Yöntem makalesi

Pozitron Emisyon Tomografisi Kullanılarak Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Fare Modelinde CD19+ B Hücrelerinin Görüntülenmesi

DOI:

10.3791/64133

⸱

20 Ocak 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, insana özgü bir anti-CD19 monoklonal antikorun radyo-etiketlenmesi için metodolojiyi ve bunun in vivo PET görüntüleme, ex vivo gama sayımı ve otoradyografi yaklaşımlarını kullanarak bir fare multipl skleroz modelinin periferik dokularındaki B hücrelerini ölçmek için nasıl kullanılacağını detaylandırmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipl skleroz (MS), genç erişkinleri etkileyen en yaygın demiyelinizan merkezi sinir sistemi (MSS) hastalığıdır ve genellikle hastalık ilerledikçe nörolojik defisitlere ve sakatlığa neden olur. B lenfositleri MS patolojisinde karmaşık ve kritik bir rol oynar ve klinik çalışmalarda çeşitli terapötiklerin hedefidir. Şu anda, spesifik anti-B hücre tedavileri için hastaları doğru bir şekilde seçmenin veya bu tedavilerin CNS ve periferik organlardaki B hücre yükü üzerindeki etkilerini invaziv olmayan bir şekilde ölçmenin bir yolu yoktur. Pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme, canlı deneklerde B hücrelerinin in vivo uzay-zamansal dağılımı ve yükü hakkında oldukça spesifik, nicel bilgi sağlama konusunda muazzam bir potansiyele sahiptir.

Bu makale, insan rekombinant miyelin oligodendrosit glikoprotein 1-125 ile indüklenen MS'in iyi kurulmuş bir B hücresi güdümlü fare modelinde, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) insan CD19+ B hücrelerine özgü bir PET izleyiciyi sentezleme ve kullanma yöntemlerini bildirmektedir. Burada açıklananlar, in vivo PET görüntüleme kullanılarak beyin ve omurilikteki CD19+ B hücrelerini tespit etmek ve ölçmek için optimize edilmiş tekniklerdir. Ek olarak, bu makale, kemik iliği, omurilik ve dalak dahil olmak üzere hastalıkla ilgili organların ex vivo gama sayımı için kolaylaştırılmış yöntemleri ve CNS dokularında CD19 izleyici bağlanmasının yüksek çözünürlüklü otoradyografisini bildirmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MS, bağışıklık aracılı nörolojik bir bozukluktur; Her hastadaki benzersiz sunum, hem hastalar hem de klinisyenler için yönetimi zorlaştırabilir1. Hastalığın kendisi, beyinde ve omurilikte demiyelinizan lezyonların ve immün hücre infiltrasyonunun varlığı ile karakterizedir, bu da fiziksel ve bilişsel bozulmaya neden olur2. MS'in T hücresi aracılı bir hastalık olduğu geleneksel paradigma, ilk olarak, B hücrelerinin CD20 + alt kümesini hedef alan bir tedavi olan rituksimab3'ün dönüm noktası niteliğindeki bir faz II klinik çalışmasında sorgulandı. O zamandan beri, hem tanısal hem de terapötik olarak avantajlı olabilen, daha geniş bir B hücresi aralığında eksprese edilen bir pan B hücresi biyobelirteci olan CD194'ü hedefleyen ek B hücre tedavileri geliştirilmiştir. Ayrıca, tedavi etkinliğini değerlendirmek için mevcut yöntemler (yani, nüks sayısının ve manyetik rezonans görüntüleme [MRI] aktivitesinin izlenmesi) erken yanıt ölçümlerini sağlamaz - bu nedenle hastaları yetersiz tedavi seçimi ve optimizasyonu nedeniyle önemli CNS hasarı riskine sokar. Bu nedenle, MS hastalarının CNS ve çevresinde CD19 + B hücreleri gibi spesifik bağışıklık hücrelerini gerçek zamanlı olarak izlemek için stratejilere kritik bir ihtiyaç vardır.

