halka açık iDISCO+ yöntem10'dan optimize edilmiş bir doku temizleme ve immünoetiketleme protokolü izliyoruz. İkincisi, görüntü yakalama için kullanılan parametreler de dahil olmak üzere MRI ve ışık tabakası mikroskobu kullanarak görüntü yakalamayı açıklıyoruz. Son olarak, grubumuzun geliştirdiği, doku temizleme, nükleer belirteçlerle immünoetiketleme ve açıklamalı bölgelerin ışık tabakası görüntülemesinden sonra hücre tipine özgü nicelleştirmeye izin veren bir dizi görüntü analiz aracı olan NuMorph19'u tanımlıyoruz ve gösteriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm fareler, Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak kullanılmış ve onaylanmıştır.

1. Fare diseksiyonu ve perfüzyonu

NOT: Aşağıdaki diseksiyonlar P4 ve P14 farelerde bir şırınga kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Perfüzyon sıvısının hacmi, hayvanın yaşına bağlı olarak değişecektir.

  1. Perfüzyon
    DİKKAT: Paraformaldehit (PFA) tehlikeli bir kimyasaldır. Tüm perfüzyon adımlarını kimyasal bir duman davlumbazında gerçekleştirin.
    1. Ameliyattan önce, intraperitoneal enjeksiyon (100 mg / kg) yoluyla pentobarbital uygulayın ve anestezinin etkili olmasına izin verin.
    2. Hayvan cerrahi bir anestezi düzlemine ulaştığında, tepkisizliği doğrulamak için ayak parmağını sıkıştırma yanıt yöntemini kullanın.
    3. Hayvanın göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için göğüs kafesinin altında yanal bir kesi yapın.
    4. Kavisli, cerrahi makas kullanarak, göğüs kafesinden hayvanın bir tarafındaki köprücük kemiğine kadar dikkatlice kesin ve karşı tarafta aynı kesimi yaparak sternumun kaldırılmasına izin vererek kalbi açığa çıkarın.
    5. İnen aortlara zarar vermeden, kanın vaskülatürden dışarı akmasına izin vermek için sağ atriyumda küçük bir kesi yapmadan önce kalbe bağlı herhangi bir dokuyu dikkatlice kesin.
    6. Şırınga bazlı bir yöntem kullanarak, fareyi sol ventrikülden sırasıyla P14 ve P4 için 10 mL ve 7 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile perfüzyon hızı sistem üzerinden 1,5 mL / dak perfüzyon hızıyla perfüze edin.
    7. Kan temizlendikten sonra, hayvanı sabitlemek için 1,5 mL / dak perfüzyon hızı ile sırasıyla P14 ve P4 için 10 mL PBS +% 4 PFA +% 4 PFA ile 4 ° C'de tekrar perfüze edin.
      NOT: Fiksasyon titremeleri gözlenecek ve hayvan tamamlandığında sert olacaktır. Numunelerde MRG kullanılıyorsa, PFA çözeltisinde her zaman noktası + %20 gadolinyum bazlı MRI kontrast maddesi için benzer hacimlerde PBS ve PFA ile perfüze edin.
    8. Cerrahi makas kullanarak kafayı çıkarın ve tam fiksasyon için 4 ° C'de 24 saat boyunca PBS +% 4 PFA ile damla sabitleyin.
      NOT: Bu aşamada, beyin kafatası açıkken bozulmadan kalır (bakınız Bölüm 2). Duraklama noktası: beyinler bu aşamada birkaç ay boyunca PBS +% 0.1 sodyum azidde 4 ° C'de depolanabilir.

2. Sağlam kafatası ile MR tabanlı brüt beyin yapısı görüntüleme ve analiz

NOT: Beyin, kafatasından çıkarılmadan yukarıda tarif edildiği gibi gadolinyumda perfüze edilmeli ve inkübe edilmelidir. Tüm MRG, diseksiyon sırasında istenmeyen doku kaybını önlemek için beynin kafatasından çıkarılmasından önce gerçekleşir. Sağlam bir kafatası ile görüntüleme, numune hazırlama ve görüntüleme sırasında numune tutucudaki beyne (yani şırınga) destek sağlar.

