Yöntem makalesi

Küçük Hücre Dışı Vezikülleri İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden İzole Etmek için Basit Bir Tezgah Üstü Filtrasyon Yöntemi

DOI:

10.3791/64106

⸱

23 Haziran 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia Medical Centre, 2My CytoHealth Sdn. Bhd., 3School of Biosciences, Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University, 4School of Pharmacy, Monash University Malaysia, 5Haematology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical Research (IMR), National Institutes of Health (NIH), Ministry of Health Malaysia, 6School of Pharmacy, Faculty of Health & Medical Sciences, Taylor's University, 7Centre for Drug Discovery and Molecular Pharmacology (CDDMP), Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin küçük hücre dışı veziküllerinin (hUC-MSC-sEV'ler) basit bir laboratuvar ölçeğinde tezgah üstü ayar ile nasıl izole edileceğini göstermektedir. İzole hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, sEVs belirteçleri ve morfolojisi, sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ultra santrifüjleme bazlı işlem, küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler) izolasyonu için yaygın bir yöntem olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu izolasyon yönteminden elde edilen verim nispeten daha düşüktür ve bu yöntemler sEV alt tiplerini ayırmada verimsizdir. Bu çalışma, hUC-MSC'lerin şartlandırılmış ortamından ultrafiltrasyon ile başarıyla ayrılan insan göbek kordonu kaynaklı MSC küçük hücre dışı vezikülleri (hUC-MSC-sEV'ler) izole etmek için basit bir tezgah üstü filtrasyon yöntemini göstermektedir. İzole edilmiş hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, ekzozomal belirteçleri (CD9, CD81, TSG101) ve morfolojisi sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edildi. İzole edilmiş hUC-MSC-sEV'lerin boyutu, 7.75 × 10 10 parçacık / mL'lik bir parçacık konsantrasyonu ve 80 μg / mL'lik bir protein konsantrasyonu ile 30-200 nm idi. Ekzozomal belirteçler CD9, CD81 ve TSG101 için pozitif bantlar gözlendi. Bu çalışma, hUC-MSC-sEV'lerin hUC-MSC'lerin şartlandırılmış ortamından başarıyla izole edildiğini ve karakterizasyonun, izole edilen ürünün Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi 2018 (MISEV 2018) tarafından belirtilen kriterleri karşıladığını göstermiştir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MISEV 2018'e göre, sEV'ler, fonksiyonel çekirdeği olmayan, 30-200 nm1 büyüklüğünde, replikasyon yapmayan lipit çift katmanlı parçacıklardır. MSC türevi sEV'ler, mikroRNA, sitokinler veya proteinler gibi doku rejenerasyonunda önemli rol oynayan önemli sinyal molekülleri içerir. Rejeneratif tıpta ve hücresiz tedavide giderek daha fazla araştırma "sıcak noktası" haline geldiler. Birçok çalışma, MSC kaynaklı sEV'lerin, immünomodülasyon 2,3,4,5, osteogenezi arttırma 6, diabetes mellitus7,8 veya vasküler rejenerasyon 9,10 gibi farklı durumların tedavisinde MSC'ler kadar etkili olduğunu göstermiştir. Erken faz denemeleri ilerledikçe, MSC'ler-EV'lerin klinik çevirisi ile ilgili üç ana anahtar konu vurgulanmıştır: EV'lerin verimi, EV'lerin saflığı (hücre kalıntılarından ve protein ve sitokinler gibi diğer biyolojik kirleticilerden arındırılmış) ve izolasyondan sonra EV'lerin fosfolipid çift katmanlı zarının bütünlüğü.

sEV'leri izole etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, sEV'lerin11'in yoğunluğundan, şeklinden, boyutundan ve yüzey proteininden yararlanılmıştır. EV izolasyonlarında en yaygın iki yöntem ultrasantrifüjleme tabanlı ve ultrafiltrasyon bazlı tekniklerdir.

Ultra santrifüjleme bazlı yöntemler, sEV'lerin izolasyonunda altın standart yöntemler olarak kabul edilir. Genellikle kullanılan iki tip ultrasantrifüjleme tekniği, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemedir. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme yöntemleri genellikle düşük verimle sonuçlanır ve yüksek hızlı ultra santrifüj (100.000-200.000 × g) için pahalı ekipman gerektirir11. Ayrıca, ultrasantrifüjleme teknikleri tek başına EV alt tiplerinin (sEV'ler ve büyük EV'ler) ayrılmasında verimsizdir ve saf olmayan bir tortu tabakası11 ile sonuçlanır. Son olarak, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme de zaman alıcı olabilir ve hızlanma ve yavaşlama adımları12 sırasında gradyan hasarını önlemek için sakkaroz tampon ilavesi gibi ek önlem adımları gerektirebilir. Bu nedenle, ultrasantrifüjleme genellikle nispeten düşük bir verime yol açar ve farklı EVs13 popülasyonları arasında ayrım yapamaz, bu da büyük ölçekli EV hazırlığı11 için uygulamasını sınırlar.

