Yöntem makalesi

Enfeksiyöz ve Enfeksiyöz Olmayan Virüsleri Ayırt Etmek için Aptamerlerin İn Vitro Seçimi

1.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64127

⸱

7 Eylül 2022

 ,  ,  , 
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Genel olarak, bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilmiş virüslere veya diğer benzer virüslere değil, yalnızca bulaşıcı virüslere bağlanan belirli aptamerlere uygulanabilecek bir protokol sunuyoruz. Bu, taşınabilir ve hızlı testlerde bulaşıcılık durumunu belirleme olasılığını açar.

Özet

Virüs enfeksiyonlarının toplum üzerinde büyük bir etkisi vardır; Çoğu tespit yöntemi, tespit edilen bir virüsün bulaşıcı olup olmadığını belirlemede zorluk çeker, bu da tedavide gecikmelere ve virüsün daha da yayılmasına neden olur. Klinik veya çevresel numunelerin bulaşıcılığı hakkında bilgi verebilecek yeni sensörler geliştirmek, bu karşılanmamış zorluğun üstesinden gelecektir. Bununla birlikte, çok az yöntem, bozulmamış bir bulaşıcı virüsü tanıyabilen ve dezenfeksiyon yöntemleriyle bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüsten ayırt edebilen algılama molekülleri elde edebilir. Burada, üstel zenginleştirme (SELEX) ile ligandların sistematik evrimini kullanarak bulaşıcı virüsleri ve bulaşıcı olmayan virüsleri ayırt edebilen aptamerleri seçmek için bir protokol açıklıyoruz. SELEX'in iki özelliğinden yararlanıyoruz. İlk olarak, SELEX, sayaç seçimi kullanılarak bulaşıcı olmayan virüsler veya diğer benzer virüsler gibi rakip hedefleri kaldırmak için özel olarak hazırlanabilir. Ek olarak, tüm virüs, örneğin viral bir yüzey proteini yerine, SELEX'in hedefi olarak kullanılabilir. Bütün virüs SELEX, virüsün bozulmasına gerek kalmadan, özellikle virüsün doğal durumuna bağlanan aptamerlerin seçilmesine izin verir. Bu yöntem, patojenlerin yüzeyindeki fonksiyonel farklılıklara dayanarak önceden bilinmesi gerekmeyen tanıma ajanlarının elde edilmesini sağlar.

Giriş

Virüs enfeksiyonlarının, son COVID-19 pandemisinden itibaren giderek daha belirgin hale geldiği gibi, dünya çapında muazzam ekonomik ve toplumsal etkileri vardır. Zamanında ve doğru tanı, virüslerin sağlıklı insanlara yayılmasını önlerken viral enfeksiyonların tedavisinde çok önemlidir. PCR testleri 1,2 ve inmunoassay3 gibi birçok virüs tespit yöntemi geliştirilmiş olsa da, şu anda kullanılan yöntemlerin çoğu, tespit edilen virüsün gerçekten bulaşıcı olup olmadığını belirleyememektedir. Bunun nedeni, viral nükleik asit veya proteinler gibi tek başına virüsün bileşenlerinin varlığının, sağlam, bulaşıcı virüsün mevcut olduğunu göstermemesi ve bu biyobelirteçlerin seviyelerinin bulaşıcılıkile zayıf korelasyon göstermesidir 4,5,6. Örneğin, mevcut PCR tabanlı COVID-19 testleri için yaygın olarak kullanılan viral RNA, hasta bulaşıcı olduğunda enfeksiyonun erken evrelerinde çok düşük seviyelere sahipken, hastalar enfeksiyondan iyileştiğinde ve artık bulaşıcı olmadığında RNA seviyesi genellikle hala çok yüksektir 7,8. Viral protein veya antijen biyobelirteçleri benzer bir eğilimi takip eder, ancak tipik olarak viral RNA'dan daha sonra ortaya çıkar ve bu nedenle bulaşıcılığın daha az öngörücüsüdür 6,9. Bu sınırlamayı ele almak için, virüsün bulaşıcılık durumu hakkında bilgi verebilecek bazı yöntemler geliştirilmiştir, ancak sonuç elde etmek için uzun zaman (günler veya haftalar) gerektiren hücre kültürü mikrobiyoloji tekniklerine dayanmaktadır 4,10. Bu nedenle, klinik veya çevresel örneklerin bulaşıcılığı hakkında bilgi verebilecek yeni sensörler geliştirmek, tedavideki gecikmeleri ve virüsün daha fazla yayılmasını önleyebilir. Bununla birlikte, çok az yöntem, bozulmamış bir enfeksiyöz viryonu tanıyabilen ve onu bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüsten ayırt edebilen algılama molekülleri elde edebilir.

Bu bağlamda, aptamerler benzersiz bir biyomoleküler araç olarak özellikle uygundur11,12,13,14. Aptamerler, yüksek afinite ve seçiciliğe sahip bir hedefi tanımak için spesifik bir 3D konformasyon oluşturmalarını sağlayan spesifik bir nükleotid dizisine sahip kısa, tek sarmallı DNA veya RNA molekülleridir15,16. İn vitro seleksiyon olarak da bilinen üstel zenginleştirme (SELEX) ile ligandların sistematik evrimi adı verilen ve 10 14-1015 dizili 17,18,19 büyük bir rastgele DNA örnekleme kütüphanesine sahip test tüplerinde gerçekleştirilen kombinatoryal bir seçim süreci ile elde edilirler. Bu yinelemeli işlemin her turunda, DNA havuzu ilk önce istenen koşullar altında hedefle inkübasyon yoluyla bir seçim baskısına tabi tutulur. Hedefe bağlı olmayan tüm diziler daha sonra kaldırılır ve geride yalnızca verilen koşullar altında bağlanabilen birkaç dizi kalır. Son olarak, önceki adımda seçilen diziler PCR ile güçlendirilir, havuzun popülasyonu bir sonraki seçim turu için istenen fonksiyonel dizilerle zenginleştirilir ve işlem tekrarlanır. Seçim havuzunun aktivitesi bir platoya ulaştığında (tipik olarak 8-15 turdan sonra), kütüphane en yüksek afiniteyi sergileyen kazanan dizileri tanımlamak için DNA dizilimi ile analiz edilir.