  1. Numune hazırlama
    NOT: Aşağıdaki adımlar P4 ve P14 fare beyin örnekleri için optimize edilmiştir. Gerekli şırınga boyutu, numunenin fiziksel boyutuna bağlı olacaktır.
    1. Numune üzerinde MRG yapıyorsanız, cildi kafatasından çıkarın ve görüntülemeden önce 4 ° C'de 23 gün boyunca PBS +% 3 gadolinyum içinde inkübe edin14. 23 gün sonra, numuneleri PBS'de hızlı bir şekilde durulayın.
    2. MRG için bir numune tutucu oluşturmak için 5 mL şırıngalar kullanın, şırınga20 ile yapılan tutucunun her bir ucunu kapatmak için şırınga pistonları kullanın. Kafatasını tutucuda sıkıca yerinde tutmak için plastik parçalar kullanın (Şekil 2A). Görüntüleme sırasında artefaktları önlemek için şırınga üzerindeki işaretleri etanol ile çıkarın.
    3. Kafatasını numune tutucuya güvenli bir şekilde yerleştirin ve MRI ile uyumlu bir daldırma çözeltisi ile doldurun ( Malzeme Tablosuna bakın). Tutucuyu kapatın ve bir şırınga kullanarak tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
      NOT: Duraklama noktası: Kafatası, görüntülemeden önce birkaç ay boyunca daldırma çözeltisinde saklanabilir.
  2. Brüt beyin yapısı görüntüleme (MRG)
    1. Numuneleri, 15 mm'lik hacimli bir bobin ve aşağıdaki parametrelere sahip spin-echo tabanlı bir dizi kullanarak 9,4T/30 cm yatay delikli, hayvan MRI sistemi ile görüntüleyin: Uzamsal çözünürlük: 60 μm x 60 μm x60 μm; toplam tarama süresi: 7 saat 12 dakika; yankı süresi (TE): 6,83 ms; tekrarlama süresi (TR): 40 ms; uyarma/yeniden odaklama çevirme açıları: 90/180 derece; resim boyutu:166 x 168 x 209 voksel; Görüş alanı (FOV): 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm; bant genişliği: 100.000 kHz.
  3. Hesaplamalı brüt beyin yapısı analizi
    1. Segmentasyon yazılımını kullanarak fare beynini manuel olarak izleyerek çevredeki kafatasını ham MRI görüntülerinden çıkarın. Ardından, kafatası soyulmuş beyin MRI görüntüsünü oluşturmak için maske görüntüsü ile ham MRI görüntüsü arasında voksel olarak çarpma işlemini uygulayın.
      NOT: Çıktı, aksi takdirde beyin voksellerinin yoğunluğunun 1 ve 0 olarak ayarlandığı ikili bir maske görüntüsüdür.
    2. FSL paketi21,22'deki 'flirt' kullanarak kafatası soyulmuş MRI görüntüsünü (hareketli görüntü) karşılık gelen ışık tabakası mikroskopi görüntüsüne (referans görüntü) hizalamak için katı görüntü kaydı (yalnızca çeviri ve rotasyonu tahmin ederek) uygulayın.
    3. Adım 2.3.2'deki rijit hizalanmış MRI görüntüsü ile ışık sayfası görüntüsü (adım2.3.2'deki aynı referans görüntüsü) arasındaki noktadan noktaya yazışmaları bulmak için katı olmayan kayıt uygulayın (ANTS yazılımı 23'te 'SyN' kullanarak).
      NOT: Çıktı, çarpık MRI görüntüsünü ve MRG'den ışık sayfası görüntülerine hacim değişiklikleriyle ilişkili deformasyon alanını içerir.
    4. Adım 2.3.3'te oluşturulan deformasyon alanındaki Jacobian determinantını hesaplayın, bu da 3 x 3 x 3 voksel yerel mahallesindeki hacim değişimini ölçer.
    5. Deforme edilebilir görüntü kaydını kullanarak kafatası soyulmuş görüntüleri Allen Gelişimsel Fare Beyin Atlası ile hizalayın.
      NOT: Kurulan uzamsal noktadan noktaya yazışmalar, yeni fare görüntüsündeki ilgilenilen beyin bölgelerinin otomatik olarak açıklanmasına izin verir (Şekil 2C-H).

3. Kafatasından beyin diseksiyonu

  1. Kafatasını ortaya çıkarmak için kafatasının üst kısmı boyunca boyundan buruna kadar bir orta hat kesisi yapın.
  2. Kalan boyun kasını ve diğer tüm artık kasları keserek kafatasının tabanını ortaya çıkarın.
  3. Keskin cerrahi makas kullanarak, kafatasının iç yüzeyi boyunca dikkatlice kesin, keskin cerrahi ekipmanla kesim yaparken hafif bir yukarı doğru basıncı koruyarak beyne zarar vermemeye özen gösterin.
  4. Kafatasının iki kesilmiş yarısını beyinden uzaklaştırmak için cımbız kullanın ve beyne bağlı fazla yağları dikkatlice kesin.
  5. Beyni kafatasına bağlayan herhangi bir durayı kesmek için cerrahi bir makas kullanın ve ardından beyni kafadan nazikçe çıkarmak için bir spatula kullanın.
  6. Beyni çıkarın, PBS ile yıkayın ve% 0.1 sodyum azid ile PBS'ye geçin ve uzun süreli depolama için 4 ° C'de tutun.