İkinci EV izolasyon yöntemi, boyut filtrasyonuna dayanan ultrafiltrasyon yoluyladır. Ultrafiltrasyon, pahalı ekipman veya uzun işleme süreleri içermediğinden ultrasantrifüjlemeye kıyasla nispeten zaman ve maliyet etkindir14. Bu nedenle, ultrafiltrasyon, yukarıda belirtilen her iki ultrasantrifüjleme yönteminden daha etkili bir izolasyon tekniği gibi görünmektedir. İzole edilen ürünler, gözenek boyutlarına ve daha yüksek verime bağlı olarak daha spesifik olabilir15. Bununla birlikte, filtreleme işlemi sırasında ortaya çıkan ek kuvvet, EV'lerin16'sının deformasyonuna veya patlamasına neden olabilir.

Mevcut makale, MSC'den türetilmiş sEV'leri aşağı akış analizi ve terapötik amaçlar için izole etmek için maliyet ve zaman açısından etkili bir tezgah üstü protokol önermiştir. Bu makalede açıklanan yöntem, partikül boyutu analizi, biyobelirteç testi ve elektron mikroskobik görüntüleme dahil olmak üzere aşağı akış analizi için yüksek verimli ve kaliteli EV'leri hUC-MSC'lerden izole etmek için basit bir filtreleme yöntemini tezgah üstü santrifüjleme ile birleştirdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. İnsan göbek kordonu mezenkimal kök hücreler ve kültür

  1. DMEM'de 5 × 103/cm2'lik bir tohumlama yoğunluğunda hUC-MSC'leri kültürleyin,% 8 İnsan Trombosit Lizatı ve% 1 Pen-Strep ile desteklenmiştir. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2'de inkübe edin. Uygun hücre büyümesini sağlamak için hücre kültürü ortamını her 3 günde bir değiştirin.
  2. sEV izolasyonu için hücreleri T175 şişelerinde 5. pasaja genişletin.
    NOT: Yüksek miktarda sEV toplamak için birçok şişeye ihtiyaç vardır (verim, hücre sayısıyla birlikte artar).

2. hUC'den küçük hücre dışı vezikül izolasyonu - MSC'ler

  1. Kültür ortamını, 5. pasajda kültür %70-%80 akıcılığa ulaştığında %1 Pen-Strep [Şartlandırılmış ortam (CM)] ile desteklenmiş taze fenol-kırmızı serbest DMEM ile değiştirin.
    DİKKAT: Yalnızca bazal medya kullanın; Harici sEV'lerin kontaminasyonunu önlemek için FBS ve insan trombosit lizat takviyesinden kaçının.
  2. 24 saat sonra, hücre kalıntılarını gidermek için CM'yi 200 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. 220 nm'den büyük parçacıkları çıkarmak için süpernatantı 0,22 μm'lik bir filtreden toplayın ve filtreleyin.
  3. Santrifüjlü filtre ünitesini, 0,2 μm'lik bir filtreden süzülmüş 30 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurun. Santrifüj filtre ünitesini 3.500 × g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
  4. Filtrelenmiş CM'yi santrifüj filtre ünitesine doldurun (her ünitenin maksimum hacmi 70 mL'dir). CM'yi 4 °C'de 3.500 × g'da santrifüjleyin.
    NOT: Santrifüjleme süresi, çözelti filtrenin yüzeyine ulaşana kadar zaman zaman izlenmelidir.
  5. Çözeltiyi filtrat çözelti kabına atın. Numune filtre kabını, konsantre toplama kabı ile 4 °C'de 4 °C'de 2 dakika boyunca ters santrifüjleyin.
  6. Konsantre CM'yi tekrar santrifüj filtre ünitesine aktarın. Santrifüj filtre ünitesine 30 mL filtrelenmiş PBS ekleyin ve üniteyi 4 °C'de 3.500 × g'da santrifüj edin.
  7. Çözeltiyi filtrat çözelti kabına atın. Filtre ünitesine bir konsantre toplama kabı takın ve saflaştırılmış sEV'leri elde etmek için 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.000 × g'da ters santrifüj yapın.
  8. sEV'leri 0,22 μm şırınga filtresinden geçirin.
  9. Numuneleri yeni tüplere aktarın ve daha fazla analiz için -80 ° C'de saklayın.

