Enfeksiyöz ve Enfeksiyöz Olmayan Virüsleri Ayırt Etmek için Aptamerlerin İn Vitro Seçimi

Virüs enfeksiyonlarının, son COVID-19 pandemisinden itibaren giderek daha belirgin hale geldiği gibi, dünya çapında muazzam ekonomik ve toplumsal etkileri vardır. Zamanında ve doğru tanı, virüslerin sağlıklı insanlara yayılmasını önlerken viral enfeksiyonların tedavisinde çok önemlidir. PCR testleri ^1,2 ve inmunoassay³ gibi birçok virüs tespit yöntemi geliştirilmiş olsa da, şu anda kullanılan yöntemlerin çoğu, tespit edilen virüsün gerçekten bulaşıcı olup olmadığını belirleyememektedir. Bunun nedeni, viral nükleik asit veya proteinler gibi tek başına virüsün bileşenlerinin varlığının, sağlam, bulaşıcı virüsün mevcut olduğunu göstermemesi ve bu biyobelirteçlerin seviyelerinin bulaşıcılık^ile zayıf korelasyon göstermesidir ^4,5,6. Örneğin, mevcut PCR tabanlı COVID-19 testleri için yaygın olarak kullanılan viral RNA, hasta bulaşıcı olduğunda enfeksiyonun erken evrelerinde çok düşük seviyelere sahipken, hastalar enfeksiyondan iyileştiğinde ve artık bulaşıcı olmadığında RNA seviyesi genellikle hala çok yüksektir ^7,8. Viral protein veya antijen biyobelirteçleri benzer bir eğilimi takip eder, ancak tipik olarak viral RNA'dan daha sonra ortaya çıkar ve bu nedenle bulaşıcılığın daha az öngörücüsüdür ^6,9. Bu sınırlamayı ele almak için, virüsün bulaşıcılık durumu hakkında bilgi verebilecek bazı yöntemler geliştirilmiştir, ancak sonuç elde etmek için uzun zaman (günler veya haftalar) gerektiren hücre kültürü mikrobiyoloji tekniklerine dayanmaktadır ^4,10. Bu nedenle, klinik veya çevresel örneklerin bulaşıcılığı hakkında bilgi verebilecek yeni sensörler geliştirmek, tedavideki gecikmeleri ve virüsün daha fazla yayılmasını önleyebilir. Bununla birlikte, çok az yöntem, bozulmamış bir enfeksiyöz viryonu tanıyabilen ve onu bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüsten ayırt edebilen algılama molekülleri elde edebilir.

Bu bağlamda, aptamerler benzersiz bir biyomoleküler araç olarak özellikle uygundur^11,12,13,14. Aptamerler, yüksek afinite ve seçiciliğe sahip bir hedefi tanımak için spesifik bir 3D konformasyon oluşturmalarını sağlayan spesifik bir nükleotid dizisine sahip kısa, tek sarmallı DNA veya RNA molekülleridir^15,16. İn vitro seleksiyon olarak da bilinen üstel zenginleştirme (SELEX) ile ligandların sistematik evrimi adı verilen ve 10 14-10^{15 dizili 17,18,19} büyük bir rastgele DNA örnekleme kütüphanesine sahip test tüplerinde gerçekleştirilen kombinatoryal bir seçim süreci ile elde edilirler. Bu yinelemeli işlemin her turunda, DNA havuzu ilk önce istenen koşullar altında hedefle inkübasyon yoluyla bir seçim baskısına tabi tutulur. Hedefe bağlı olmayan tüm diziler daha sonra kaldırılır ve geride yalnızca verilen koşullar altında bağlanabilen birkaç dizi kalır. Son olarak, önceki adımda seçilen diziler PCR ile güçlendirilir, havuzun popülasyonu bir sonraki seçim turu için istenen fonksiyonel dizilerle zenginleştirilir ve işlem tekrarlanır. Seçim havuzunun aktivitesi bir platoya ulaştığında (tipik olarak 8-15 turdan sonra), kütüphane en yüksek afiniteyi sergileyen kazanan dizileri tanımlamak için DNA dizilimi ile analiz edilir.

SELEX^{, virüsün} bulaşıcılık durumu 22 gibi diğer benzer hedeflere karşı daha fazla seçicilik kazanmak için kullanılabilecek benzersiz avantajlara sahiptir^20,21. İlk olarak, seçim için küçük moleküllerden ve proteinlerden tüm patojenlere ve hücrelere kadar çok çeşitli farklı tipte hedefler kullanılabilir¹⁶. Böylece, bulaşıcı bir virüse bağlanan bir aptamer elde etmek için, viral bir yüzey proteini¹⁹ yerine, sağlam bir virüs hedef olarak kullanılabilir. Bütün virüs SELEX, virüsün bozulmasına gerek kalmadan, özellikle virüsün doğal durumuna bağlanan aptamerlerin seçilmesine izin verir. İkincisi, SELEX, diğer benzer virüsler veya bulaşıcı olmayan inaktive virüsler gibi rakip hedefleri 21,23'ü kaldırmak için özel olarak hazırlanabilir^{ve her} seçim ²² turunda karşı seçim adımları kullanılabilir. Karşı seçim adımları sırasında, DNA havuzu bağlanma istenmeyen hedeflere maruz bırakılır ve bağlanan diziler atılır.

Bu çalışmada, bulaşıcı bir virüse bağlanan, ancak belirli bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüse veya başka bir ilgili virüse bağlanmayan aptamerleri seçmek için genel olarak uygulanabilecek bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, önceden bilinmesi gerekmeyen virüs yüzeyinin fonksiyonel farklılıklarına dayanarak tanıma ajanlarının elde edilmesini sağlar ve böylece yeni ortaya çıkan patojenlerin tespiti veya az çalışılmış hastalıklar için ek bir avantaj sunar.