4. Doku temizleme

NOT: Bu protokol, P4 fareler6 için iDISCO+ protokolünden küçük değişikliklerle uyarlanmıştır. Bazı detaylar farklı zaman noktaları/türler/deneyler için değişebilir). DİKKAT: Metanol, diklorometan (DCM) ve dibenzil eter (DBE) tehlikeli kimyasallardır. Bu doku temizleme adımları kimyasal bir duman davlumbazında gerçekleştirilir.

  1. Antikor doğrulaması
    NOT: Test edilmemiş antikorların metanol uyumluluğu, iDISCO + protokolünde gerekli olan sert metanol yıkamalarından olumsuz etkilenebileceğinden kontrol edilmelidir. iDISCO+ 'da çalıştığı gösterilen antikorların listesi için24 numaralı web sitesine bakın.
    1. PFA ile sabitlenmiş dokunun 10 μm dondurulmuş bölümlerini stereolojik slaytlara hasat edin.
    2. Bölümleri oda sıcaklığında 3 saat boyunca% 100 metanol içinde inkübe edin.
    3. Metanol yıkandıktan sonra antikorun beklenen floresan paternini gösterip göstermediğini belirlemek için standart immünohistokimya protokollerine geçmeden önce PBS'de rehidrat. Pozitif kontrol için, metanol ile muamele edilmemiş bir slayt kullanın.
  2. Tampon hazırlama
    1. Arabellekleri resmi iDISCO protokolüne göre hazırlayın. Bu protokolde kullanılan tamponların ve diğer çözeltilerin bileşimi için Malzeme Tablosuna bakınız.
  3. Ön işlem
    1. Numuneyi metanol / PBS serisi ile kurutun: % 20,% 40,% 60,% 80,% 100; Oda sıcaklığında her biri 1 saat.
      NOT: Dehidrasyon sırasında PBS kullanılması, metanol yıkamalarında numunelerin çatlamasını önlemeye yardımcı olur.
    2. Numuneyi 1 saat boyunca% 100 metanol içinde yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında% 66 DCM / % 33 metanol içinde çalkalayarak gece boyunca inkübe etmeden önce 1 saat boyunca 4 ° C'de soğutun.
    3. Numuneyi oda sıcaklığında% 100 metanol içinde 2x yıkayın ve ardından 4 ° C'de soğutun.
    4. Numuneyi 4 ° C'de gece boyunca ağartmak için metanol içinde taze%5 H 2O2 kullanın.
    5. Numuneyi metanol / PBS serisi ile rehidre edin: % 80,% 60,% 40,% 20, PBS; Oda sıcaklığında her biri 1 saat ve oda sıcaklığında PTx.2'de 1 saat boyunca 2x yıkayın.
    6. Numuneyi gece boyunca 37 °C'de 1x PBS/%0,2 TritonX-100/%20 DMSO'da inkübe edin.
    7. Numuneyi gece boyunca 37 °C'de 1x PBS / % 0.1 Tween-20 / 0.1% TritonX-100 / % 0.1 Deoksikolat / % 0.1 NP40 / 20% DMSO'da inkübe edin.
    8. PTx.2'de oda sıcaklığında 1 saat iki kez yıkayın.
  4. İmmünoetiketleme
    1. Permeabilizasyon Çözeltisindeki numuneleri 2 gün (~ 48 saat) boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Numuneleri Bloke Çözeltisinde 37 ° C'de 2 gün (~ 48 saat) bloke edin.
    3. Birincil antikoru olan örnekleri 4 gün boyunca (~96 saat) 37 °C'de PTwH / %5 DMSO / %3 Serumda inkübe edin (örneğin, tavşan (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1:100) ve anti-Ctip2 sıçan (Rt) antikoru (1:400) (Malzeme Tablosu).
    4. PTwH'de 3 x 1 saat yıkayın. PTwH'de 2 saat daha yıkayın.
    5. Numuneleri ikincil antikor ve TO-PRO-3 gibi nükleer bir boya ile 4 gün boyunca 37 ° C'de PTwH / %3 Serumda (~ 96 saat; örneğin, keçi anti-Rb (1:50) ve (keçi anti-Rt (1:200)) (Malzeme Tablosu) inkübe edin.
    6. PTwH'de 3 x 1 saat yıkayın PTwH'de 2 saat daha yıkayın.
  5. Temizleme
    1. Metanol / PBS serisinde dehidrat, oda sıcaklığında her biri% 20,% 40,% 60,% 80,% 100-1 saat. Oda sıcaklığında% 66 DCM / % 33 metanol içinde, çalkalanma ile 3 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Numune, %100 metanol içinde dehidrasyondan hemen sonra gece boyunca oda sıcaklığında bırakılabilir.
    2. MeOH'yi yıkamak için oda sıcaklığında (çalkalanma ile) iki kez 15 dakika boyunca% 100 DCM'de inkübe edin.
    3. Oda sıcaklığında sallanmadan dibenzil eter (DBE) içinde inkübe edin. Numunenin oksidasyonunu önlemek için tüpün neredeyse tamamen DBE ile doldurulduğundan emin olun. Görüntülemeden önce birkaç kez ters çevirerek çözeltiyi karıştırmayı bitirin.