SELEX, virüsün bulaşıcılık durumu 22 gibi diğer benzer hedeflere karşı daha fazla seçicilik kazanmak için kullanılabilecek benzersiz avantajlara sahiptir20,21. İlk olarak, seçim için küçük moleküllerden ve proteinlerden tüm patojenlere ve hücrelere kadar çok çeşitli farklı tipte hedefler kullanılabilir16. Böylece, bulaşıcı bir virüse bağlanan bir aptamer elde etmek için, viral bir yüzey proteini19 yerine, sağlam bir virüs hedef olarak kullanılabilir. Bütün virüs SELEX, virüsün bozulmasına gerek kalmadan, özellikle virüsün doğal durumuna bağlanan aptamerlerin seçilmesine izin verir. İkincisi, SELEX, diğer benzer virüsler veya bulaşıcı olmayan inaktive virüsler gibi rakip hedefleri 21,23'ü kaldırmak için özel olarak hazırlanabilirve her seçim 22 turunda karşı seçim adımları kullanılabilir. Karşı seçim adımları sırasında, DNA havuzu bağlanma istenmeyen hedeflere maruz bırakılır ve bağlanan diziler atılır.

Bu çalışmada, bulaşıcı bir virüse bağlanan, ancak belirli bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüse veya başka bir ilgili virüse bağlanmayan aptamerleri seçmek için genel olarak uygulanabilecek bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, önceden bilinmesi gerekmeyen virüs yüzeyinin fonksiyonel farklılıklarına dayanarak tanıma ajanlarının elde edilmesini sağlar ve böylece yeni ortaya çıkan patojenlerin tespiti veya az çalışılmış hastalıklar için ek bir avantaj sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Reaktiflerin ve tamponların hazırlanması

  1. 1 L'lik son hacme 0,9 M Tris-baz, 0,9 M borik asit, 20 mM EDTA (disodyum tuzu) ve deiyonize su ekleyerek 10x Tris-borat EDTA (10x TBE) hazırlayın.
  2. Aşağıdaki gibi% 10 denatüre edici bir poliakrilamid stok çözeltisi hazırlayın. 250 mL'lik bir cam şişede, 120 g üre (8 M), 25 mL 10x TBE, 62.5 mL% 40 akrilamid / bisakrilamid (29: 1) çözeltisi ve 250 mL'lik nihai hacme ulaşmak için yeterli damıtılmış su ekleyin. Tüm bileşenler çözülene kadar karıştırın.
  3. 2x yükleme tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın. 50 mL'lik bir tüpe 21.636 g üre (8 M), 1.675 g EDTA (1 mM) ve 4.5 mL 10x TBE ekleyin. Damıtılmış suyla 45 mL'ye kadar doldurun ve tüm bileşenler çözünene kadar karıştırın.
  4. 100 mM sodyum asetat ve 1 mM EDTA (disodyum tuzu) ekleyerek ekstraksiyon tamponunu hazırlayın. Son pH'ı 5 olarak ayarlayın.
  5. Etanol çökeltme çözeltilerini aşağıdaki gibi hazırlayın. 3 M sodyum asetat hazırlayın, pH 5.2'ye ayarlayın ve 4 °C'de saklayın. %70 etanol v/v hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. % 100 etanol hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.
  6. 1x PBS, 2,5 mM MgCl2 ve 0,5 mM CaCl2 içeren 500 mL SELEX tamponu hazırlayın. pH 7.4'e ayarlayın. 1x PBS, 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2 ve 8 M üre ekleyerek 8 M üre ile 100 mL SELEX tamponu hazırlayın. pH 7.4'e ayarlayın.
    NOT: SELEX tamponunun seçimi, seçilen aptamerin aptamerin uygulanacağı son numune üzerinde çalışacağından emin olmak için kritik öneme sahiptir. Örneğin, SARS-CoV-2'ye özgü aptamerler biyolojik örneklerde (örneğin, tükürük veya nazofaringes çubukları) kullanılacaktır. Bu nedenle, amaçlanan biyolojik numunelerde bu koşulları yakından taklit eden iyon konsantrasyonları, pH ve tamponun seçilmesi önemlidir.
  7. Bağlama ve yıkama tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın. 50 mL'lik bir tüpte, 5 mM Tris, 0,5 mM EDTA (disodyum tuzu) ve 2 M NaCl hazırlayın. pH 7.5'e ayarlayın.