1. Reaktiflerin ve tamponların hazırlanması

1. 1 L'lik son hacme 0,9 M Tris-baz, 0,9 M borik asit, 20 mM EDTA (disodyum tuzu) ve deiyonize su ekleyerek 10x Tris-borat EDTA (10x TBE) hazırlayın.
2. Aşağıdaki gibi% 10 denatüre edici bir poliakrilamid stok çözeltisi hazırlayın. 250 mL'lik bir cam şişede, 120 g üre (8 M), 25 mL 10x TBE, 62.5 mL% 40 akrilamid / bisakrilamid (29: 1) çözeltisi ve 250 mL'lik nihai hacme ulaşmak için yeterli damıtılmış su ekleyin. Tüm bileşenler çözülene kadar karıştırın.
3. 2x yükleme tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın. 50 mL'lik bir tüpe 21.636 g üre (8 M), 1.675 g EDTA (1 mM) ve 4.5 mL 10x TBE ekleyin. Damıtılmış suyla 45 mL'ye kadar doldurun ve tüm bileşenler çözünene kadar karıştırın.
4. 100 mM sodyum asetat ve 1 mM EDTA (disodyum tuzu) ekleyerek ekstraksiyon tamponunu hazırlayın. Son pH'ı 5 olarak ayarlayın.
5. Etanol çökeltme çözeltilerini aşağıdaki gibi hazırlayın. 3 M sodyum asetat hazırlayın, pH 5.2'ye ayarlayın ve 4 °C'de saklayın. %70 etanol v/v hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. % 100 etanol hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.
6. 1x PBS, 2,5 mM MgCl₂ ve 0,5 mM CaCl₂ içeren 500 mL SELEX tamponu hazırlayın. pH 7.4'e ayarlayın. 1x PBS, 2,5 mM MgCl₂, 0,5 mM CaCl₂ ve 8 M üre ekleyerek 8 M üre ile 100 mL SELEX tamponu hazırlayın. pH 7.4'e ayarlayın.
   NOT: SELEX tamponunun seçimi, seçilen aptamerin aptamerin uygulanacağı son numune üzerinde çalışacağından emin olmak için kritik öneme sahiptir. Örneğin, SARS-CoV-2'ye özgü aptamerler biyolojik örneklerde (örneğin, tükürük veya nazofaringes çubukları) kullanılacaktır. Bu nedenle, amaçlanan biyolojik numunelerde bu koşulları yakından taklit eden iyon konsantrasyonları, pH ve tamponun seçilmesi önemlidir.
7. Bağlama ve yıkama tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın. 50 mL'lik bir tüpte, 5 mM Tris, 0,5 mM EDTA (disodyum tuzu) ve 2 M NaCl hazırlayın. pH 7.5'e ayarlayın.

2. DNA kütüphanesi ve primerlerinin tasarımı ve sentezi

1. İlk ssDNA kütüphanesini ve primerleri aşağıdaki kriterlerle tasarlayın (örnek bir ssDNA kütüphanesi ve primer kümesi için Tablo 1'e bakınız, burada N rastgele bir nükleotid konumunu gösterir).
   1. Kütüphanenin, amplifikasyon için primer bölgeler olarak işlev gören 3' ve 5' uçlarındaki iki sabit diziyle çevrili 35 ila 60 nükleotitten oluşan merkezi bir rastgele bölge içerdiğinden emin olun. Tipik bir kütüphane uzunluğu 45 rastgele nükleotittir.
   2. Ters astarın, in vitro seçim işlemi sırasında streptavidin kaplı boncuklar kullanarak ssDNA'yı güçlendirilmiş çift sarmallı PCR ürünlerinden ayırmak için bir biyotin modifikasyonu içerdiğinden emin olun.
2. DNA oligolarını standart tuzdan arındırma saflaştırma ile ticari kaynaklardan satın alın. ssDNA kütüphanesini ve primerleri% 10 denatüre edici poliakrilamid jel elektroforezi (dPAGE) ile saflaştırın, ardından standart prosedürlere göre etanol çökeltme izleyin²⁴.
   DİKKAT: Akrilamid monomer ve ethidyum bromür tehlikeli kimyasallardır (insan kanserojenleri), bu nedenle PAGE'yi uygularken uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlükleri, eldivenler ve göz koruması) kullanın. Mümkün olduğunda, ethidyum bromür kullanmaktan kaçının ve daha güvenli bir boya ile değiştirin.
   NOT: Bu saflaştırma adımını gerçekleştirmekten kaçınmak için oligoları HPLC saflaştırma ile sipariş etmek mümkündür, ancak bu kısa oligonükleotidleri etkili bir şekilde ortadan kaldırmaz.
3. Etanol çökeltmesinden sonra istenen konsantrasyona (100 μM) kadar ssDNA'yı yeniden askıya almak için nükleaz içermeyen su ekleyin. SsDNA kütüphanesinin ve primerlerin konsantrasyonunu λ = 260 nm'de UV absorpsiyonu ile belirleyin. -20 °C'de saklayın.
4. Yüksek verimli sıralama, kitaplık hazırlama ve qPCR ölçümü için kullanmak üzere değiştirilmemiş bir ters astar satın alın.

3. Enfeksiyöz ve enfeksiyöz olmayan virüs örnekleri

DİKKAT: Enfeksiyöz ve enfeksiyöz olmayan virüs numuneleri, güvenli ve uygun şekilde işlemek için ekstra özen gerektiren biyogüvenlik seviye 2 (BSL2) numuneleridir. Bu numuneleri içeren prosedürün tüm adımları bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmeli veya virüs çözeltisi kapalı bir kapta (örneğin, kapaklı plastik tüpler) olmalıdır.

1. Enfeksiyöz virüslerin stok çözeltisini elde edin veya her virüs için karşılık gelen protokolü izleyerek bunları hazırlayın. Burada kullanılan SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 ve H5N1 psödovirüsleri, PBS tamponunda Prof. Lijun Rong'un laboratuvarı (UIC) tarafından sağlanmış ve bildirilen protokoller^22,25,26 uyarınca hazırlanmıştır.
   NOT: Bozulmamış bulaşıcı virüsü işlemek için biyogüvenlik seviye 3 tesisleri gerektiren virüsler için, psödovirüslerle çalışmak mümkündür. Psödotipli bir virüs, virüsün yüzey proteinlerini viral zarf içinde görüntüleyen ve böylece virüsün yüzeyini ve giriş mekanizmasını yakından taklit eden, ancak sürekli viral replikasyonda kusurlu olan bir lentivirüsten (HIV) üretilir.
2. Enfeksiyöz olmayan bir virüs stok çözeltisi elde edin veya dezenfeksiyon prosedürünü izleyerek hazırlayın. Burada kullanılan UV-inaktive SARS-CoV-2 psödovirüs (p-SARS-CoV-2) stoğu, PBS tamponunda Prof. Rong laboratuvarı (UIC) tarafından sağlanmış ve daha önce bildirilen protokol UV-inaktivasyon²² için kullanılmıştır.
   NOT: Mümkünse, virüsün tamamen inaktive edildiğinden emin olmak için virüsün bulaşıcılığını test etmek için bir tahlil yapın.
3. Virüs stoklarını ölçme
   1. Standart prosedürlere göre bir plak testi kullanarak virüsü ölçün^27,28,29. Bu tahlil sadece virüsün nicelleştirilmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda bulaşıcı virüsün konsantrasyonunu doğrulayan virüsün bulaşıcılık durumunu da gösterir.
   2. Bir plak testinin mevcut olmadığı psödovirüsler veya virüsler için, ticari olarak temin edilebilen kantitatif bir lentivirüs ELISA kiti kullanarak virüsü sayısallaştırın.
   3. p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 ve p-H5N1 için 1 x 10⁸ kopya/mL stok çözeltisi hazırlayın. Her stok çözeltisini, her biri 50 μL içeren alikotlarda ayırın ve -80 ° C'de tutun. Her deneyden önce yeni bir aliquot çözün.