PET görüntüleme, CD19 gibi belirli bir ilgilenilen hedefin in vivo, tüm vücut görselleştirmesine izin veren sağlam bir görüntüleme tekniğidir. Kan alımları, nüks oranlarının kayıtları ve MRI yoluyla lezyon izleme, tedavi etkinliğine ilişkin anlık görüntüler sağlarken, PET görüntüleme, araştırmacıların ve klinisyenlerin bir tedavinin tüm vücuttaki etkinliğini izlemesine izin verebilir. Terapötik izlemeye yönelik bu proaktif yaklaşım, klinisyenlerin ilaç etkinliğini gerçek zamanlı olarak değerlendirmesine olanak tanıyarak gerektiğinde hızlı ayarlamalar yapılmasını sağlar. Hastalıkla ilişkili hücre popülasyonlarının yerinin ve yoğunluğunun izlenmesi, hastaya özgü anatomik bilgileri kullanarak şiddetin uzunlamasına değerlendirilmesine de izin verir. Bu nedenle, klinik ve klinik öncesi ortamlarda PET görüntülemenin tüm potansiyelini güvenilir bir şekilde kullanmak için tekrarlanabilir analitik yöntemler oluşturmak esastır.

Bu makale, insan rekombinant miyelin oligodendrosit glikoprotein 1-125 (MOG 1-125). Ayrıca, her ikisi de bu ve diğer nörodejeneratif modellerde sıklıkla ciddi şekilde etkilenen kritik patogenez bölgeleri olan beyin ve omurilikte radyoizleyici bağlanmasını doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirmek için yöntemler sunuyoruz. Bu teknikler, hastalık patolojisinde B hücrelerinin rolünün invaziv olmayan bir şekilde araştırılmasına izin verir ve MS'de anti-B hücre tedavilerinin etkinliğini değerlendirmek için klinik olarak çevrilme potansiyeline sahiptir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
Şekil 1: Çalışma tasarımı. Bu makaledeki temel tekniklere genel bir bakış. (A) Fareleri tarama yatağına sırt üstü yerleştirmek omurgadaki hareketi azaltır. (B) Farelerin PET/CT görüntülemesi. (C) Omurgayı ortaya çıkarmak için hayvanın sırt tarafından bir kesi yapın. (D) Omurgayı servikal/torasik ve lomber kısımlara ayırın ve belirtilen beş kesiği takip eden bölümleri çıkarın. (E) Şırınga ve omurga ile bir sızdırmazlık yaparak ve gösterildiği gibi omurganın kraniyal ve kaudal uçlarından kızartarak omuriliği omurgadan çıkarmak için bir şırınga kullanın. (F) İzole servikal/torasik ve lomber omurilik segmentleri. Kısaltma: PET/CT = Pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tüm hayvan çalışmaları, Laboratuvar Hayvanları Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Derneği (AAALAC International) tarafından akredite edilmiş bir program olan Stanford Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Bakımı İdari Paneli'ne (APLAC) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Fareler, çalışmanın başlamasından en az 7 gün önce vivaryuma alıştırıldı, çünkü stres EAE indüksiyonunu etkileyebileceğinden, fareler üzerindeki stresi en aza indirgedi.

1. Dişi insanlaştırılmış CD19 farelerinde EAE indüksiyonu

  1. MOG1-125 kullanarak daha önce tarif edildiği gibi 5 EAE ile 9-13 haftalık insanlaştırılmış CD19 C57BL / 6J dişi fareleri indükleyin.

2. EAE fare modelinde hayvan bakımı ve puanlama

  1. Daha önce tarif edildiği gibi fareler için hastalık ilerlemesini ve bakımını puanlayın5. Kısaca, bu modeli 1-5 arasında bir ölçekte şu şekilde puanlayın: 1 kuyruk zayıflığı/gevşekliği, 2 zayıflamış arka ayaklar, 3 arka bacak felci, 4 ön ayak zayıflığı ile arka bacak felci, 5 can çekişiyor.