2. DNA kütüphanesi ve primerlerinin tasarımı ve sentezi

  1. İlk ssDNA kütüphanesini ve primerleri aşağıdaki kriterlerle tasarlayın (örnek bir ssDNA kütüphanesi ve primer kümesi için Tablo 1'e bakınız, burada N rastgele bir nükleotid konumunu gösterir).
    1. Kütüphanenin, amplifikasyon için primer bölgeler olarak işlev gören 3' ve 5' uçlarındaki iki sabit diziyle çevrili 35 ila 60 nükleotitten oluşan merkezi bir rastgele bölge içerdiğinden emin olun. Tipik bir kütüphane uzunluğu 45 rastgele nükleotittir.
    2. Ters astarın, in vitro seçim işlemi sırasında streptavidin kaplı boncuklar kullanarak ssDNA'yı güçlendirilmiş çift sarmallı PCR ürünlerinden ayırmak için bir biyotin modifikasyonu içerdiğinden emin olun.
  2. DNA oligolarını standart tuzdan arındırma saflaştırma ile ticari kaynaklardan satın alın. ssDNA kütüphanesini ve primerleri% 10 denatüre edici poliakrilamid jel elektroforezi (dPAGE) ile saflaştırın, ardından standart prosedürlere göre etanol çökeltme izleyin24.
    DİKKAT: Akrilamid monomer ve ethidyum bromür tehlikeli kimyasallardır (insan kanserojenleri), bu nedenle PAGE'yi uygularken uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlükleri, eldivenler ve göz koruması) kullanın. Mümkün olduğunda, ethidyum bromür kullanmaktan kaçının ve daha güvenli bir boya ile değiştirin.
    NOT: Bu saflaştırma adımını gerçekleştirmekten kaçınmak için oligoları HPLC saflaştırma ile sipariş etmek mümkündür, ancak bu kısa oligonükleotidleri etkili bir şekilde ortadan kaldırmaz.
  3. Etanol çökeltmesinden sonra istenen konsantrasyona (100 μM) kadar ssDNA'yı yeniden askıya almak için nükleaz içermeyen su ekleyin. SsDNA kütüphanesinin ve primerlerin konsantrasyonunu λ = 260 nm'de UV absorpsiyonu ile belirleyin. -20 °C'de saklayın.
  4. Yüksek verimli sıralama, kitaplık hazırlama ve qPCR ölçümü için kullanmak üzere değiştirilmemiş bir ters astar satın alın.

3. Enfeksiyöz ve enfeksiyöz olmayan virüs örnekleri

DİKKAT: Enfeksiyöz ve enfeksiyöz olmayan virüs numuneleri, güvenli ve uygun şekilde işlemek için ekstra özen gerektiren biyogüvenlik seviye 2 (BSL2) numuneleridir. Bu numuneleri içeren prosedürün tüm adımları bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmeli veya virüs çözeltisi kapalı bir kapta (örneğin, kapaklı plastik tüpler) olmalıdır.

  1. Enfeksiyöz virüslerin stok çözeltisini elde edin veya her virüs için karşılık gelen protokolü izleyerek bunları hazırlayın. Burada kullanılan SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 ve H5N1 psödovirüsleri, PBS tamponunda Prof. Lijun Rong'un laboratuvarı (UIC) tarafından sağlanmış ve bildirilen protokoller22,25,26 uyarınca hazırlanmıştır.
    NOT: Bozulmamış bulaşıcı virüsü işlemek için biyogüvenlik seviye 3 tesisleri gerektiren virüsler için, psödovirüslerle çalışmak mümkündür. Psödotipli bir virüs, virüsün yüzey proteinlerini viral zarf içinde görüntüleyen ve böylece virüsün yüzeyini ve giriş mekanizmasını yakından taklit eden, ancak sürekli viral replikasyonda kusurlu olan bir lentivirüsten (HIV) üretilir.
  2. Enfeksiyöz olmayan bir virüs stok çözeltisi elde edin veya dezenfeksiyon prosedürünü izleyerek hazırlayın. Burada kullanılan UV-inaktive SARS-CoV-2 psödovirüs (p-SARS-CoV-2) stoğu, PBS tamponunda Prof. Rong laboratuvarı (UIC) tarafından sağlanmış ve daha önce bildirilen protokol UV-inaktivasyon22 için kullanılmıştır.
    NOT: Mümkünse, virüsün tamamen inaktive edildiğinden emin olmak için virüsün bulaşıcılığını test etmek için bir tahlil yapın.
  3. Virüs stoklarını ölçme
    1. Standart prosedürlere göre bir plak testi kullanarak virüsü ölçün27,28,29. Bu tahlil sadece virüsün nicelleştirilmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda bulaşıcı virüsün konsantrasyonunu doğrulayan virüsün bulaşıcılık durumunu da gösterir.
    2. Bir plak testinin mevcut olmadığı psödovirüsler veya virüsler için, ticari olarak temin edilebilen kantitatif bir lentivirüs ELISA kiti kullanarak virüsü sayısallaştırın.
    3. p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 ve p-H5N1 için 1 x 108 kopya/mL stok çözeltisi hazırlayın. Her stok çözeltisini, her biri 50 μL içeren alikotlarda ayırın ve -80 ° C'de tutun. Her deneyden önce yeni bir aliquot çözün.

4. In vitro seçim veya SELEX işlemi: ilk tur

NOT: Enfeksiyöz virüsü kullanan tüm adımlar için, bir BSL2 kabininde çalışın.