4. In vitro seçim veya SELEX işlemi: ilk tur

NOT: Enfeksiyöz virüsü kullanan tüm adımlar için, bir BSL2 kabininde çalışın.

1. SsDNA kütüphanesini denatüre edin. 100 μM ssDNA kütüphanesinden (1 nmol) 10 μL alın ve 240 μL SELEX tamponu ile karıştırın. Kuru bir banyoda 15 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın ve ardından tüpü 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
2. SsDNA kütüphanesini aşağıdaki gibi bulaşıcı virüs (pozitif seleksiyon adımı) ile inkübe edin. Adım 4.1'den itibaren SELEX tamponunda 250 μL ssDNA kütüphanesini 50 μL bulaşıcı virüs (1 x 10⁸ kopya/mL) ile karıştırın. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
3. Santrifüj filtrelerinde spesifik olmayan alanları aşağıdaki gibi engelleyin. Adım 4.2'yi beklerken, santrifüj filtrelerini sonraki adımlar için hazırlayın.
   1. Kullanılacak her 0,5 mL santrifüj filtresine 400 μL 1 mM T20 dizisi (Tablo 1) ekleyin - 100 kDa'lık bir kesime sahip bir santrifüj filtresi ve 10 kDa'lık bir kesme işlemine sahip bir santrifüj filtresi.
   2. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve filtredeki T20 çözeltisini çıkarmak için 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın. Fazla T20 dizilerini çıkarmak için SELEX tamponu ile 3 kat yıkayın.
4. Bağlanmamış dizileri aşağıdaki gibi yıkayın. Adım 4.2'de inkübe edilen karışımı bloke edilmiş 100 kDa santrifüj filtresine ekleyin ve 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj. 400 μL SELEX tamponu ekleyerek ve 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yaparak 3 kat yıkayın. Kesiri filtrede tutun ve akışı atın.
5. Bağlı dizileri aşağıda açıklandığı gibi elute edin.
   1. Santrifüj filtresinin toplama borusunu değiştirin ve adım 4.4'te santrifüj filtresine 8 M üre içeren 300 μL SELEX tamponu ekleyin. Santrifüj filtresini kuru bir banyoda 15 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın ve ardından 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın.
   2. Salınan dizileri içeren filtreden akan fraksiyonu toplayın. Üç kez daha tekrarlayın. Bir BSL2 kabininde çalışın ve malzemeleri atmadan önce virüsü etkisiz hale getirmek için tüm malzemeleri% 10 çamaşır suyu ile yıkayın.
6. Aşağıdaki gibi konsantre edin ve tuzdan arındırın. 4.5'te toplanan çözeltiyi bloke edilmiş bir 10 kDa santrifüj filtresine ekleyin. 15 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj. Filtreden akan fraksiyonu atın.
   NOT: Bir önceki adımda virüsler filtrede 8 M üre ile tutulup etkisiz hale getirildiğinden, bu ve sonraki adımların biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmesine gerek yoktur. Adım 4.5'te olduğu gibi tüm çözelti toplanana kadar 0.5 mL'lik bir santrifüj tüpü kullanılıyorsa, bu prosedürün tekrarlanması gerekir, 1.2 mL filtreden akar.
7. 15 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yaparak üreyi çıkarmak için 300 μL SELEX tamponu ile 3 kat yıkayın. Filtreden akan fraksiyonu atın. Filtredeki çözeltiyi temiz bir toplama tüpünde baş aşağı çevirerek ve 5 dakika boyunca santrifüj yaparak geri kazanın.
8. Geri kazanılan çözeltinin son hacmini plastik bir tüpte pipet kullanarak 4,7'den ölçün. Bu çözüm, i'nin yuvarlak sayıya karşılık geldiği R_ia olarak adlandırılır. Tipik olarak, 30 μL ila 50 μL arasında hacimler elde edilir. DNA miktarını qPCR ile ölçmek için salınımlı ssDNA'nın 1 μL'sini alın.
   NOT: Bu, R₁a numunesinin başka bir zamanda devam etmek üzere -20 ° C'de tutulabileceği olası bir duraklama noktasıdır.
9. Aşağıda açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.
   1. İlk turda, R_1'in%90'ını PCR şablonu olarak örnek alın. Aşağıdaki turlarda, PCR gerçekleştirmek için adım 4.8'deki toplam hacmin% 60'ını alın ve diğer fraksiyonu -20 ° C'de saklayın.
   2. Belirtilen son konsantrasyona sahip aşağıdakilerle 50 μL'lik bir PCR reaksiyonu ayarlayın: 1x PCR reaksiyon tamponu, 200 μM dNTP'ler, 10 μL DNA şablonu (R 1 bir örnek),her bir astar 200 nM ve 1.25 U polimeraz (2.5 U / μL stok).
   3. Her bir primer seti ve ssDNA kütüphanesi için döngü sayısı ve tavlama sıcaklığı dahil olmak üzere PCR koşullarını optimize edin. Çok fazla döngü kullanmaktan kaçının, bu da bize primer-dimer gibi istenmeyen PCR alt ürünleri üretecektir. Astarların erime sıcaklığına bağlı olarak farklı tavlama sıcaklıklarını test edin.
   4. dsDNA havuzunu elde etmek için PCR'yi 95 °C'de 5 dakika boyunca optimize edilmiş koşulları kullanarak çalıştırın, ardından 95 ° C'de 1 dakika, 52 ° C'de 30 s ve 72 ° C'de 1 dakika boyunca 1 dakika boyunca 1 dakika boyunca 18 döngü yapın.
      NOT: Bu, PCR ürününün başka bir zamanda devam etmek için -20 ° C'de tutulabileceği başka bir olası duraklama noktasıdır.
10. Streptavidin modifiye manyetik boncuklar kullanarak ssDNA'yı kurtarın.
    1. PCR ürününün% 80'ini alın. Kalan fraksiyonu -20 °C'de saklayın.
    2. PCR ürününü 50 μL'lik alikotlara bölün ve 50 μL streptavidin modifiye manyetik boncuk (MB) içeren mikrofüj tüplerine ekleyin. Oda sıcaklığında hafif ajitasyonla (örneğin, dönen bir çalkalayıcı kullanın) 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, MB'yi izole etmek ve süpernatantı pipetleme ile çıkarmak için mikrofüj tüpünü manyetik rafa yerleştirin (net bir çözüm olmalıdır).
    3. Tüpe 200 μL bağlama ve yıkama tamponu ekleyerek yıkayın. Tüpü manyetik raftan çıkarın, tüpe dokunun ve pipetleme yaparak MB'yi homojen bir çözeltiye yeniden askıya alın. MB'yi izole etmek ve süpernatantı pipetleme ile çıkarmak için mikrofüj tüpünü manyetik rafa geri yerleştirin. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
    4. Yıkama tamamlandıktan sonra, MB'yi toplam 100 μL SELEX tamponunda tekrar askıya alın ve çözeltiyi 10 dakika boyunca 95 ° C'ye ısıtın. Tüp soğumadan önce tüpü hemen manyetik rafa yerleştirin ve ssDNA havuzunu içeren süpernatantı alın. 50 μL SELEX tamponu ekleyerek bu kurtarma adımını tekrarlayın.
11. Bir pipet kullanarak geri kazanılan fraksiyonun son hacmini 4,10'dan ölçün. Bu kesir, i'nin yuvarlak sayıya karşılık geldiği R_ix olarak adlandırılır. Genel olarak, 140 ila 150 μL arasında hacimler elde edilir. DNA miktarını qPCR ile ölçmek için 1 μL R₁x alın.