5. Işık tabakası görüntüleme

NOT: iDISCO doku temizlemeli beyinler, korteks içinde tek hücreli çözünürlüğe izin verdiği için P4 zaman noktası için 2X/0.5 NA hedef, tamamlayıcı bir metal oksit yarı iletken kamera ve 0.75 x 0.75 x 4 μm/voksel'de mikroskop çalıştırma ve görüntü alma yazılımı ile donatılmış bir ışık tabakası mikroskobu ile görüntülenmiştir (Şekil 3A,B).

  1. Örnek montaj
    1. Numuneyi, doğru numune boyutu tutucusuna, ışık tabakası mikroskobunun nominal çalışma mesafesi nedeniyle numunenin en fazla 5,2 mm derinlikte z boyutuyla yönlendirileceği şekilde dikkatlice monte edin (5,7 mm eksi 0,5 mm güvenlik marjı)25.
    2. Tutucuyu numune yuvasına, tutucunun vidası ile beşik desteklerine 45° açıyla yerleştirin (Şekil 1B). Beşiği, ışık yolu numuneye dik olacak şekilde konumlandırın (Şekil 1C).
  2. Görüntüleme parametreleri
    1. Mikroskoptaki yakınlaştırma gövdesini 4x büyütmeye veya 0,75 μm/piksel üreten daha yüksek bir değere ayarlayın.
      NOT: P4 ışık yaprağı görüntüleri üzerindeki tek hücreli hesaplamalı analizler, 0,75 x 0,75 x 4 μm / voksel veya daha yüksek çözünürlüğe izin veren, piyasada bulunan herhangi bir ışık tabakası mikroskobu ile yapılabilir. Daha düşük bir çözünürlük, çekirdeklerin daha seyrek dağıldığı daha sonraki zaman noktalarındaki beyinler için yeterlidir.
    2. Görüntü yakalama yazılımında, NA = ~ 0,08 (9 μm kalınlık/4 μm z adım) olan tek bir ışık tabakası seçin.
      NOT: Bu ayar, yatay dinamik odaklama ile birleştirildiğinde, makul bir süre içinde bir fare beyninin tek hücreli çözünürlüğünde tüm beyin görüntülemesine olanak tanır. Doğum sonrası 4. gün (P4) beyin için, görüntü alma süresinin beynin büyüklüğüne bağlı olarak üç kanal için 11-15 saat olduğu tahmin edilmektedir.
    3. Eksenel çözünürlüğün görüntünün genişliği boyunca korunmasını sağlamak için Yatay Dinamik Odaklama'yı seçin ve lazer dalga boyuna bağlı olarak önerilen adım sayısını uygulayın. Bütün bir P4 fare beyni için, yatay dinamik odaklamayı 11 olarak ayarlayın. Her kanal için İnce Netlemeyi kayıt kanalına göre ayarlayın.
      NOT: Burada, TO-PRO-3 kanalı (647 nm), Allen Gelişimsel Fare Beyin Atlası'na kayıtlıdır, çünkü bu tüm çekirdekleri etiketler.
    4. Kanal başına lazer gücünü kanal özelliklerine göre ayarlayın.
      NOT: Daha uzun dalga boyları, daha kısa dalga boylarına kıyasla daha yüksek lazer gücü gerektirir. Örneğin, 780 nm'nin yüksek lazer gücünde (% 70 -% 75) ve düşük pozlamada (50 ms) görüntülenmesi gerekirken, 647 nm kanalın ortalama bir lazer gücü (% 40 -% 45) ve düşük pozlama (50 ms) gerektirmektedir.
    5. Levha gücünün bu örnek boyutu için y boyutunda en uygun şekilde dağıtıldığından emin olmak için Işık Tabakası Genişliğini ~%50'ye ayarlayın.
      NOT: Yatay dinamik odaklama ile birlikte, %50 tabaka genişliği, görüntü boyunca ortalama bir güç dağılımı sağlar ve fotobeyazlatma riskini azaltır25.
    6. Kutucuklar arasında önerilen %15'lik bir Örtüşme ile numunenin boyutuna göre Kutucuk Sayısı'nı ayarlayın ve belirli bir döşeme konumundaki her yığın için sırayla her kanal için görüntüler yakalayın.