  1. SsDNA kütüphanesini denatüre edin. 100 μM ssDNA kütüphanesinden (1 nmol) 10 μL alın ve 240 μL SELEX tamponu ile karıştırın. Kuru bir banyoda 15 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın ve ardından tüpü 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
  2. SsDNA kütüphanesini aşağıdaki gibi bulaşıcı virüs (pozitif seleksiyon adımı) ile inkübe edin. Adım 4.1'den itibaren SELEX tamponunda 250 μL ssDNA kütüphanesini 50 μL bulaşıcı virüs (1 x 108 kopya/mL) ile karıştırın. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  3. Santrifüj filtrelerinde spesifik olmayan alanları aşağıdaki gibi engelleyin. Adım 4.2'yi beklerken, santrifüj filtrelerini sonraki adımlar için hazırlayın.
    1. Kullanılacak her 0,5 mL santrifüj filtresine 400 μL 1 mM T20 dizisi (Tablo 1) ekleyin - 100 kDa'lık bir kesime sahip bir santrifüj filtresi ve 10 kDa'lık bir kesme işlemine sahip bir santrifüj filtresi.
    2. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve filtredeki T20 çözeltisini çıkarmak için 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın. Fazla T20 dizilerini çıkarmak için SELEX tamponu ile 3 kat yıkayın.
  4. Bağlanmamış dizileri aşağıdaki gibi yıkayın. Adım 4.2'de inkübe edilen karışımı bloke edilmiş 100 kDa santrifüj filtresine ekleyin ve 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj. 400 μL SELEX tamponu ekleyerek ve 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yaparak 3 kat yıkayın. Kesiri filtrede tutun ve akışı atın.
  5. Bağlı dizileri aşağıda açıklandığı gibi elute edin.
    1. Santrifüj filtresinin toplama borusunu değiştirin ve adım 4.4'te santrifüj filtresine 8 M üre içeren 300 μL SELEX tamponu ekleyin. Santrifüj filtresini kuru bir banyoda 15 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın ve ardından 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın.
    2. Salınan dizileri içeren filtreden akan fraksiyonu toplayın. Üç kez daha tekrarlayın. Bir BSL2 kabininde çalışın ve malzemeleri atmadan önce virüsü etkisiz hale getirmek için tüm malzemeleri% 10 çamaşır suyu ile yıkayın.
  6. Aşağıdaki gibi konsantre edin ve tuzdan arındırın. 4.5'te toplanan çözeltiyi bloke edilmiş bir 10 kDa santrifüj filtresine ekleyin. 15 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj. Filtreden akan fraksiyonu atın.
    NOT: Bir önceki adımda virüsler filtrede 8 M üre ile tutulup etkisiz hale getirildiğinden, bu ve sonraki adımların biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmesine gerek yoktur. Adım 4.5'te olduğu gibi tüm çözelti toplanana kadar 0.5 mL'lik bir santrifüj tüpü kullanılıyorsa, bu prosedürün tekrarlanması gerekir, 1.2 mL filtreden akar.
  7. 15 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yaparak üreyi çıkarmak için 300 μL SELEX tamponu ile 3 kat yıkayın. Filtreden akan fraksiyonu atın. Filtredeki çözeltiyi temiz bir toplama tüpünde baş aşağı çevirerek ve 5 dakika boyunca santrifüj yaparak geri kazanın.
  8. Geri kazanılan çözeltinin son hacmini plastik bir tüpte pipet kullanarak 4,7'den ölçün. Bu çözüm, i'nin yuvarlak sayıya karşılık geldiği Ria olarak adlandırılır. Tipik olarak, 30 μL ila 50 μL arasında hacimler elde edilir. DNA miktarını qPCR ile ölçmek için salınımlı ssDNA'nın 1 μL'sini alın.
    NOT: Bu, R1a numunesinin başka bir zamanda devam etmek üzere -20 ° C'de tutulabileceği olası bir duraklama noktasıdır.
  9. Aşağıda açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.
    1. İlk turda, R1'in%90'ını PCR şablonu olarak örnek alın. Aşağıdaki turlarda, PCR gerçekleştirmek için adım 4.8'deki toplam hacmin% 60'ını alın ve diğer fraksiyonu -20 ° C'de saklayın.
    2. Belirtilen son konsantrasyona sahip aşağıdakilerle 50 μL'lik bir PCR reaksiyonu ayarlayın: 1x PCR reaksiyon tamponu, 200 μM dNTP'ler, 10 μL DNA şablonu (R 1 bir örnek),her bir astar 200 nM ve 1.25 U polimeraz (2.5 U / μL stok).
    3. Her bir primer seti ve ssDNA kütüphanesi için döngü sayısı ve tavlama sıcaklığı dahil olmak üzere PCR koşullarını optimize edin. Çok fazla döngü kullanmaktan kaçının, bu da bize primer-dimer gibi istenmeyen PCR alt ürünleri üretecektir. Astarların erime sıcaklığına bağlı olarak farklı tavlama sıcaklıklarını test edin.
    4. dsDNA havuzunu elde etmek için PCR'yi 95 °C'de 5 dakika boyunca optimize edilmiş koşulları kullanarak çalıştırın, ardından 95 ° C'de 1 dakika, 52 ° C'de 30 s ve 72 ° C'de 1 dakika boyunca 1 dakika boyunca 1 dakika boyunca 18 döngü yapın.
      NOT: Bu, PCR ürününün başka bir zamanda devam etmek için -20 ° C'de tutulabileceği başka bir olası duraklama noktasıdır.
  10. Streptavidin modifiye manyetik boncuklar kullanarak ssDNA'yı kurtarın.
    1. PCR ürününün% 80'ini alın. Kalan fraksiyonu -20 °C'de saklayın.
    2. PCR ürününü 50 μL'lik alikotlara bölün ve 50 μL streptavidin modifiye manyetik boncuk (MB) içeren mikrofüj tüplerine ekleyin. Oda sıcaklığında hafif ajitasyonla (örneğin, dönen bir çalkalayıcı kullanın) 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, MB'yi izole etmek ve süpernatantı pipetleme ile çıkarmak için mikrofüj tüpünü manyetik rafa yerleştirin (net bir çözüm olmalıdır).
    3. Tüpe 200 μL bağlama ve yıkama tamponu ekleyerek yıkayın. Tüpü manyetik raftan çıkarın, tüpe dokunun ve pipetleme yaparak MB'yi homojen bir çözeltiye yeniden askıya alın. MB'yi izole etmek ve süpernatantı pipetleme ile çıkarmak için mikrofüj tüpünü manyetik rafa geri yerleştirin. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
    4. Yıkama tamamlandıktan sonra, MB'yi toplam 100 μL SELEX tamponunda tekrar askıya alın ve çözeltiyi 10 dakika boyunca 95 ° C'ye ısıtın. Tüp soğumadan önce tüpü hemen manyetik rafa yerleştirin ve ssDNA havuzunu içeren süpernatantı alın. 50 μL SELEX tamponu ekleyerek bu kurtarma adımını tekrarlayın.
  11. Bir pipet kullanarak geri kazanılan fraksiyonun son hacmini 4,10'dan ölçün. Bu kesir, i'nin yuvarlak sayıya karşılık geldiği Rix olarak adlandırılır. Genel olarak, 140 ila 150 μL arasında hacimler elde edilir. DNA miktarını qPCR ile ölçmek için 1 μL R1x alın.