5. Sonraki seçim turları

1. SsDNA havuzunu denatüre edin. R₁x numunesinin %60'ını alın ve 50 μL SELEX tamponu ile karıştırın. Kuru bir banyoda 15 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın. Tüpü 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
2. SsDNA havuzunu bulaşıcı olmayan virüs ve diğer potansiyel müdahale eden virüslerle inkübe edin (sayaç seçim adımı). Denatüre ssDNA havuzunu 5.1'den SELEX tamponunda her virüsün 50 μL'si ile karıştırın (5 x 10⁹ kopya/mL; örneğin, bulaşıcı olmayan p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 ve p-H5N1). Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
3. Santrifüj filtrelerinde spesifik olmayan siteleri engelleyin. Adım 5.2.'yi beklerken, santrifüj filtrelerini sonraki adımlar için hazırlayın. Tipik olarak, biri 100 kDa, diğeri 10 kDa kesme özelliğine sahip iki santrifüj filtresi kullanın. 4.3'teki prosedürün aynısını uygulayın.
4. Hedef olmayan virüslere bağlı dizileri yıkayın. Adım 5.2'de inkübe edilen karışımı bloke edilmiş bir 100 kDa santrifüj filtresine ekleyin. 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın ve santrifüj filtresinden akan fraksiyonu geri kazanın. 2 kez yıkayın, 100 μL SELEX tamponu ekleyin ve 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın. Filtreden akan kesiri saklayın.
5. SsDNA havuzunu bulaşıcı virüs ile inkübe edin (pozitif seçim adımı). Adım 5.4'ten 300 μL fraksiyonu alın ve 50 μL bulaşıcı virüs (1 x 10⁸ kopya / mL) ile karıştırın. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. 4.4 ile 4.11 arasındaki adımları izleyin.

6. SELEX sürecinin izlenmesi

NOT: Havuzun zenginleşmesini izlemek için, qPCR iki şekilde kullanılır. İlk olarak, mutlak niceleme ile, havuzların zenginleştirilmesini test etmek mümkündür (elüsyon verimi). İkincisi, erime eğrisi izlenerek, havuzların çeşitliliği (aptamer türlerinin yakınsaması)³⁰ olarak değerlendirilebilir.

1. qPCR için tasarlanmış 96 delikli plakalarda 10 μL reaksiyon hacmine sahip tüm qPCR analizlerini gerçekleştirin.
2. 5 μL ana karışım, etiketlenmemiş her astarın 0,3 μL'si 500 nM, 3,4 μL_H2O ve 1 μL DNA şablonu içeren standart bir qPCR karışımı hazırlayın.
   1. Standart eğriyi çalıştırmak için saflaştırılmış ssDNA kütüphanesinin seyreltilerini (adım 2.3) hazırlayın.
   2. Konsantrasyonlarını standart eğriye sığdırmak için DNA örneklerini seyreltin. Ri anumuneleri için, qPCR karışımına seyreltme olmadan numunenin 1 μL'sini ve 1:10 seyreltmenin 1 μL'sini ekleyin. R_ix numuneleri için 1:10 veya 1:100 seyreltme ekleyin.
3. Aşağıdaki protokolü ayarlayarak qPCR'yi çalıştırın. İlk olarak, 2 dakika boyunca 98 ° C'de bir başlangıç denatürasyon adımı ayarlayın. Ardından, 5 s için 98 ° C'de 40 denatürasyon döngüsü ve 10 s için 52 ° C'de tavlama ve uzatma ayarlayın. Son olarak, 65 ila 95 °C arasında bir erime eğrisi analizi ayarlayın. Otomatik eşik analizi ile eşik döngüsü (Ct) değerlerini belirleyin.
4. Standart eğriyi kullanarak, R i a ve R_ix örneklerindeki ssDNA miktarını ölçün.
5. Elüsyon verimini, bağlı DNA miktarının (R i a'daki mol sayısı) başlangıç DNA miktarına (R_i-1x'teki mol sayısı) bölünmesiyle hesaplayın. Turlar üzerinde bir zenginleştirme gözlenip gözlenmediğini görmek için elüsyon verimini yuvarlak sayıya karşı grafiklendirin.
6. Farklı turlar için erime eğrilerini çizin. Tur sayısı arttıkça 75/85 ° C yakınlarındaki zirvede daha yüksek erime sıcaklıklarına geçiş bekleniyor. Bu da havuzun çeşitliliğinin azalması anlamına gelir.