3. hUC-MSC-sEV'lerin karakterizasyonu

  1. Nanopartikül izleme analizi
    1. Filtrelenmiş PBS'deki izole edilmiş hUC-MSC-sEV'leri 20-100 parçacık/çerçeveye seyreltin.
    2. 1 mL tek kullanımlık şırıngalar kullanarak seyreltilmiş numunenin 1 mL'sini NTA odasına yerleştirin.
    3. Ölçüm ayarlarını buna göre ayarlayın: kamera seviyesini seviye 14'e ayarlayın, 10-100 kırmızı çarpı işaretinin sayılması kısıtlamasıyla mümkün olduğunca çok parçacık içerecek şekilde algılama eşiğini belirleyin ve mavi çarpı sayısı beş ile sınırlıdır.
    4. Her ölçüm için beş adet 1 dakikalık video kaydedin ve bunları beş algılama eşiğine sahip NanoSight Yazılımını kullanarak analiz edin.
    5. Her numune için üçlü olarak ölçümler yapın.
  2. Batı lekelenme analizi
    1. hUC-MSC-sEV'leri buz gibi soğuk radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu ile lize edin, 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın. Supernatan'ı topla.
    2. Bir Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kiti kullanarak proteini sayısallaştırın. Jel elektroforez setini buna göre monte edin ve protein istifleme jelinin sonuna ulaşana kadar 90 V'ta jel elektroforezi gerçekleştirin. Çözücü jelin sonuna kadar proteinleri ayırmak için voltajı 200 V olarak değiştirin.
    3. Proteinleri jelden 1 saat boyunca 15 V'ta bir poliviniliden diflorür (PVDF) membranına aktarmak için yarı kuru transfer gerçekleştirin.
    4. PVDF membranını oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 1 saat boyunca %3 sığır serum albümini (BSA)/Tris tamponlu salin-%0,1 v/v Tween 20 (TBS-T) ile bloke edin. PVDF membranını birincil antikorlarla aşağıdaki gibi inkübe edin: fare anti-CD 9 monoklonal antikoru (1:500), fare anti-CD 81 monoklonal antikoru (1:500), fare anti-CTP 94 monoklonal fare anti-TSG 101 monoklonal antikoru (1:500) gece boyunca sürekli sallanarak.
    5. Ertesi gün, PVDF zarını TBS-T ile 5 x 5 dakika yıkayın ve ikincil bir antikor ile daha fazla inkübe edin: yaban turpu peroksidaz konjuge fare IgG kappa bağlayıcı protein (m-IgGκ BP-HRP) (1:5,000) oda sıcaklığında ajitasyonla 1 saat boyunca.
    6. Yine, PVDF membranını TBS-T ile beş kez yıkayın ve membranı bir kemilüminesans algılama reaktifi kullanarak şarj bağlantılı (CCD) bir görüntüleyicide görselleştirin. ImageJ yazılımını kullanarak proteinlerin ekspresyon seviyesini analiz edin. İlk olarak, görüntü dosyasını ImageJ (Dosya | Açık...). Parlaklığı ve kontrastı ayarlayarak görüntünün kalitesini artırın (Resim | Ayarlama | Parlaklık/Kontrast). Lekeler açıkça görünene kadar görüntüyü ayarlayın, Uygula düğmesine tıklayın ve ardından görüntüleri TIFF biçiminde kaydedin (Dosya | Farklı Kaydet | TIFF...).
  3. İletim elektron mikroskobu
    1. hUC-MSC-sEVs numunesinin bir kısmını dört parça filtrelenmiş PBS ile toplam 10 μL hacme kadar seyreltin ve karbon kaplı bakır ızgarada 15 dakika boyunca inkübe edin.
    2. Fazla numuneyi bir laboratuvar mendili kullanarak çıkarın ve 3 dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin.
    3. Numuneyi 3 dakika boyamak için 10 μL% 1 fosfotungstik asit (PTA) çözeltisini inkübe edin.
    4. Fazla %1 PTA çözeltisini bir laboratuvar mendili kullanarak çıkarın ve 3 dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin.
    5. İletim elektron mikroskobu görüntülemesi için numuneyi kullanın.
      NOT: Özetlenen şematik deneme adımları için Şekil 1'e bakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2 , hUC-MSC-sEV'lerin 53 nm'de bir parçacık boyutu moduna sahip olduğunu, partikül boyutunun diğer önemli zirvelerinin ise 96 ve 115 nm olduğunu göstermektedir. NTA tarafından ölçülen hUC-MSC-sEV'lerin konsantrasyonu 7.75 ×10 10 parçacık / mL idi. BCA testi ile ölçülen hUC-MSC-sEV'lerin protein konsantrasyonu yaklaşık 80 μg / mL idi.

