Bu protokol, insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin küçük hücre dışı veziküllerinin (hUC-MSC-sEV'ler) basit bir laboratuvar ölçeğinde tezgah üstü ayar ile nasıl izole edileceğini göstermektedir. İzole hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, sEVs belirteçleri ve morfolojisi, sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Küçük Hücre Dışı Vezikülleri İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden İzole Etmek için Basit Bir Tezgah Üstü Filtrasyon Yöntemi
Bu makalede
Özet
Özet
Ultra santrifüjleme bazlı işlem, küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler) izolasyonu için yaygın bir yöntem olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu izolasyon yönteminden elde edilen verim nispeten daha düşüktür ve bu yöntemler sEV alt tiplerini ayırmada verimsizdir. Bu çalışma, hUC-MSC'lerin şartlandırılmış ortamından ultrafiltrasyon ile başarıyla ayrılan insan göbek kordonu kaynaklı MSC küçük hücre dışı vezikülleri (hUC-MSC-sEV'ler) izole etmek için basit bir tezgah üstü filtrasyon yöntemini göstermektedir. İzole edilmiş hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, ekzozomal belirteçleri (CD9, CD81, TSG101) ve morfolojisi sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edildi. İzole edilmiş hUC-MSC-sEV'lerin boyutu, 7.75 × 10 10 parçacık / mL'lik bir parçacık konsantrasyonu ve 80 μg / mL'lik bir protein konsantrasyonu ile 30-200 nm idi. Ekzozomal belirteçler CD9, CD81 ve TSG101 için pozitif bantlar gözlendi. Bu çalışma, hUC-MSC-sEV'lerin hUC-MSC'lerin şartlandırılmış ortamından başarıyla izole edildiğini ve karakterizasyonun, izole edilen ürünün Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi 2018 (MISEV 2018) tarafından belirtilen kriterleri karşıladığını göstermiştir.
Giriş
MISEV 2018'e göre, sEV'ler, fonksiyonel çekirdeği olmayan, 30-200 nm1 büyüklüğünde, replikasyon yapmayan lipit çift katmanlı parçacıklardır. MSC türevi sEV'ler, mikroRNA, sitokinler veya proteinler gibi doku rejenerasyonunda önemli rol oynayan önemli sinyal molekülleri içerir. Rejeneratif tıpta ve hücresiz tedavide giderek daha fazla araştırma "sıcak noktası" haline geldiler. Birçok çalışma, MSC kaynaklı sEV'lerin, immünomodülasyon 2,3,4,5, osteogenezi arttırma 6, diabetes mellitus7,8 veya vasküler reje....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. İnsan göbek kordonu mezenkimal kök hücreler ve kültür
- DMEM'de 5 × 103/cm2'lik bir tohumlama yoğunluğunda hUC-MSC'leri kültürleyin,% 8 İnsan Trombosit Lizatı ve% 1 Pen-Strep ile desteklenmiştir. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2'de inkübe edin. Uygun hücre büyümesini sağlamak için hücre kültürü ortamını her 3 günde bir değiştirin.
- sEV izolasyonu için hücreleri T175 şişelerinde 5. pasaja genişletin.
NOT: Yüksek miktarda sEV toplamak için b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 2 , hUC-MSC-sEV'lerin 53 nm'de bir parçacık boyutu moduna sahip olduğunu, partikül boyutunun diğer önemli zirvelerinin ise 96 ve 115 nm olduğunu göstermektedir. NTA tarafından ölçülen hUC-MSC-sEV'lerin konsantrasyonu 7.75 ×10 10 parçacık / mL idi. BCA testi ile ölçülen hUC-MSC-sEV'lerin protein konsantrasyonu yaklaşık 80 μg / mL idi.