7. Yüksek verimli sıralama

1. Kitaplık hazırlama yöntemini belirleyecek olan hangi sıralama türlerinin ve ölçeklerinin mevcut olduğu konusunda yüksek verimli sıralama tesisine danışın.
   NOT: Bu karar hem sıralanacak havuzların uzunluğunu (astarlar dahil) hem de gönderilecek havuz sayısını dikkate alacaktır (genellikle havuz başına en az 1 x 10^{5-10 6} dizi hedefleyin). Belirli bir sıralama ölçeği havuzun tüm uzunluğunu okuyamıyorsa, yalnızca bir uçtan okuyan tek uçlu sıralamanın aksine, dizinin her iki ucundan da okumak için çift uçlu sıralama kullanılabilir.
2. Sıralama tesisine danışarak, sıralama türüne bağlı olarak piyasada bulunan uygun bir kit seçin. Yüksek, orta ve düşük zenginleştirmeyi temsil eden birden fazla seçim turu havuzunun yanı sıra son havuzu, tek bir şerit kullanarak tüm turların örnek analizine izin veren her havuz için bağdaştırıcılarda farklı bir dizin çifti kullanarak hazırlayın.
   NOT: PCR amplifikasyonu, yüksek verimli sıralama için gereken adaptörleri ve indeksleri dahil etmek için de kullanılabilir, ancak bu genellikle ticari kitlere benzer maliyetlidir ve daha iyi performans göstermez.
   1. Aşağıdaki adımları izleyerek kütüphane hazırlığı gerçekleştirin: parçalanmış DNA'nın son onarımı, adaptör ligasyonu ve son kütüphaneleri üretmek için PCR amplifikasyonu.
   2. PCR ürününü, üreticinin talimatlarını izleyerek manyetik DNA temizleme boncukları ile saflaştırın.
   3. Floresan bazlı bir niceleme kiti kullanarak DNA'yı sayısallaştırın. Küçük hacimli UV ölçümleri gibi daha az doğru yöntemler kullanmaktan kaçının.
   4. Belirli indeksler içeren her havuz kütüphanesinin yaklaşık olarak eşit miktarlarını (hacim değil, DNA miktarına göre) karıştırın.
   5. qPCR nicelemesi ve bir DNA fragman analizörü ile son kütüphanenin kalitesini kontrol edin. Bu adım genellikle sıralama tesisi tarafından gerçekleştirilir.
      NOT: Sıralama tesisi personeli, kütüphanenin nasıl hazırlanacağı ve hangi kalite kontrollerinin önerildiği konusunda yararlı bilgiler sağlayabilir. Kütüphaneleri hazırlamadan önce onlarla görüşmek gerekir.
3. Hazırlanan son kütüphaneyi gereksinimlerini takip ederek sıralama tesisine gönderin.