6. NuMorph kullanarak görüntü işleme

NOT: NuMorph işlem hattının 3B görüntü analizi için üç ana bölümü vardır: ön işleme, analiz ve değerlendirme. Bu bölümler, aşağıda tartışılan sırasıyla NMp_template, NMa_template ve NMe_template olarak düzenlenmiştir. Ayrıca, NuMorph'un sorunsuz çalışması için gereken yazılım paketlerini indirmek ve yüklemek için NM_setup.m eklenmiştir. NM_samples.m ayrıca görüntü alma bilgilerini girmek için bir şablon sağlar.

  1. NuMorph kurulumu
    1. Linux26 için conda ortam yöneticisini indirin ve yükleyin. NuMorph19 görüntü işleme araçlarını indirin ve yükleyin.
    2. Komut satırında Matlab'ı çalıştırın. Analizler için gereken görüntü analizi yazılım paketlerini indirmek ve yüklemek için NuMorph'tan NM_setup.m dosyasını çalıştırın.
      NOT: Bu adım, conda ortamının doğru şekilde kurulmasını ve Matlab'ın üç işlem hattının her birini çalıştırması için gereken tüm araçların ve eklentilerin doğru şekilde indirilmesini ve kurulmasını sağlar. Burada en dikkat çekici olanı, kayıt çalıştırmak için Elastix ve hücre algılama ve sayma için 3D-Unet'tir.
  2. Dosyayı NM_samples düzenleyerek örnek adlarını, giriş ve çıkış dizinlerini, kanal bilgilerini ve ışık sayfası görüntüleme parametrelerini belirtin.
    NOT: Burada, doğru bilgilerin, özellikle de görüntü giriş dizininin doğru şekilde belirtildiğinden emin olmak için iki kez kontrol etmeniz önerilir. Sonraki adımlar çalıştırılana kadar hatalar genellikle burada çağrılmaz.
  3. Görüntü ön işleme
    1. Yoğunluk ayarı
      1. NMp_template, yoğunluk ayarı = true olarak ayarlayın.
        NOT: Yoğunluk ayarı gerekiyorsa true olarak ayarlayın. Değilse, yoğunluk ayarını ayarlayın = false. Önceki ayarlama parametrelerinin üzerine yazmak için 'güncelleme' kullanma seçeneği de vardır.
      2. İşlenen görüntüleri kullan = yeni bir görüntü kümesiyle çalışırken yanlış olarak ayarlayın. Aksi takdirde, sonraki işleme adımlarında kullanmak üzere çıkış dizininde önceden kaydedilmiş görüntü veri kümelerini (ör. "hizalanmış", "dikişli") belirtin.
        NOT: Bu seçenek, giriş görüntülerinin önceden işlenmiş olması durumunda sağlanır. Bu durumda, önceden işlenmiş görüntüler giriş görüntüleri olarak kullanılır ve seçenek çıkış dizinindeki alt dizinin adına ayarlanır.
      3. Save images = true olarak ayarlayın.
        NOT: Bu seçeneğin kullanılması, işlenen görüntülerin çıktı dizinine kaydedilmesini sağlar; aksi takdirde, yalnızca parametreler hesaplanır ve kaydedilir.
      4. Kayıt örneklerini = true olarak ayarlayın.
        NOT: Bu seçenek, her ana adım için örnek sonuçların kaydedilmesini sağlar.
      5. BaSiC algoritması27'yi kullanarak gölgelendirme düzeltmesi uygulamak için ayar karo gölgelendirmesi = temel veya belirli ışık sayfası genişliklerinde ışık tabakası mikroskobundan ölçümler kullanarak karo gölgelendirme düzeltmesi uygulamak için manuel olarak ayarlayın.
        NOT: Bu seçenek, tabaka belinin şeklinden kaynaklanan y boyutu boyunca eşit olmayan aydınlatmayı düzeltir.
    2. Görüntü kanalı hizalaması
      1. NMp_template'de, kanal hizalamasını = true olarak ayarlayın. Kanal hizalaması gerekiyorsa bu seçeneği true olarak ayarlayın. Değilse, false olarak ayarlayın. Kanal hizalama yöntemini çeviri (sert) veya elastix (katı olmayan) olarak ayarlayın.
        NOT: Çeviri yöntemi, birden fazla kanalı hizalamada katı 2B kayıt yaklaşımlarını kullanırken, elastix yöntemi, uzun görüntü yakalama19 sırasında oluşabilecek dönme sürüklenmesini düzeltmek için katı olmayan B-spline28'i kullanır.
    3. Yinelemeli görüntü dikişi
      1. NMp_template, dikiş görüntüleri = true olarak ayarlayın.
        NOT: Dikiş gerekiyorsa bu seçeneği true olarak ayarlayın.