Batı lekeleme analizinde, hUC-MSC-sEV'ler CD9, CD81 ve TSG101 eksozomal belirteçleri için pozitif bantlar gösterdi,.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
EV'ler, normal ve patolojik süreçler sırasında çok önemli bir rol oynayan MSC'lerdeki sekretomun önemli alt kümelerinden biridir. Bununla birlikte, 30 ila 200 nm arasında bir boyut aralığına sahip olan sEV'ler, son on yılda hücresiz tedavi için potansiyel bir araç olarak artmıştır. sEV'leri MSC'lerden izole etmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, diferansiyel ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon, polimer bazlı çökeltme, immünoaffinite yakalama ve mikroakışkan bazlı çökeltme farklı avantaj ve dezav.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu videonun yayınlanması My CytoHealth Sdn. Bhd tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %40 akrilamid | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| %95 etanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Dezenfektanlar |
| Mutlak Metanol | Chemiz | 45081 | PVDF membranını (Western blot) aktive etmek içinAccutase |
| STEMCELL Technologies | 7920 | Hücre ayrışma enzimi | |
| amonyum persülfat | Chemiz | 14475 | jel polimerizasyonunu katalize eder (Jel elektroforezi |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-166029 | sEVs marker anti-TSG için antikor |
| 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | sEVs marker için antikor |
| Sığır serum albümini | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membran bloke |
| edici bromofenol mavisi | Nacalai Tesque | 05808-61 | elektroforetik renk işaretleyici |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEV izolasyonu |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | kemilüminesans algılama reaktifi |
| CryoStor Donma Ortamı | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Hücre kriyoprezervasyonu |
| Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Hücre kültürü ortamı |
| ExcelBand Geliştirilmiş 3 renkli Yüksek Aralıklı Protein İşaretleyici | SMOBIO | PM2610 | Protein moleküler ağırlık belirteçleri |
| Ekstra kalın kurutma kağıdı | ATTO | tampon rezervi (Western blot) | |
| Gliserol | Merck | G5516 | Western blot |
| Glisin | 1. Baz | için kimyasallarBIO-2085-500g | Tampon (Western Blot) yaban |
| turpu peroksidaz konjuge fare IgG kappa bağlayıcı protein (m-IgG & kappa; BP-HRP) | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-516102 | İkincil antikor (Western Blot) |
| Human Wharton' Jöle türevli Mezenkimal Kök Hücreler (MSC'ler) | Doku Mühendisliği ve Rejeneratif Tıp Merkezi, Tıp Fakültesi, Malezya Ulusal Üniversitesi | ||
| fare antikorları anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-13118 | sEVs marker |
| Nanosight NS300 için antikor, bir CMOS kamera, 20 & kez; objektif lens, bir mavi lazer modülü (488 & thinsp; nm) ve NTA yazılımı v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformalaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | TEM penisilin sırasında Numune Fiksasyonu |
| – streptomisin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Medya |
| fenilmetilsülfonil florür | Nacalai Tesque | 27327-81 | eklendikten sonra sEV numunelerindeki proteazları inhibe |
| 10010023 | Yıkama, numune seyreltme | ||
| poliviniliden florür (PVDF) membran 0,45 mm gözenek boyutu | ATTO | Protein transferi sırasında proteini tutmak için (Western blot) | |
| proteaz inhibitörü kokteyli | Nacalai Tesque | 25955-11 | Lizis tamponu eklendikten sonra sEV numunelerindeki proteazları inhibe |
| Protein Testi Bikinkoninat Kiti | Nacalai Tesque | 06385-00 | 2-ME ile protein ölçüm |
| numunesi tampon çözeltisi | Nacalai Tesque | 30566-22 | Western blot sodyum için indirgeyici ajan |
| klorür | Nacalai Tesque | 15266-64 | Western blot |
| sodyum dodesil sülfat | Nacalai Tesque | 31606-62 | jel elektroforezi sırasında iyonik yüzey aktif madde |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmisyon elektron mikroskobu | FEI, ABD | ||
| tetrametiletilendiamin | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| tris-baz | 1. Baz | BIO-1400-500g | Tampon için Kimyasallar (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) için kimyasallar CCD görüntüleyici | Western blot sinyal tespiti için CCD görüntüleyici |
Kaynaklar
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
- Jayabalan, N., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