8. Sıralama analizi

1. Sıralama analizi için kullanılabilen çoğu yazılım, Linux işletim sistemindeki komut satırında çalıştırılmak üzere tasarlanmıştır. Küçük veri kümeleri için, istediğiniz Linux işletim sistemini kurun ve gerekli programları kişisel bir bilgisayara yükleyin; daha büyük veri kümeleri için HTS analizi, yüksek performanslı bilgi işlem kaynaklarında veya süper bilgisayarlarda çalıştırılır (önerilir).
   NOT: Yüksek performanslı bilgi işlem kaynaklarını kullanmak için erişim ve eğitim gerekecektir ve bu kaynakların elde edilmesi biraz zaman alabilir. Ayrıca, UNIX komut satırı kullanımı hakkında temel bilgi gereklidir. Temel komut satırı kullanımıyla ilgili birçok ücretsiz kaynak çevrimiçi olarak mevcuttur ve bilgi işlem kaynakları büyük olasılıkla sistemlerini kullanmak için ek bilgiler sağlayacaktır.
2. Sıralama olanağı tarafından sağlanan bilgileri kullanarak, genellikle sıkıştırılmış bir FastQ dosya biçimindeki sıralama dosyalarına erişin.
   1. Dosyaları kendi bilgisayarınıza ve/veya yüksek performanslı bilgi işlem kaynağına aktarmak için bir FTP istemcisi kullanın. Birçok dizi analizi programı sıkıştırılmış dosyaları doğrudan kullanabilir, bu nedenle dosya boyutlarını sınırlamak için mümkünse dosyaları sıkıştırılmış halde tutun (50 M+ dizilimin büyük dizi okumaları, sıkıştırılmadığında 100 Gb+ dosya alanı kaplayabilir).
   2. Sıra dosyalarının sıkıştırılmamış olması gerekiyorsa, çoğu Linux kurulumunda standart olan gzip işlevini kullanın. Komut satırına "man gzip" yazarak kurulu kılavuzdan gzip ve seçenekleri hakkında ek bilgi edinin.
3. Çoklamayı çözerek, sıralama bağdaştırıcılarını çıkararak, düşük kaliteli okumaları kaldırarak ve hem ileri hem de geri yönlü okumaları dahil ederek analizden önce dizileri temizleyin.
   1. Her temizleme adımının etkinliğini değerlendirmek üzere diziler hakkında temel kalite kontrol bilgilerini almak için aşağıdaki adımların her birinden sonra FastQC programı^31'i kullanın.
   2. Tüm dizileri tek bir okuma dosyasından, sıralama bağdaştırıcılarında bulunan dizinlere bağlı olarak farklı havuzlara ayırmak için dizileri çoğullamayı kaldırın. Bu adım genellikle, kesin prosedür kullanılan sıralama makinesine bağlı olacağından danışılması gereken sıralama tesisi tarafından gerçekleştirilir.
   3. Cutadapt³² komut satırı programını kullanarak sıralama bağdaştırıcılarını çıkarın. Bağlı Bağdaştırıcı modunda giriş olarak seçim astarlarını (bağdaştırıcıları sıralamak yerine) kullanın. Seçim astarlarını içermeyen dizileri atmak için --discard-untrimmed seçeneğini kullanın.
   4. Bağdaştırıcılarla eşleşecek maksimum hata oranı ve kabul edilecek minimum ve maksimum dizi uzunluğu seçeneklerini ayarlayın. Eşleştirilmiş uç okumaları kullanıyorsanız, belirli parametreleri girin ve hem Okuma 1 hem de Okuma 2 sıralama dosyalarını verin. Cutadapt kılavuzu^32'ye başvurarak gerektiğinde ek parametreler ayarlayın.
      NOT: Sıralama adaptörlerinin havuzlara bağlanması yönden bağımsızdır ve dizilerin yaklaşık %50'sini ileri yönde ve %50'sini ters yönde içerecektir. Ters yönde sekansların %50'sini kaybetmemek için Cutadapt, giriş olarak seçim primerlerinin ters tamamlayıcısı kullanılarak ikinci kez çalıştırılabilir.
   5. (İsteğe bağlı) Eşleştirilmiş uç sıralama kullanılıyorsa, Okuma 1 ve Okuma 2 dosyalarını PEAR³³ programıyla birleştirin.
   6. Herhangi bir nükleotitte belirli bir eşiğin altında kaliteye sahip düşük kaliteli dizileri kaldırmak için FASTX-Toolkit program^34'ü kullanın. 30'luk kaliteli bir kesme puanı iyi bir başlangıç noktasıdır. Genel kalite genel olarak iyiyse, bu adım atlanabilir.
   7. Ters yöndeki sıra dosyalarını ileri yöndekilerle birleştirmek için, ters yön dosyalarında FASTX-Araç Seti fastx_reverse_complement işlevini kullanın. Ardından, ileri ve geri tamamlama - geri dosyaları tek bir dosyada birleştirmek için yerleşik cat programını (çoğu Linux kurulumunda standart) kullanın.
4. Farklı seçim havuzlarındaki dizilerin zenginleştirilmesini analiz etmek için FASTAptamer analiz araç seti^35'i kullanın.
   1. Her dizinin kaç kez göründüğünü saymak için FASTAptamer-Count komutunu kullanın. Ardından, dizileri bolluğa göre sıralayın ve sıralayın. Count çıktı dosyası, diğer tüm FASTAptamer programları için giriş olarak gereklidir.
   2. Bir dosyadaki tüm dizileri yakından ilişkili dizilerden oluşan kümeler halinde gruplandırmak için FASTAptamer-Clust komutunu kullanın. Bir küme halinde gruplandırılmasına izin verilen tek nükleotid mutasyonlarının veya indellerin sayısını tanımlamak için "mesafe" parametresini kullanın.
      NOT: FASTAptamer-Clust programı, çok sayıda benzersiz dizi varsa (özellikle erken turlar için) hesaplama açısından çok pahalı olabilir, bu da tamamen tamamlanması günler hatta haftalar sürebilir. Kesme filtresi parametresi, düşük bolluk dizilerini kümelemenin dışında tutmak için kullanılabilir. Genel olarak, milyonda 10 veya 5 okuma (RPM) gibi daha yüksek bir kesme ile başlamak ve program hızlı bir şekilde biterse azaltmak iyidir. Havuzlar çok heterojense, dizileri makul bir zaman diliminde kümelemek mümkün olmayabilir.
   3. Seçimin birden fazla turunda bulunan her dizinin zenginleştirmesini hesaplamak için FASTAptamer-Enrich'i kullanın. Bir popülasyondaki dizinin RPM'sini başka bir popülasyondaki RPM ile karşılaştırın. Count veya Cluster dosyalarında Enrich programını kullanın. Çıktı, daha fazla analiz ve kolay sıralama için herhangi bir elektronik tablo yazılımında açılabilen sekmeyle ayrılmış değer (.tsv) dosyasıdır.
      NOT: FASTAptamer-Enrich programı, çok sayıda benzersiz dizi varsa hesaplama açısından da çok pahalı olabilir. Kesme filtresi parametresi, elektronik tablo yazılımında açılamayacak kadar büyük dosyaları önlemek amacıyla düşük bolluktaki dizileri çıktıdan hariç tutmak için kullanılabilir.
   4. (İsteğe bağlı) Çok sayıda havuz çok heterojense (birçok benzersiz dizi ve az sayıda yinelenen dizi), Clust veya Enrich programlarını kullanmak uygun olmayabilir. Bu durumda, dizileri bolluğa göre sıralayan (en üstte en bol olanı) ve sıra tanımlayıcısını RPM gibi önemli bilgileri içerecek şekilde yeniden adlandıran Count çıktı dosyasını kullanarak manuel zenginleştirme denetimi gerçekleştirin.
      1. En bol dizilerin bir listesini almak için Count dosyalarındaki standart Linux "head" programını kullanın. Ardından, diğer tüm ilgili havuzların Count dosyalarındaki en bol dizilerin her birini aramak için standart Linux "grep" programını kullanın. Herhangi bir eşleşme varsa, zenginleştirme bilgilerini el ile oluşturmak üzere o havuzdaki RPM'yi belirlemek için değiştirilmiş sıra tanımlayıcısını kullanın.
         NOT: Tüm sıralama çözümleme adımları için komut dosyaları Ek Kodlama Dosyaları 1-11'de bulunabilir.

9. Aptamer bağlama validasyonu ve tahlilleri

1. Dizi analizi yoluyla elde edilen zenginleştirme bilgilerinden, sonraki seçim turlarında en fazla zenginleştirmeye sahip dizilere ve / veya son seçim turunda en bol dizilere dayanan aday aptamer dizilerini tanımlayın. Daha fazla test için birkaç farklı aday dizisi (en az 10-20) seçin, çünkü en yüksek oranda zenginleştirilmiş olması mutlaka en iyi performans gösteren aptamerler olmayabilir.
2. Birden fazla numune için hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilen bağlayıcı bir tahlil kullanarak aday aptamerlerin ilk taramasını gerçekleştirin. Kolon bazlı ultrafiltrasyon bağlayıcı tahlil³⁶ veya enzime bağlı oligonükleotid testi (ELONA) bu ilk tarama için iyi yöntemlerdir.
3. En az iki bağımsız bağlama testi (örneğin, MicroScale Thermophoresis (MST)^37,38, Enzyme-Linked Oligonükleotide Assay (ELONA)^39, surface plasmon resonance 40 veya biolayer interferometri (BLI)⁴¹) kullanarak ilk taramadan itibaren en iyi bağlanma aktivitesini gösteren sekansların özgüllüğünü ve afinitesini analiz edin.