3. mAb konjugasyonu, radyoetiketleme ve karakterizasyon

  1. İki işlevli şelatör 1,4,7,10-tetraazasiklododekan-1,4,7,10-tetraasetik asit mono-N-hidroksisüksinimid esteri (DOTA-NHS-ester) hCD19-mAb'ye 64Cu ile radyo-etikete eşitleyin.
    1. Bir tuz giderme sütunu kullanarak, hCD19-mAb depolama tamponunu HEPES tamponu (pH 8.5-9) ile değiştirin: tuz giderme kolonunu/kolonlarını HEPES ile koşullandırın. Tuzdan arındırma kolonu numune hacmi kapasitesine ve gereken mAb hacmine bağlı olarak gereken kolon sayısını hesaplayın: 0,5 mL tüpler: 30-130 μL numune hacmi, 300 μL yıkama; 2 mL tüp: 200-700 μL numune hacmi, 1 mL yıkama.
    2. Tuzdan arındırma kolonu aracılığıyla tampon değişimi için santrifüjü 4 °C'ye soğutun.
    3. Tuzdan arındırma sütununu buzdolabından alın. Tuz giderme kolonunun altını çıkarın, kapağı gevşetin ve kolonu bir toplama tüpüne yerleştirin.
    4. Depolama solüsyonunu çıkarmak için 1.500 × g'da 2 dakika santrifüjleyin; Depolama solüsyonunu içeren akışı atın ve toplama tüpünü yeniden kullanın. Tuz giderme sıkıştırılmış reçinenin en yüksek noktasının yukarı doğru eğimli olduğu sütun üzerinde bir çizgi işaretleyin.
    5. Tuzdan arındırma kolonunun alt tarafına HEPES tamponu ekleyin. Tuz giderme kolonunu, çizgi dışa bakacak şekilde santrifüje yerleştirin; 1.500 × g'da 2 dakika döndürün. Akışı atın ve toplama tüpünü yeniden kullanın.
    6. Aynı toplama tüpünü kullanarak ve adımlar arasındaki akışı atarak 3.1.4 ve 3.1.5 adımlarını 2x tekrarlayın.
    7. Şartlandırılmış tuz giderme kolonunu yeni bir toplama tüpüne ve etikete yerleştirin; bu tüp hCD19-mAb içerecektir.
    8. Şartlandırılmış tuzdan arındırma kolonunun/kolonlarının üstüne hCD19-mAb ekleyin ve boş mAb şişesini durulamak için HEPES tamponu kullanın; Bunu tuzdan arındırma sütununun üstüne ekleyin (üreticinin tavsiyesine göre toplam hacim). HC19-mAb'yi elüte etmek için 2 dakika boyunca 1.500 × g'da döndürün. HC19-mAb'yi içeren akışı koruyun.
    9. Bir UV/Vis spektrofotometresi kullanarak hCD19-mAb konsantrasyonunu ölçün ve gerekirse HEPES tamponu ile 0,5 μg/μL'ye ayarlayın.
    10. hCD19-mAb çözeltisine, hCD19-mAb çözeltisinde EDTA'nın nihai konsantrasyonunu 0.01 M yapmak için 0.5 M EDTA'lık mAb çözeltisinin hacminin 1/50'sini ekleyin. HC19-mAb-EDTA çözeltisini oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.
    11. DOTA-NHS-ester'i dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına (10-15 dakika) gelmesini bekleyin. İstenen DOTA/mAb molar oranının (tipik olarak 1-2 DOTA/mAb mertebesindedir) eklenmesine izin verecek bir DOTA konsantrasyonu yapmak için DOTA-NHS-ester'e eklenecek DMSO hacmini hesaplayın.
      NOT: HC19-mAb'ye eklenen DMSO-DOTA-NHS-ester hacmi, mAb hacminin 'unu geçmemelidir. Bu, hızlı ve tekrar tekrar yapılabilmesi için bir elektronik tablo kullanılarak yapılmalıdır.
    12. İstenen DOTA'nın hCD19-mAb'ye oranına bağlı olarak, hCD19-mAb'ye eklenecek DOTA-NHS-ester miktarını hesaplayın.
      nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg DOTA → mg/mL DOTA/DMSO → mL DMSO → DOTA/DMSO çözeltisinin seyreltme faktörü
    13. 1-2 mg DOTA-NHS-ester tartın ve DMSO'nun doğru hacmini (adım 3.1.11'de hesaplanan) DOTA-NHS-esterine dikkatlice ekleyin; karıştırın ve döndürün.
    14. DOTA-NHS-ester çözeltisinin (adım 3.1.12) hesaplanan hacmini hCD19-mAb çözeltisine pipetleyin; ekstra DOTA-NHS-ester eklenmediğinden emin olmak için eklemeden önce pipet ucunun dışını silin (pipetteki miktarı değiştirmeden). Yavaşça karıştırın ve döndürün.
    15. Gece boyunca (12-16 saat) reaksiyona girmesi için buzdolabına (4 °C) koyun.
  2. Saflaştırma ve konsantrasyon
    1. Santrifüj yoğunlaştırıcı tampon değişim adımları için santrifüjü 4 °C'ye soğutun; konjugatı dondurmak için kuru buz üzerine metal bir PCR tüp bloğu yerleştirin.
    2. DOTA-hCD19-mAb reaksiyonunu buzdolabından çıkarın ve biyolojik sınıf TRIS tamponu ekleyerek söndürün: toplam reaksiyon hacminin 'u. Kütle spektrometrisi analizi için numunenin 10-20 μg'ını çıkarın.
    3. 0,1 M amonyum asetat tamponu, pH 5,5 kullanarak tuzdan arındırma kolonunu/kolonlarını yukarıda açıklandığı gibi (adım 3.1.1-3.1.5) koşullandırın.
    4. DOTA-hCD19-mAb çözeltisini amonyum asetat ile tampon değişimi (adım 3.1.1-3.1.8).
    5. DOTA-hCD19-mAb çözeltisini konsantre edin: çözeltiyi, üreticinin hacim konusundaki tavsiyelerine uyarak 50 kDa'lık bir moleküler ağırlık kesme santrifüj yoğunlaştırıcıya ekleyin. 4.000 × g'da