5. Sonraki seçim turları

  1. SsDNA havuzunu denatüre edin. R1x numunesinin %60'ını alın ve 50 μL SELEX tamponu ile karıştırın. Kuru bir banyoda 15 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın. Tüpü 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
  2. SsDNA havuzunu bulaşıcı olmayan virüs ve diğer potansiyel müdahale eden virüslerle inkübe edin (sayaç seçim adımı). Denatüre ssDNA havuzunu 5.1'den SELEX tamponunda her virüsün 50 μL'si ile karıştırın (5 x 109 kopya/mL; örneğin, bulaşıcı olmayan p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 ve p-H5N1). Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  3. Santrifüj filtrelerinde spesifik olmayan siteleri engelleyin. Adım 5.2.'yi beklerken, santrifüj filtrelerini sonraki adımlar için hazırlayın. Tipik olarak, biri 100 kDa, diğeri 10 kDa kesme özelliğine sahip iki santrifüj filtresi kullanın. 4.3'teki prosedürün aynısını uygulayın.
  4. Hedef olmayan virüslere bağlı dizileri yıkayın. Adım 5.2'de inkübe edilen karışımı bloke edilmiş bir 100 kDa santrifüj filtresine ekleyin. 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın ve santrifüj filtresinden akan fraksiyonu geri kazanın. 2 kez yıkayın, 100 μL SELEX tamponu ekleyin ve 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın. Filtreden akan kesiri saklayın.
  5. SsDNA havuzunu bulaşıcı virüs ile inkübe edin (pozitif seçim adımı). Adım 5.4'ten 300 μL fraksiyonu alın ve 50 μL bulaşıcı virüs (1 x 108 kopya / mL) ile karıştırın. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. 4.4 ile 4.11 arasındaki adımları izleyin.

6. SELEX sürecinin izlenmesi

NOT: Havuzun zenginleşmesini izlemek için, qPCR iki şekilde kullanılır. İlk olarak, mutlak niceleme ile, havuzların zenginleştirilmesini test etmek mümkündür (elüsyon verimi). İkincisi, erime eğrisi izlenerek, havuzların çeşitliliği (aptamer türlerinin yakınsaması)30 olarak değerlendirilebilir.

  1. qPCR için tasarlanmış 96 delikli plakalarda 10 μL reaksiyon hacmine sahip tüm qPCR analizlerini gerçekleştirin.
  2. 5 μL ana karışım, etiketlenmemiş her astarın 0,3 μL'si 500 nM, 3,4 μLH2O ve 1 μL DNA şablonu içeren standart bir qPCR karışımı hazırlayın.
    1. Standart eğriyi çalıştırmak için saflaştırılmış ssDNA kütüphanesinin seyreltilerini (adım 2.3) hazırlayın.
    2. Konsantrasyonlarını standart eğriye sığdırmak için DNA örneklerini seyreltin. Ri anumuneleri için, qPCR karışımına seyreltme olmadan numunenin 1 μL'sini ve 1:10 seyreltmenin 1 μL'sini ekleyin. Rix numuneleri için 1:10 veya 1:100 seyreltme ekleyin.
  3. Aşağıdaki protokolü ayarlayarak qPCR'yi çalıştırın. İlk olarak, 2 dakika boyunca 98 ° C'de bir başlangıç denatürasyon adımı ayarlayın. Ardından, 5 s için 98 ° C'de 40 denatürasyon döngüsü ve 10 s için 52 ° C'de tavlama ve uzatma ayarlayın. Son olarak, 65 ila 95 °C arasında bir erime eğrisi analizi ayarlayın. Otomatik eşik analizi ile eşik döngüsü (Ct) değerlerini belirleyin.
  4. Standart eğriyi kullanarak, R i a ve Rix örneklerindeki ssDNA miktarını ölçün.
  5. Elüsyon verimini, bağlı DNA miktarının (R i a'daki mol sayısı) başlangıç DNA miktarına (Ri-1x'teki mol sayısı) bölünmesiyle hesaplayın. Turlar üzerinde bir zenginleştirme gözlenip gözlenmediğini görmek için elüsyon verimini yuvarlak sayıya karşı grafiklendirin.
  6. Farklı turlar için erime eğrilerini çizin. Tur sayısı arttıkça 75/85 ° C yakınlarındaki zirvede daha yüksek erime sıcaklıklarına geçiş bekleniyor. Bu da havuzun çeşitliliğinin azalması anlamına gelir.