DNA aptamerleri bir test tüpü15'te SELEX kullanılarak elde edilebildiğinden, bu SELEX stratejisi, hem sağlam, tüm enfeksiyöz virüse doğru pozitif seleksiyon adımlarını (yani, bulaşıcı virüse bağlanan DNA moleküllerini tutmak) hem de belirli bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüs için karşı seçim adımlarını içerecek şekilde dikkatlice tasarlanmıştır. Özellikle UV tedavisi, bulaşıcı olmayan virüse bağlanabilen DNA dizilerini atarak. Seçim sürecinin şematik bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.

Bu protokolün temsili sonuçları olarak, bulaşıcı SARS-CoV-2 için bir aptamer seçimi seçtik. Sağlam, bulaşıcı SARS-CoV-2 ile başa çıkmak için biyogüvenlik seviye 3 (BSL3) çalışma koşullarının gerekliliği nedeniyle, bunun yerine sahte tipli bir virüsle çalışmayı seçtik. Psödotiplenmiş virüsler, nispeten zararsız bir omurga virüsünden, bu durumda, viral zarfı içinde farklı bir virüsün yüzey proteinini gösterecek şekilde modifiye edilmiş bir lentivirüs (HIV) türünden üretilir ve tehlikeli insan patojenleriyle çalışmaktan kaynaklanan riskler olmadan istenen virüsün yüzeyini ve giriş mekanizmasını yakından taklit etmesini sağlar. Önemli olarak, bu psödovirüsler sürekli viral replikasyonda kusurlu olacak şekilde modifiye edilir25,42. Bu çalışmada üç farklı psödotipe virüs kullanılmıştır: SARS-CoV-2 başak (S) proteinlerinin zarfa dahil edildiği p-SARS-CoV-2; SARS-CoV-1 başak (S) proteini içeren p-SARS-CoV-1; ve p-H5N1, yüksek derecede patojenik kuş gribi virüsü A / Kaz / Qinghai / 59/05 (H5N1) suşundan izole edilen hemaglutinin ve nöraminidaz içerir.

Seçimin ilk iki turunda, tipik olarak başlangıç turlarında sadece tek kopyalar olarak bulunan DNA bağlayıcılarının spesifik olmayan bir şekilde çıkarılmasını en aza indirmek için hiçbir karşı seçim adımı dahil edilmemiştir. İlk iki turdan sonra, yüksek bir seçiciliğe ulaşmak için her tura pozitif ve karşı seçim adımları dahil edildi. Karşı seçim için, UV tedavisi ile bulaşıcı olmayan hale getirilen p-SARS-CoV-2'nin yanı sıra diğer virüslere karşı seçicilik kazanmak için p-SARS-CoV-1 ve p-H5N1 kullanıldı.

Seçim ilerlemesini izlemek için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanıldı. Bu teknik, havuzun etiketlenmesini gerektirmeyen basit bir yöntemi temsil eder ve genellikle hemen hemen her hedef30'a uygulanabilir. qPCR tekniğinin iki özelliğinden yararlanır. İlk olarak, eklenen toplam ssDNA üzerinden bulaşıcı virüse bağlı ssDNA tarafından tanımlanan elüsyon verimini hesaplamak için standart bir eğri kullanarak mutlak niceleme olasılığı. Sonuçlarımız, elüsyon veriminin başlangıçta SELEX'in her erken turunda arttığını ve 8. ve 9. turlarda (R8 ve R9) düzleştiğini gösterdi, bu da havuzların bulaşıcı virüse bağlanan dizilerde zenginleşmesini düşündürdü (Şekil 2A). İkincisi, DNA havuzunun her turunun erime eğrileri, havuzların dizi çeşitliliği hakkında daha fazla kanıt sağlar30. Erime eğrileri karşılaştırıldığında, yüksek erime sıcaklığında (T m) zirveden 77 ° C'den 79 ° C'ye bir kayma gözlemlenebilir, bu da DNA havuzunun düşük Tm'li rastgele dizilerden daha yüksek Tm'li daha korunmuş dizilere yakınsadığını düşündürmektedir (Şekil 2B). Ayrıca, son turlarda (R8 ve R9), düşük Tm'de bir tepe noktası belirir (~ 70 ° C). Bu, PCR sırasında astar-dimerlerin üretimi ile ilgili olabilir. Bunu önlemek için olası bir çözüm, PCR sırasında döngü sayısını azaltmaktır (örneğin, 18 döngüden 12 veya 15 döngüye).

Havuzun qPCR ile zenginleştirildiğini doğruladıktan sonra, virüs hedefinin bağlanmasından hangi dizilerin sorumlu olduğunu bulmak için SELEX'in 3, 5, 7, 8 ve 9. turları için yüksek verimli dizileme (HTS) kullandık. Geleneksel klonlama-sıralama prosedürleriyle karşılaştırıldığında, HTS, sonraki turlarda zenginleştirilen aptamer dizilerini tanımlamak için çoklu seçim turları boyunca bireysel dizilerin evriminin izlenmesine izin verir. Şekil 3A , ardışık seçim turlarında elde edilen SARS2-AR10 dizisi için göreceli bolluğu (milyonda okuma cinsinden) göstermektedir. SARS2-AR10'un ikincil yapısı Mfold yazılımı tarafından tahmin edilmektedir ve sonuçlar (Şekil 3B), virüsün tanınmasında rol oynayabilecek bir kök döngü bölgesi içeren yapılandırılmış bir ikincil yapıyı göstermektedir. Bu dizinin afinite bağlanmasının daha ileri karakterizasyonu daha önce bildirilmiştir22. Mikro ölçekli termoforez (MST) ve enzime bağlı oligonükleotid testi (ELONA), SARS2-AR10 aptamerinin bulaşıcı p-SARS-CoV-2'ye Kd = 79 ± 28 nM ile bağlandığını ve bulaşıcı olmayan p-SARS-CoV-2'ye veya p-SARS-CoV-1 ve 229E gibi diğer koronavirüslere bağlanmadığını göstermiştir.