      2. Eleme iyileştirmesini ayarla = true.
        NOT: Bu seçenek, Ölçek Değişmez Özellik Dönüşümü29 kullanılarak xy cinsinden çeviriyi daha da hassaslaştırmak için kullanılır.
      3. Yük hizalama parametrelerini ayarlayın = true.
        NOT: Bu seçenek, dikiş sırasında kanal hizalama çevirilerini kullanır. Bu seçenek çok kanallı görüntüleme için önerilir. Aksi takdirde, false olarak ayarlayın.
      4. Görüntüleme sırasında döşeme çakışmalarını eşleştirmek için örtüşme = 0,15 değerini ayarlayın.
    4. Bu ön işleme adımlarından herhangi birini çalıştırmak için, Matlab'da NMp_template ortamının dışında aşağıdakileri çalıştırın:
      1. Örnek adı belirtin. Set config = NM_config(process,sample).
      2. NM_process(config,stage) belirterek ön işleme adımlarından herhangi birini çalıştırın ve herhangi bir işlem için yoğunluk, hizalama veya dikiş kullanarak aşamayı belirtin. Aşamaların her biri için çıktı dosyaları için çıktı dizinini kontrol edin (Şekil 3 ve Şekil 4).
  4. Görüntü analizi
    1. NuMorph'tan önce
      1. Bir 3B atlas görüntüsü ve her vokseli belirli bir yapıya atayan ilişkili bir ek açıklama görüntüsüyle başlayın.
        NOT: Burada MagellanMapper30'dan üretilen P4 Allen Gelişimsel Fare Beyin Atlası kullanılmıştır.
      2. Atlas görüntüsünü ve ek açıklama dosyasını doğru yönde doğru şekilde eşleştiklerinden emin olmak için hizalayın.
    2. NuMorph içinde
      NOT: Artık atlas ve ek açıklamaları doğru hizalandığına göre, dosyaların daha sonra kullanılmak üzere kaydedilebilmeleri için NuMorph içinde "munged" edilmesi veya işlenmesi gerekir. Bunu yapmak için, girişleri aşağıda gösterildiği gibi belirtmek üzere munge_atlas işlevini kullanın.
      1. Atlas_file belirtin: (dize). Atlas dosyasının tam yolunu sağlayın.
      2. Annotation_file belirtin: (dize). İlişkili ek açıklamaların tam yolunu sağlayın.
      3. Çözünürlüğü Belirtin: (1x3 sayısal). Atlas y,x,z çözünürlüğünü piksel başına mikron olarak belirtin.
      4. Yönlendirmeyi Belirtin: (1 x 3 karakter). Atlas oryantasyonunu sağlayın ve beşikteki numunenin kurulumuyla eşleştiğinden emin olun (anterior(a)/posterior(p),superior(s)/inferior(i),left(l)/right(r)).
      5. Yarımküreyi Belirtin: Hangi beyin yarımküresinin görüntülendiğini belirtin ("sol", "sağ", "her ikisi", "hiçbiri").
      6. out_resolution:(int) belirtin. Atlas çıktısının izotropik çözünürlüğünü mikron cinsinden belirtin. (varsayılan: 25).
      7. /data/munge_atlas içinde munged ek açıklamalar ve /data/atlas içinde atlas görüntüsünün bir kopyasını oluşturmak için "atlas_file(annotation_file, annotation_data, resolution, orientation, heisphere)" komutunu çalıştırın.
      8. Her iki dosyanın da doğru yönde doğru şekilde munged olduğunu doğrulamak için Matlab yapısını ve atlas dosyasını okuyun.
        NOT: İmmün etiketli protein belirteçlerinin birlikte lokalizasyonuna dayalı olarak hücre tiplerini ölçmek için ek bir hücre sınıflandırma adımı gerçekleştirilebilir.
    3. Resampling
      1. NMa_template, atlasa başvurmak veya yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin alt örneklenmiş birimlerini oluşturmak için görüntü kaydı gerçekleştiriyorsanız, görüntüleri yeniden örnekleme = true olarak ayarlayın.
        NOT: NMa_template.m, yeniden örnekleme, kayıt, çekirdek algılama ve hücre sayımı parametrelerini ayarlamak için kullanılacaktır.
      2. Yeniden örnekleme çözünürlüğünü atlasla eşleşecek şekilde ayarlayın.
        NOT: Burada, referans atlası bu çözünürlükte olduğu için 25 μm3/voksel izotropik çözünürlük kullanılır.
      3. Yeniden örnekleme kanalları kullanılarak yeniden örneklenecek kanal numarasını belirtin = [ ].