7. Yüksek verimli sıralama

  1. Kitaplık hazırlama yöntemini belirleyecek olan hangi sıralama türlerinin ve ölçeklerinin mevcut olduğu konusunda yüksek verimli sıralama tesisine danışın.
    NOT: Bu karar hem sıralanacak havuzların uzunluğunu (astarlar dahil) hem de gönderilecek havuz sayısını dikkate alacaktır (genellikle havuz başına en az 1 x 105-10 6 dizi hedefleyin). Belirli bir sıralama ölçeği havuzun tüm uzunluğunu okuyamıyorsa, yalnızca bir uçtan okuyan tek uçlu sıralamanın aksine, dizinin her iki ucundan da okumak için çift uçlu sıralama kullanılabilir.
  2. Sıralama tesisine danışarak, sıralama türüne bağlı olarak piyasada bulunan uygun bir kit seçin. Yüksek, orta ve düşük zenginleştirmeyi temsil eden birden fazla seçim turu havuzunun yanı sıra son havuzu, tek bir şerit kullanarak tüm turların örnek analizine izin veren her havuz için bağdaştırıcılarda farklı bir dizin çifti kullanarak hazırlayın.
    NOT: PCR amplifikasyonu, yüksek verimli sıralama için gereken adaptörleri ve indeksleri dahil etmek için de kullanılabilir, ancak bu genellikle ticari kitlere benzer maliyetlidir ve daha iyi performans göstermez.
    1. Aşağıdaki adımları izleyerek kütüphane hazırlığı gerçekleştirin: parçalanmış DNA'nın son onarımı, adaptör ligasyonu ve son kütüphaneleri üretmek için PCR amplifikasyonu.
    2. PCR ürününü, üreticinin talimatlarını izleyerek manyetik DNA temizleme boncukları ile saflaştırın.
    3. Floresan bazlı bir niceleme kiti kullanarak DNA'yı sayısallaştırın. Küçük hacimli UV ölçümleri gibi daha az doğru yöntemler kullanmaktan kaçının.
    4. Belirli indeksler içeren her havuz kütüphanesinin yaklaşık olarak eşit miktarlarını (hacim değil, DNA miktarına göre) karıştırın.
    5. qPCR nicelemesi ve bir DNA fragman analizörü ile son kütüphanenin kalitesini kontrol edin. Bu adım genellikle sıralama tesisi tarafından gerçekleştirilir.
      NOT: Sıralama tesisi personeli, kütüphanenin nasıl hazırlanacağı ve hangi kalite kontrollerinin önerildiği konusunda yararlı bilgiler sağlayabilir. Kütüphaneleri hazırlamadan önce onlarla görüşmek gerekir.
  3. Hazırlanan son kütüphaneyi gereksinimlerini takip ederek sıralama tesisine gönderin.

8. Sıralama analizi

  1. Sıralama analizi için kullanılabilen çoğu yazılım, Linux işletim sistemindeki komut satırında çalıştırılmak üzere tasarlanmıştır. Küçük veri kümeleri için, istediğiniz Linux işletim sistemini kurun ve gerekli programları kişisel bir bilgisayara yükleyin; daha büyük veri kümeleri için HTS analizi, yüksek performanslı bilgi işlem kaynaklarında veya süper bilgisayarlarda çalıştırılır (önerilir).
    NOT: Yüksek performanslı bilgi işlem kaynaklarını kullanmak için erişim ve eğitim gerekecektir ve bu kaynakların elde edilmesi biraz zaman alabilir. Ayrıca, UNIX komut satırı kullanımı hakkında temel bilgi gereklidir. Temel komut satırı kullanımıyla ilgili birçok ücretsiz kaynak çevrimiçi olarak mevcuttur ve bilgi işlem kaynakları büyük olasılıkla sistemlerini kullanmak için ek bilgiler sağlayacaktır.
  2. Sıralama olanağı tarafından sağlanan bilgileri kullanarak, genellikle sıkıştırılmış bir FastQ dosya biçimindeki sıralama dosyalarına erişin.
    1. Dosyaları kendi bilgisayarınıza ve/veya yüksek performanslı bilgi işlem kaynağına aktarmak için bir FTP istemcisi kullanın. Birçok dizi analizi programı sıkıştırılmış dosyaları doğrudan kullanabilir, bu nedenle dosya boyutlarını sınırlamak için mümkünse dosyaları sıkıştırılmış halde tutun (50 M+ dizilimin büyük dizi okumaları, sıkıştırılmadığında 100 Gb+ dosya alanı kaplayabilir).
    2. Sıra dosyalarının sıkıştırılmamış olması gerekiyorsa, çoğu Linux kurulumunda standart olan gzip işlevini kullanın. Komut satırına "man gzip" yazarak kurulu kılavuzdan gzip ve seçenekleri hakkında ek bilgi edinin.
  3. Çoklamayı çözerek, sıralama bağdaştırıcılarını çıkararak, düşük kaliteli okumaları kaldırarak ve hem ileri hem de geri yönlü okumaları dahil ederek analizden önce dizileri temizleyin.
    1. Her temizleme adımının etkinliğini değerlendirmek üzere diziler hakkında temel kalite kontrol bilgilerini almak için aşağıdaki adımların her birinden sonra FastQC programı31'i kullanın.
    2. Tüm dizileri tek bir okuma dosyasından, sıralama bağdaştırıcılarında bulunan dizinlere bağlı olarak farklı havuzlara ayırmak için dizileri çoğullamayı kaldırın. Bu adım genellikle, kesin prosedür kullanılan sıralama makinesine bağlı olacağından danışılması gereken sıralama tesisi tarafından gerçekleştirilir.
    3. Cutadapt32 komut satırı programını kullanarak sıralama bağdaştırıcılarını çıkarın. Bağlı Bağdaştırıcı modunda giriş olarak seçim astarlarını (bağdaştırıcıları sıralamak yerine) kullanın. Seçim astarlarını içermeyen dizileri atmak için --discard-untrimmed seçeneğini kullanın.
    4. Bağdaştırıcılarla eşleşecek maksimum hata oranı ve kabul edilecek minimum ve maksimum dizi uzunluğu seçeneklerini ayarlayın. Eşleştirilmiş uç okumaları kullanıyorsanız, belirli parametreleri girin ve hem Okuma 1 hem de Okuma 2 sıralama dosyalarını verin. Cutadapt kılavuzu32'ye başvurarak gerektiğinde ek parametreler ayarlayın.
      NOT: Sıralama adaptörlerinin havuzlara bağlanması yönden bağımsızdır ve dizilerin yaklaşık %50'sini ileri yönde ve %50'sini ters yönde içerecektir. Ters yönde sekansların %50'sini kaybetmemek için Cutadapt, giriş olarak seçim primerlerinin ters tamamlayıcısı kullanılarak ikinci kez çalıştırılabilir.
    5. (İsteğe bağlı) Eşleştirilmiş uç sıralama kullanılıyorsa, Okuma 1 ve Okuma 2 dosyalarını PEAR33 programıyla birleştirin.
    6. Herhangi bir nükleotitte belirli bir eşiğin altında kaliteye sahip düşük kaliteli dizileri kaldırmak için FASTX-Toolkit program34'ü kullanın. 30'luk kaliteli bir kesme puanı iyi bir başlangıç noktasıdır. Genel kalite genel olarak iyiyse, bu adım atlanabilir.
    7. Ters yöndeki sıra dosyalarını ileri yöndekilerle birleştirmek için, ters yön dosyalarında FASTX-Araç Seti fastx_reverse_complement işlevini kullanın. Ardından, ileri ve geri tamamlama - geri dosyaları tek bir dosyada birleştirmek için yerleşik cat programını (çoğu Linux kurulumunda standart) kullanın.
  4. Farklı seçim havuzlarındaki dizilerin zenginleştirilmesini analiz etmek için FASTAptamer analiz araç seti35'i kullanın.
    1. Her dizinin kaç kez göründüğünü saymak için FASTAptamer-Count komutunu kullanın. Ardından, dizileri bolluğa göre sıralayın ve sıralayın. Count çıktı dosyası, diğer tüm FASTAptamer programları için giriş olarak gereklidir.
    2. Bir dosyadaki tüm dizileri yakından ilişkili dizilerden oluşan kümeler halinde gruplandırmak için FASTAptamer-Clust komutunu kullanın. Bir küme halinde gruplandırılmasına izin verilen tek nükleotid mutasyonlarının veya indellerin sayısını tanımlamak için "mesafe" parametresini kullanın.
      NOT: FASTAptamer-Clust programı, çok sayıda benzersiz dizi varsa (özellikle erken turlar için) hesaplama açısından çok pahalı olabilir, bu da tamamen tamamlanması günler hatta haftalar sürebilir. Kesme filtresi parametresi, düşük bolluk dizilerini kümelemenin dışında tutmak için kullanılabilir. Genel olarak, milyonda 10 veya 5 okuma (RPM) gibi daha yüksek bir kesme ile başlamak ve program hızlı bir şekilde biterse azaltmak iyidir. Havuzlar çok heterojense, dizileri makul bir zaman diliminde kümelemek mümkün olmayabilir.
    3. Seçimin birden fazla turunda bulunan her dizinin zenginleştirmesini hesaplamak için FASTAptamer-Enrich'i kullanın. Bir popülasyondaki dizinin RPM'sini başka bir popülasyondaki RPM ile karşılaştırın. Count veya Cluster dosyalarında Enrich programını kullanın. Çıktı, daha fazla analiz ve kolay sıralama için herhangi bir elektronik tablo yazılımında açılabilen sekmeyle ayrılmış değer (.tsv) dosyasıdır.
      NOT: FASTAptamer-Enrich programı, çok sayıda benzersiz dizi varsa hesaplama açısından da çok pahalı olabilir. Kesme filtresi parametresi, elektronik tablo yazılımında açılamayacak kadar büyük dosyaları önlemek amacıyla düşük bolluktaki dizileri çıktıdan hariç tutmak için kullanılabilir.
    4. (İsteğe bağlı) Çok sayıda havuz çok heterojense (birçok benzersiz dizi ve az sayıda yinelenen dizi), Clust veya Enrich programlarını kullanmak uygun olmayabilir. Bu durumda, dizileri bolluğa göre sıralayan (en üstte en bol olanı) ve sıra tanımlayıcısını RPM gibi önemli bilgileri içerecek şekilde yeniden adlandıran Count çıktı dosyasını kullanarak manuel zenginleştirme denetimi gerçekleştirin.
      1. En bol dizilerin bir listesini almak için Count dosyalarındaki standart Linux "head" programını kullanın. Ardından, diğer tüm ilgili havuzların Count dosyalarındaki en bol dizilerin her birini aramak için standart Linux "grep" programını kullanın. Herhangi bir eşleşme varsa, zenginleştirme bilgilerini el ile oluşturmak üzere o havuzdaki RPM'yi belirlemek için değiştirilmiş sıra tanımlayıcısını kullanın.
        NOT: Tüm sıralama çözümleme adımları için komut dosyaları Ek Kodlama Dosyaları 1-11'de bulunabilir.