    11. figure-protocol-2


























Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HC19-mAb, Şekil 2'de gösterildiği gibi DOTA konjuge edildi ve 64Cu ile radyoaktif etiketlendi. EAE ve saf farelere 64Cu-DOTA-hCD19-mAb enjeksiyonundan 18-24 saat sonra PET/BT taraması yapıldı (Şekil 3). PET/CT görüntüleri, PET analiz yazılımı kullanılarak birlikte kaydedildi ve CNS dokuları, manuel ROI'ler veya yarı otomatik bir 3D beyin atlası kullanılarak analiz edildi. ROI'lerde radyoizleyici bağlanması (Şekil 4) EAE farelerinde saf farelere göre daha yüksekti. Ex vivo gama sayımı ve ARG, EAE farelerinin omuriliğinde (hem lomber hem de servikal torasik segmentler) ve beyninde (sadece ARG) naif farelere kıyasla artmış bağlanma gösterdi (Şekil 5 ve Şekil 6). Perfüze farelerin ex vivo gama sayımı, dalak, femur ve kemik iliği dahil olmak üzere periferik organlarda radyoizleyici bağlanmasının azaldığını gösterdi (Şekil 5), bu EAE modelinde çevreyi terk eden ve CNS'ye sızan B hücreleri ile tutarlı.