        NOT: Burada, kanal numarası nükleer kanalla eşleşecek şekilde ayarlanmıştır. Bu seçenek boşsa, yalnızca kayıt kanalı yeniden örneklenir.
    4. Kayıt
      1. NMa_template, register images = true değerini ayarlayın. Kayıt gerekiyorsa true olarak ayarlayın. Değilse, kayıt = false değerini ayarlayın.
      2. Atlas dizinindeki dosyayla eşleşmesi için atlas dosyasını belirtin.
      3. Kayıt parametrelerini ayarla = varsayılan.
        NOT: Bu seçenek, uzamsal yazışmaları tahmin etmek için bir afin ve ardından B spline dönüşümü kullanır. Aksi takdirde, /data/elastix_parameter_files/atlas_registration içinde Elastix aracılığıyla yeni bir kayıt parametreleri kümesi tanımlayın.
      4. Kayıtlı resimleri kaydet = true olarak ayarlayın.
        NOT: Kayıt ve yeniden örneklemeden elde edilen çıktı dosyaları Matlab'da veya FIJI31 gibi diğer görselleştirme araçlarında indirilebilir ve görsel olarak incelenebilir.
    5. Çekirdek Tespiti, Hücre Sayımı ve Sınıflandırması
      NOT: Burada oluşan hatalar, ek açıklamalar dosyasının doğru belirtilmemesinden veya örneğin yaşının doğru ek açıklamayla eşleşmemesinden kaynaklanabilir.
      1. NMa_template'de, hem çekirdeği sayın hem de hücreleri sınıflandırın = true değerini ayarlayın.
      2. Set sayısı yöntemi = 3dunet.
        NOT: Bu seçenek, eğitilmiş 3D-Unet model19'un kullanılmasına izin verir. Aksi takdirde, Hessian blob algılama yöntemini kullanan Hessian'ı seçin.
      3. Algılanan nesneler için minimum yoğunluk eşiği tanımlamak üzere min_intensity ayarlayın.
        NOT: Uygun bir eşik, nükleer etiketlemenin sinyal-gürültü oranına göre ampirik olarak belirlenir.
      4. classify_method, merkezcil konumlardaki denetimsiz floresan yoğunluklarını temel alan eşik veya denetimli doğrusal Destek Vektör Makinesi (SVM) sınıflandırıcısını modelleyen svm olarak ayarlayın.
        NOT: Bu adım, algılanan tüm hücreleri 3 kanallı görüntüleme ile dört ana sınıfa ayırır. Bu protokolle, Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2- ve Aykırı Değerler oluşturulur.
    6. Analiz adımları
      1. Örnek adı belirtin. Set config =NM_config(analiz,örnek).
      2. NM_analyze(config,stage) belirterek analiz adımlarından herhangi birini çalıştırın ve yeniden örnekleme, kaydetme, sayma veya sınıflandırma özelliklerini kullanarak aşamayı belirtin. Aşamaların her biri için çıktı dosyaları için çıktı dizinini kontrol edin (Şekil 5).
    7. Hücre tipi sınıflandırması ve grup analizi
      1. NMe_template, update = true değerini ayarlayın ve hesaplanan önceki tüm istatistiklerin üzerine yazın.
        NOT: NMe_template, analiz edilen aynı beynin beyin bölgeleri arasında hücre tipi grup analizi yapma seçeneği sunar.
      2. compare_structures_by, tüm benzersiz ek açıklamalarla karşılaştırmak üzere dizine veya yapıları tabloya göre karşılaştırmak için tabloya ayarlayın.
      3. Tüm olası yapı dizinlerini belirten ve /annotations içinde bulunması gereken template_file ayarlayın.
      4. structure_table ayarlayın ve değerlendirilecek yapıları belirtin.
      5. Hücre sayımını ve hücre türü sınıflandırmasını NMa_template'de açıklandığı gibi belirtin.
      6. Karşılaştırılacak grupları belirtmek için compare_groups ayarlayın.
      7. Eşleştirilmiş t-testi veya iki örneklemli t-testi gerçekleştirmek için doğru veya yanlış olarak eşleştirilmiş.
    8. Analizi çalıştırın.
      Not: Bu adımı gerçekleştirmek için, Matlab'da NMe_template.m ortamının dışında aşağıdakileri çalıştırın.
      1. Örnek adı belirtin. Set config =NM_config(evaluate,sample).
      2. NM_evaluate(config,stage) belirterek analiz adımını çalıştırın ve aşamayı belirtin. Grup analizi için çıktı dosyalarının çıktı dizinini kontrol edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