9. Aptamer bağlama validasyonu ve tahlilleri

  1. Dizi analizi yoluyla elde edilen zenginleştirme bilgilerinden, sonraki seçim turlarında en fazla zenginleştirmeye sahip dizilere ve / veya son seçim turunda en bol dizilere dayanan aday aptamer dizilerini tanımlayın. Daha fazla test için birkaç farklı aday dizisi (en az 10-20) seçin, çünkü en yüksek oranda zenginleştirilmiş olması mutlaka en iyi performans gösteren aptamerler olmayabilir.
  2. Birden fazla numune için hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilen bağlayıcı bir tahlil kullanarak aday aptamerlerin ilk taramasını gerçekleştirin. Kolon bazlı ultrafiltrasyon bağlayıcı tahlil36 veya enzime bağlı oligonükleotid testi (ELONA) bu ilk tarama için iyi yöntemlerdir.
  3. En az iki bağımsız bağlama testi (örneğin, MicroScale Thermophoresis (MST)37,38, Enzyme-Linked Oligonükleotide Assay (ELONA)39, surface plasmon resonance 40 veya biolayer interferometri (BLI)41) kullanarak ilk taramadan itibaren en iyi bağlanma aktivitesini gösteren sekansların özgüllüğünü ve afinitesini analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

DNA aptamerleri bir test tüpü15'te SELEX kullanılarak elde edilebildiğinden, bu SELEX stratejisi, hem sağlam, tüm enfeksiyöz virüse doğru pozitif seleksiyon adımlarını (yani, bulaşıcı virüse bağlanan DNA moleküllerini tutmak) hem de belirli bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüs için karşı seçim adımlarını içerecek şekilde dikkatlice tasarlanmıştır. Özellikle UV tedavisi, bulaşıcı olmayan virüse bağlanabilen DNA dizilerini atarak. Seçim sürecinin şematik bir göste...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