figure-results-1
Şekil 2: Kalite kontrol verilerine ek olarak 64 Cu etiketli insana özgü CD19 monoklonal antikor, 16C4-TM mAb (64 Cu-DOTA-hCD19-mAb) üretmek için konjugasyon ve radyoetiketleme şeması. (A) DOTA-NHS-esterin hCD19-DOTA konjugatı (ölçek değil) üretmek için hCD19 monoklonal antikoru ile reaksiyonu ve 64Cu-DOTA-hCD19-mAb üretmek için 64Cu-CuCl3 ile radyo-etiketleme. (B) Temsili ITLC kromatografı. 40-60 cm'deki zirve, radyoaktif işaretli antikordur; bağlanmamış 64Cu-CuCl3 mobil faz ile hareket eder ve 200 ila 240 cm arasında mevcut olacaktır. Bu kromatografta saptanabilir serbest 64Cu-CuCl3 yoktur. (C) Radyoaktif işaretli antikorun kalite kontrol özellikleri. Kısaltmalar: DOTA-NHS ester = 1,4,7,10-Tetraazasiklododekan-1,4,7,10-tetraasetik asit mono-N-hidroksisüksinimid ester; ITLC / HPLC = anlık ince tabaka kromatografisi / yüksek performanslı sıvı kromatografisi; MALDI/LC-MS = matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon/sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi; BGBM = dakikadaki sayım. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 3: Hareketi en aza indirirken omurilik ve beynin yüksek kalitede görüntülenmesini sağlamak için PET tarayıcı içinde 3D baskılı bir yatakta farelerin nasıl sabitleneceğini gösteren fotoğraflar. (A) Isıtma elemanları ve anestezi tüpü ile donatılmış 3D baskılı dört fareli tarayıcı yatağı ("fare oteli" olarak da bilinir). (B) Omurganın düzlüğünü en üst düzeye çıkarmak için sırtüstü pozisyonda anestezi uygulanmış fareler; Her farenin yatak konumu kaydedilir. (C) Fareler, beyindeki hareketi en aza indirmek için başlarına ve nefes alma hareketini en aza indirmek için göbek boyunca güvenli bir şekilde bantlanmıştır. (D) Fare yatağı tarayıcının içine yerleştirilmiş ve tarama yatağına bantlanmıştır. Anestezi tüpü tarayıcıdan yatağa bağlandı ve izofluran %2'ye ayarlandı. Tarayıcı kapağını kapatmadan önce uygun izofluran seviyesini sağlamak için fare solunumu izlendi. Kısaltma: PET = Pozitron emisyon tomografisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 4: PET analiz yazılımı kullanılarak omurilik görüntüsü ve beyin analizi ve sonuçları. (A) i) Lomber torasik ve servikal vertebralardan ayırmak ve Otsu eşiklemesi için görüntü hazırlamak için omurgaya çizilen ROI'ler (pembe ve ten rengi). ii ) Spinal omurlar (turkuaz ve kırmızı) Otsu Eşikleme kullanılarak bölümlere ayrıldı. iii ) Omurlar daha sonra 3D ROI menüsünde değişmez hale getirildi ve omurilik servikal/torasik (mor) ve lomber (lacivert) ROI'lere bölündü. iv) Vertebra ROI'si çıkarıldı, omurilik ROI'leri ve temsili beyin atlası uygulandı. (B) Her bir hayvandaki kalbin yatırım getirisine normalize edilmiş %ID/g olarak temsil edilen çeşitli CNS bölgelerinden elde edilen PET sonuçlarının temsili analizi. PET edinimi, PET/CT görüntüleme ile 10 dakikalık bir statik taramaydı. Beyin bölgeleri, panel A'da gösterilen yarı otomatik bir beyin atlası yaklaşımı kullanılarak ölçülmüştür. iv) Temsili sonuçlar, beyinde ve torasik omurilikte izleyici bağlanmasında önemli bir artışa doğru önem veya eğilim göstermektedir. İstatistikler Student t-testi kullanılarak yapılmıştır (*: p < 0.0332). Kısaltmalar: PET = Pozitron emisyon tomografisi; ROI'ler = ilgi alanları; CNS = merkezi sinir sistemi; BT = bilgisayarlı tomografi; %ID/g = doku gramı başına enjekte edilen doz yüzdesi; EAE = deneysel otoimmün ensefalomiyelit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 5: EAE'de ve saf farelerde çeşitli organlarda ex vivo gama sayımının temsili miktar tayini% ID/g olarak ifade edilir. PET taraması sonrası, fareler, kanda bulunan radyoizleyiciyi serbest veya kanda yerleşik CD19 + B hücrelerine bağlı olarak çıkarmak için PBS ile perfüze edildi ve organlar, her organın doğru bir ağırlığına sahip olacak şekilde hızla diseke edildi ve tartıldı. EAE farelerinde dalak ve kemik iliğinde izleyici bağlanması, naif farelere göre önemli ölçüde azalmıştır. EAE farelerinin hem lomber hem de servikal/torasik omurilik segmentlerinde artmış radyoizleyici bağlanması gözlenir. Beyin, radyoizleyici sinyalinde önemli bir artış göstermez, ancak önemli bir artışa doğru eğilim göstermektedir. İstatistikler Student t-testi kullanılarak yapılmıştır (*: p < 0.0332; ****: p < 0.0001). Kısaltmalar: PET = Pozitron emisyon tomografisi; %ID/g = doku gramı başına enjekte edilen doz yüzdesi; EAE = deneysel otoimmün ensefalomiyelit; PBS = fosfat tamponlu salin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 6: Ex vivo ARG görüntüleri, naif farelerle karşılaştırıldığında EAE'den sagital beyin kesitlerinde ve tüm omuriliklerde 64Cu-DOTA-hCD19-mAb bağlanmasını göstermektedir. Dijital fosfor depolama filmleri, yaklaşık 10 yarı ömür (127 saat veya 5 gün) boyunca radyoaktif doku örneklerine maruz bırakıldıktan sonra bir fosfor görüntüleyici kullanılarak tarandı. Elde edilen görüntüler, EAE farelerinin beyninde, bu modelde B hücreleri içerdiği bilinen bölgeler nedeniyle beklenen saf farelerden alınan beyin bölümlerine kıyasla görsel olarak daha yüksek sinyal ortaya koymaktadır5. Spesifik olarak, EAE fare beyin bölümlerinin beyin sapı, beyincik ve ventriküllerinde artmış izleyici sinyali vardır. EAE fare beyin bölümleri için sinyaldeki bu artış, yukarıda ayrıntıları verilen tüm beyin PET nicelemesinde bulunanları yansıtmaktadır. Benzer şekilde, hem servikal/torasik hem de lomber omurilik segmentlerinde, naif omuriliklere kıyasla radyoizleyici bağlanmasında bir artış vardır, bu da ex vivo gama sayımı kullanılarak bulunanları yansıtır. Kısaltmalar: PET = Pozitron emisyon tomografisi; EAE = deneysel otoimmün ensefalomiyelit; Havalandırma = ventriküller; Cb = beyincik; BS = beyin sapı; TSc = torasik ve servikal omurilikler birleşik; LSc = lomber omurilik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Naif ve EAE fare beyin dokusunun CNS dokularının CD45R/B220 ile boyanması. B hücreleri, EAE farelerinin beyin sapı, meninksleri ve beyaz cevherinde gözlenir (n = 7 EAE, n = 5 saf fare, hayvan başına ortalama dört dilim). Bu rakam 5'ten. Ölçek çubukları = sagital beyin görüntülerinde 5 mm (düşük büyütme [1x]), beyin sapı, meninksler ve serebellar beyaz cevherde 100 μm (yüksek büyütme [20x]). Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, CD19-PET kullanılarak MS'in bir fare modelinde insan-CD19+ B hücrelerinin görüntülenmesi için kolaylaştırılmış bir yöntem açıklanmaktadır. MS'in heterojen prezentasyonu ve tedavilere farklı yanıtlar nedeniyle, klinikte yönetimi zor olabilir ve tedavi seçimi ve izlemi için yeni yaklaşımlara büyük ihtiyaç vardır. PET görüntüleme, hastalığın ilerlemesini ve B hücresini tüketen tedaviye bireysel yanıtı izlemek için güçlü bir araç olarak hizmet edebilir. MS'e ek olarak, CD19-PET görüntüleme, lenfoma ve lösemi alt tiplerinde veya diğer B hücresi aracılı hastalıklarda tedaviden sonra B hücresi tükenmesini izlemek için kullanılabilir. Bu protokol ve temsili veriler, nörolojik hastalıklarda B hücrelerinin görüntülenmesinin faydasını göstermektedir.