Batı lekeleme analizinde, hUC-MSC-sEV'ler CD9, CD81 ve TSG101 eksozomal belirteçleri için pozitif bantlar gösterdi,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV'ler, normal ve patolojik süreçler sırasında çok önemli bir rol oynayan MSC'lerdeki sekretomun önemli alt kümelerinden biridir. Bununla birlikte, 30 ila 200 nm arasında bir boyut aralığına sahip olan sEV'ler, son on yılda hücresiz tedavi için potansiyel bir araç olarak artmıştır. sEV'leri MSC'lerden izole etmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, diferansiyel ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon, polimer bazlı çökeltme, immünoaffinite yakalama ve mikroakışkan bazlı çökeltme farklı avantaj ve dezav...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu videonun yayınlanması My CytoHealth Sdn. Bhd tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%40 akrilamidNacalai Tesque06121-95Western blot
%95 etanolNacalai Tesque14710-25Dezenfektanlar
Mutlak MetanolChemiz45081PVDF membranını (Western blot) aktive etmek içinAccutase
STEMCELL Technologies7920Hücre ayrışma enzimi
amonyum persülfatChemiz14475jel polimerizasyonunu katalize eder (Jel elektroforezi
anti-CD 81 (B-11)Santa Cruz Biyoteknolojisc-166029sEVs marker anti-TSG için antikor
101 (C-2)Santa Cruz Biotechnologysc-7964sEVs marker için antikor
Sığır serum albüminiNacalai Tesque00653-31PVDF membran bloke
edici bromofenol mavisiNacalai Tesque05808-61elektroforetik renk işaretleyici
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)MilliporeUFC710008sEV izolasyonu
ChemiLumi One LNacalai Tesque7880kemilüminesans algılama reaktifi
CryoStor Donma OrtamıSigma-AldrichC3124-100MLHücre kriyoprezervasyonu
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s mediumNacalai Tesque08458-45Hücre kültürü ortamı
ExcelBand Geliştirilmiş 3 renkli Yüksek Aralıklı Protein İşaretleyiciSMOBIOPM2610Protein moleküler ağırlık belirteçleri
Ekstra kalın kurutma kağıdıATTOtampon rezervi (Western blot)
GliserolMerckG5516Western blot
Glisin1. Baziçin kimyasallarBIO-2085-500gTampon (Western Blot) yaban
turpu peroksidaz konjuge fare IgG kappa bağlayıcı protein (m-IgG & kappa; BP-HRP)Santa Cruz Biyoteknolojisc-516102İkincil antikor (Western Blot)
Human Wharton' Jöle türevli Mezenkimal Kök Hücreler (MSC'ler)Doku Mühendisliği ve Rejeneratif Tıp Merkezi, Tıp Fakültesi, Malezya Ulusal Üniversitesi
fare antikorları anti-CD 9 (C-4)Santa Cruz Biyoteknoloji  sc-13118sEVs marker
Nanosight NS300 için antikor, bir CMOS kamera, 20 & kez; objektif lens, bir mavi lazer modülü (488 & thinsp; nm) ve NTA yazılımı v3.2Malvern Panalytical, UK
paraformalaldehydeNacalai Tesque02890-45TEM penisilin sırasında Numune Fiksasyonu
– streptomisinNacalai Tesque26253-84Medya
fenilmetilsülfonil florürNacalai Tesque27327-81eklendikten sonra sEV numunelerindeki proteazları inhibe
10010023Yıkama, numune seyreltme
poliviniliden florür (PVDF) membran
0,45 mm gözenek boyutu		ATTOProtein transferi sırasında proteini tutmak için (Western blot)
proteaz inhibitörü kokteyliNacalai Tesque25955-11Lizis tamponu eklendikten sonra sEV numunelerindeki proteazları inhibe
Protein Testi Bikinkoninat KitiNacalai Tesque06385-002-ME ile protein ölçüm
numunesi tampon çözeltisiNacalai Tesque30566-22Western blot sodyum için indirgeyici ajan
klorürNacalai Tesque15266-64Western blot
sodyum dodesil sülfatNacalai Tesque31606-62jel elektroforezi sırasında iyonik yüzey aktif madde
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmisyon elektron mikroskobuFEI, ABD
tetrametiletilendiaminNacalai Tesque33401-72
tris-baz1. BazBIO-1400-500gTampon için Kimyasallar (Western Blot)
  Tween 20GeneTexGTX30962Western blot
UVP (Ultra Vision Product) için kimyasallar CCD görüntüleyiciWestern blot sinyal tespiti için CCD görüntüleyici
için antibiyotik Lizis tamponu fosfat tamponlu salin Gibco edin edin için kimyasallar jel hazırlamak için kimyasallar

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239(2017).
  3. Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
  4. Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
  5. Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
  6. Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
  7. Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741(2021).
  8. Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
  9. Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
  10. Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
  11. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  12. Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  13. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  14. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).
  15. Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  16. Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
  17. Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
  18. Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ultrafiltration MethodConditioned MediumNanoparticle TrackingBCA Protein AssayWestern BlotTransmission Electron MicroscopeExosomal Markers

İlgili makaleler