SELEX, sadece pM-nM 22,43,44,45 aralığında yüksek afiniteli aptamerlerin tanımlanmasına değil, aynı zamanda yüksek ve ayarlanabilir seçiciliğe sahip aptamerlerin tanımlanmasına da izin verir. Sayaç seçiminden yararlanılarak, zorlu seçiciliğe sahip aptamerler elde edilebilir. Örneğin, Li grubu, patojenik bakteri suşlarını patojenik olmayan suşlardan ayırt edebilen diziler elde etme yeteneğini g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu protokolde kullanılan psödovirüs örneklerini (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1) sağladıkları için Chicago'daki Illinois Üniversitesi'nden Bayan Laura M. Cooper ve Dr. Lijun Rong'a ve ayrıca Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi'ndeki Roy J. Carver Biyoteknoloji Merkezi'nin DNA Hizmetleri tesisinden Dr. Alvaro Hernandez ve Dr. Chris Wright'a yüksek verimli dizileme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. ve in vitro seleksiyon ve aptamer karakterizasyon tekniklerinde bize yardımcı olan Lu grubunun birçok üyesi. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı'ndan (CBET 20-29215) bir RAPID hibesi ve Urbana-Champaign ve Illinois-JITRI Enstitüsü'ndeki Illinois Üniversitesi Sürdürülebilirlik, Enerji ve Çevre Enstitüsü'nden (JITRI 23965) bir tohum hibesi ile desteklenmiştir. A.S.P., finansal desteği için PEW Latin Amerika Bursu'na teşekkür eder. Ayrıca, Austin'deki Teksas Üniversitesi'ndeki Lu grubu araştırma programına destek için Robert A. Welch Vakfı'na (Grant F-0020) teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%10 Amonyum persülfat (APS)BioRad1610700
%100 EtanolSigma-AldrichE7023
Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1x PBSCorning21-040-CM
%40 akrilamid/bisakrilamid (29:1) çözeltisiBioRad1610146
Agencourt AMPure XP BoncuklarıBeckman CoulterA63880DNA temizleme boncukları - Bölüm 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Santrifüj Filtre ÜnitesiMerckUFC501024kesme 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Santrifüj Filtre ÜnitesiMerckUFC510024kesme 100 kDa
Borik AsitSigma-Aldrich100165
C1000 Çift 48/48 Hızlı Reaksiyon Modüllü Dokunmatik Termal DöngüleyiciBioRad1851148
Kalsiyum KlorürSigma-AldrichC4901
CFX Connect Gerçek Zamanlı PCR Tespit SistemiBioRad1855201
Dijital Kuru Banyolar/Blok IsıtıcılarThermo Scientific88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Thermo Fisher65001Streptavidin ile modifiye edilmiş manyetik boncuklar - Bölüm 4.9
EDTA disodyum tuzuSigma-Aldrich
Eppendorf Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleriSigma-AldrichT96611.5 mL
Lenti-X p24 Hızlı Titre KitiTakara Bio USA, Inc.632200Lentivirus miktar tayin kiti - Bölüm 3.3.2.1
MagJET Ayırma Rafı, 12 x 1,5 mL tüpThermo ScientificMR02
Magnezyum klorürSigma-AldrichM8266
Microseal 'B' PCR Plaka Sızdırmazlık Filmi, yapışkan, optik,BioRadMSB1001UV emici olmayan
Mini-PROTEAN Tetra Hücresi Hazır Jel Prekast Jeller için BioRad1658004EDU
Mini-PROTEAN Kısa PlakalarBioRad1653308
Mini-PROTEAN 0,75 mm Entegre Ara Parçalı PlakalarBioRad1653310
Moleküler Biyoloji Sınıfı SuLonza51200
Çok Plakalı 96 Kuyulu PCR Plakaları, yüksek profilli, eteksiz, şeffafBioRadMLP9611
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W
OneTaq DNA PolimerazNew England BioLabM0480S
Ovation Ultralow v2 + UDITecan0344NB-A01Yüksek oluk dizileme kitaplığı hazırlama kiti - Bölüm 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 & mikro; L, 20-200 ve mikro; L, 2-20 ve mikro; L ve 0.2-2 &mikro; L)GilsonF144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Arıtıcı Logic+ Sınıf II, Tip A2 Biyogüvenlik KabinleriLabconco4261
Qubit dsDNA BR Test KitiInvitrogenQ32850floresan bazlı  dsDNA miktar tayini  kiti - Bölüm 7.2.3
SHARP Klasik Düşük Tutmalı Pipet Uçları (10 uL, 200 uL, 1000 uL)Thomas Scientific1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodyum asetatSigma-AldrichS2889
Sodyum klorürSigma-AldrichS7653
Sorvall Legend Micro 17RMikrosantrifüj Termo Bilimsel75002440
SsoFast EvaGreenSupermix BioRad1725201qPCR mastermix - Bölüm 6.2.
Tris (hidroksimetil) aminometanSigma-AldrichT1503
Tüpleri ve Ultra Şeffaf Kapaklar, 8ABD bilimselAB1183PCR tüpü
şeritleri ÜreSigma-AldrichU5128
324503

Kaynaklar

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA - Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678(2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. Babraham bioinformatics - FastQC a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2022).
  35. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230(2015).
  36. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  37. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070(2017).
  38. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  39. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334(2018).
  40. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  41. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  42. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  43. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  44. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  45. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  46. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  47. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  48. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  49. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  50. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  51. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966(2022).
  52. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Aptamer Se imiBula c Vir s TespitiSELEX ProtokolDNA AptamerleriKar Se imVir s Ay r mqPCR zlemeBa lanma DeneyiY ksek Verimli Dizilemeevresel Vir s zleme

İlgili makaleler