Şekil 1: Enfeksiyöz ve enfeksiyöz olmayan virüsleri ayıran aptamerlerin SELEX sürecinin şematik gösterimi. Enfeksiyöz virüse karşı yüksek özgüllüğe ulaşmak için ikinci turdan sonra her turda pozitif ve karşı seçim adımları eklendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Enfeksiyöz SARS-CoV-2'ye özgü aptamerlerin SELEX'inin ilerlemesinin izlenmesi. (A) Her bir SELEX turu için elüsyon veriminin (yani, eklenen ssDNA üzerindeki bağlı ssDNA'nın) qPCR kullanılarak ölçülmesi. (B) SARS-CoV-2 aptamer seçimi sırasında farklı havuzlar için erime eğrisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: SARS2-AR10 aptamerinin zenginleştirilmesi ve ikincil yapısı. SARS2-AR10 dizisi için HTS verilerinin FASTAptamer-Count kullanılarak seçim turlarının bir fonksiyonu olarak analiz edilmesiyle elde edilen milyonda okuma (RPM). Inset: UNAFold yazılımına dayanan SARS2-AR10 dizisinin tahmin edilen en kararlı ikincil yapısı. Hesaplamalar 25 °C, 100 mM NaCl ve 2 mM MgCl2'de yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: DNA dizilerinin listesi.

Ek Kodlama Dosyası 1: Cutadapt_script.txt, belirli bir giriş dosyasında belirtilen ileri ve geri astarlara sahip tüm dizileri tanımlar, astarları olmayan dizileri atar ve primerleri bunlara sahip olan dizilerden kaldırır. Cutadapt hakkında daha fazla bilgi için referans31'e bakın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 2: FASTAptamer_cluster_script.txt, tüm dizileri tek bir sayım dosyasından yakından ilişkili/benzer dizilerin ailelerine/kümelerine kümeleyecektir. Bu, bir aday dizi tanımlanırsa kullanışlıdır, böylece aynı kümedeki diğer benzer diziler de potansiyel aday olarak tanımlanabilir. FASTAptamer hakkında daha fazla bilgi için referans34'e bakın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 3: FASTAptamer_count_script.txt, belirli bir giriş FASTA/FASTQ dosyasından her benzersiz dizinin oluşum sayısını sayacak ve azalan sırayla (en yüksek bolluktan en düşük bolluğa) her benzersiz dizinin bir çıktı dosyasını üretecektir. Count çıktı dosyaları, diğer tüm FASTAptamer programları için giriş olarak gereklidir. FASTAptamer hakkında daha fazla bilgi için referans34'e bakın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 4: FASTAptamer_enrich_script.txt, herhangi iki veya üç giriş dosyasındaki tüm dizileri karşılaştırır, tüm dosyalar arasındaki tüm benzersiz dizilerin bolluğunu verir ve birden çok dosyada bulunan tüm dizilerin çift yönlü zenginleştirme değerlerinin (RPM cinsinden) tüm kombinasyonlarını verir. FASTAptamer hakkında daha fazla bilgi için referans34'e bakın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 5: fastqc_script.txt, çoğaltma düzeyleri, okuma uzunlukları ve kalite puanları gibi yüksek verimli sıralama verileri için okunması kolay kalite bilgileri sağlayan FastQ dosyaları için bir kalite kontrol aracıdır. FastQC hakkında daha fazla bilgi için referans30'a bakın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 6: FASTX_fwd_rev_merge_script.txt, belirli bir ters dosyadaki tüm dizilerin ters tamamlayıcısını çıkarmak için FASTX-Toolkit'i kullanır. Daha sonra, tüm dizilerle birlikte tek bir dosya vermek için bu ters ters tamamlayıcı dosyayı belirli bir ileri dizi dosyasıyla birleştirmek için cat komutunu (çoğu UNIX işletim sisteminde standart) kullanır. FASTX-Toolkit hakkında daha fazla bilgi için referans33'e bakın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 7: FASTX_quality_filter_script.txt, belirli bir FastQ dosyasındaki dizilerin kalitesini kontrol etmek için FASTX-Araç Seti'ni kullanır ve düşük kaliteli dizileri atabilir. Bu yöntem genellikle in vitro seçim dizilerinin analizi için kalite filtreleme yöntemlerinin kırpılmasından daha iyidir. Kırpma, genomik dizileme için kabul edilebilir olan düşük kaliteye dayalı dizilerin bazlarının (tipik olarak uçların yakınında) çıkarılmasını içerir, ancak tüm sekans fonksiyonel DNA için gerekli olduğundan, uçların kesilmesi yararlı değildir. Bunun yerine, bir dizinin çok fazla tabanı düşük kalitedeyse, dizinin tamamı atılır. FASTX-Toolkit hakkında daha fazla bilgi için referans33'e bakın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 8: grep_searcher_script.txt, belirli bir giriş dosyasında belirli bir giriş sırasını aramak ve bir çıkış dosyasında hem kimliği hem de sırayı (girişte bulunmuşsa) çıkarmak için kullanılır. Bu komut dosyası, FASTAptamer Cllust'un düzgün çalışmasının çok uzun sürmesine neden olan ve analiz için tipik elektronik tablo programlarında açılamayacak kadar büyük olan FASTAptamer Enrich dosyalarıyla sonuçlanan çok heterojen (yani, çok sayıda benzersiz diziye sahip) havuzlar için kullanışlıdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 9: gzip_compress_decompress_script.txt, dosyaları sıkıştırmak veya açmak için Gzip'i kullanır. Sıkıştırılmış bir dosyanın genellikle dosya adının sonuna .gz bir uzantısı eklenir. Dosya alanından tasarruf etmek için büyük dosyaların sıkıştırılması önerilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 10: PEAR_script.txt yalnızca eşleştirilmiş uç sıralama dosyaları için kullanılır ve Okuma 1 dosyasını karşılık gelen Okuma 2 dosyasıyla birleştirir. ARMUT hakkında daha fazla bilgi için referans32'ye bakın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 11: tar_extraction_creation_script.txt, birden fazla dosyayı ve / veya dizini tek bir dosyada harmanlamak için kullanılan Tar arşivlerini ayıklar veya oluşturur. Ayrıca, bu komut dosyasında yer aldığı gibi, bz2 sıkıştırması gibi dosya boyutunu küçültmek için genellikle sıkıştırılırlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.