iDISCO+ protokolü, gözle kolayca fark edilebilen önemli doku büzülmesini beraberinde getirdiğinden (Şekil 2B), doku temizlemenin neden olduğu büzülmeyi ölçmek için doku temizlemeden önce bu boru hattına bir MRI adımı ekledik. İş akışı, beyin dışı dokunun MR görüntüsünden çıkarılmasıyla başlar (Şekil 2C). Daha sonra, MR görüntüsünü ışık tabakası görüntüsüne hizalamak için katı bir dönüşüm (3 çeviri ve 3 dönüş açısı) uygulanır (Şekil 2D

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Doku temizleme yöntemleri, beynin 3D hücresel organizasyonunu ölçmek için yararlı tekniklerdir. Literatürde tanımlanan ve her biri avantajları ve sınırlamaları olan bir dizi doku temizleme yöntemi vardır 6,7,8,9. Doku temizlenmiş görüntülerdeki hücre tiplerini analiz etmek için hesaplama araçlarının seçenekleri nispeten sınırlıdır. Segmentasyonun daha az zor olduğu seyrek hücre popülasyonları i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH (R01MH121433, R01MH118349 ve R01MH120125 JLS'ye ve R01NS110791'den GW'ye) ve Umut Vakfı tarafından desteklenmiştir. Mikroskopi Hizmetleri Laboratuvarı'ndan Pablo Ariel'e örnek görüntülemeye yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Anabilim Dalı'ndaki Mikroskopi Hizmetleri Laboratuvarı, kısmen Kuzey Carolina Üniversitesi (UNC) Lineberger Kapsamlı Kanser Merkezi'ne Kanser Merkezi Çekirdek Destek Hibe P30 CA016086 tarafından desteklenmektedir. Nörobilim Mikroskopi Çekirdeği, hibe P30 NS045892 tarafından desteklenmektedir. Bu yayında bildirilen araştırmalar kısmen Kuzey Carolina Biyoteknoloji Merkezi Kurumsal Destek Hibe 2016-IDG-1016 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bruker 9.4T / 30 cm MRI TarayıcıBruker BiospecYatay Delikli Hayvan MRI Sistemi
Dibenzil eterSigma-Aldrich108014-1KG
Diklorometan (DCM)Sigma-Aldrich270997-1L
Dimetil sülfoksit (DMSO)Fisher-ScientificICN19605590
Eşek serumuSigma-AldrichS30-100ML
EVO 860 4 TB harici SSD
Fomblin YÖzel Sıvılar ŞirketiYL-VAC-25-6perfloropolieter yağlayıcı
gadolinyum kontrast madde (ProHance)Bracco DiagnosticsA9576
gadolinyum kontrast madde (ProHance)Bracco Diagnostics0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPUEVGA08G-P4-6286-KR
GlisinSigma-AldrichG7126-500G
Heparin sodyum tuzuSigma-AldrichH3393-10KUH2O'dan 10 mg/mL'ye kadar çözülmüş
Hidrojen peroksit çözeltisi, %30Sigma-AldrichH1009-100ML
ImSpector ProLaVision BioTecMikroskop görüntü elde etme yazılımı
ITK Snapsegmentasyon yazılımı
MethanolFisher-ScientificA412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA AmaçOlympus
Paraformaldehit, toz, %95 (PFA)Sigma-Aldrich30525-89-41x PBS'de Çözülmüş ila %4
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su 10x (PBS)Corning46-013-CMH2O
Sodyum AzidSigma-AldrichS2002-100GH2O ila %10
Sodyum deoksikolatSigma-AldrichD6750-10G
Tergitol tipi NP-40Sigma-AldrichNP40S-100ML
TritonX-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Fisher-ScientificBP337 500
Ultramikroskop II Işık Levha MikroskobuLaVision BioTec
Xeon İşlemci E5-2690 v4IntelE5-2690
Zyla sCMOS KameraAndorTamamlayıcı metal oksit yarı iletken kamera
< güçlü > Antikor< güçlü >< güçlü > Çalışma konsantrasyonu < / güçlü>
Alexa Fluor Goat 790 Anti-TavşanThermofisher ScientificA11369(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-SıçanThermofisher ScientificA11077(1:200)
Sıçan anti-Ctip2Abcamab18465(1:400)
Tavşan anti-Brn2Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi12137(1:100)
To-Pro 3 (TP3)Thermofisher ScientificT3605(1:400)
, içinde Çözünmüş

Kaynaklar

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84(2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002(2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802(2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. iDISCO method. , Available from: https://idisco.info/ (2022).
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).
  26. Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022).
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836(2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2(2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104(2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. ITK-SNAP home. , Available from: http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php (2022).
  34. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  35. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  36. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  37. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587(2014).
  38. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  39. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  40. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260(2021).
  41. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T m Beyin G r nt lemeTek H cre AnaliziNeonatal Fare BeyniMRI Beyin G r nt lemeekirdek Niceliklemesi3D Beyin AtlasH cre Tipi S n fland rmasG r nt Birle tirme

İlgili makaleler