İnsan CD19+ B hücrelerini MS bağlamında incelemek için, B hücresine bağımlı MOG1-125 EAE model7'yi seçtik. Diğer EAE modellerine benzer şekilde, bu model ilerleyici paralizi ve immün hücrelerin CNS'ye infiltrasyonu semptomları ile kendini gösterir. Bununla birlikte, MOG1-125 modeli, B hücresi güdümlü bir model olması bakımından benzersizdir: fareler, meninksler, beyin sapı, parankim ve ventriküllerdeki subaraknoid boşlukta değişen sayıda B hücresi içerir. Bu lenfositler, bu bölgeler boyunca seyrek olarak dağılabilir ve/veya MS8,9'lu insanlarda da gözlenen folikül benzeri yapılar oluşturabilir. Saf farelerin kontrol olarak kullanılmasına ek olarak, tam bir Freund'un adjuvanı (CFA) sadece indüksiyon kiti kullanılabilir (yani, MOG proteini olmayan EAE farelerine verilenle aynı indüksiyon emülsiyonu). EAE fare modelinde, kan beyin bariyeri (BBB) işlevsizdir ve antikorlar gibi daha büyük varlıkların geçmesine izin verir. CD19-mAb radyoizleyici, yalnızca B hücreleri mevcutsa bağlanır ve CNS'de kalır; B hücreleri yoksa izleyici kan havuzuna geri dönecektir. Bunu, dokulardaki radyoaktivite düzeylerini ölçmeden önce perfüze ederek CNS dokularının gama sayımı ve ex vivo otoradyografisini kullanarak gösterdik. Bunu, CNS 1,2'deki B hücrelerini tespit etmek için mAb tabanlı PET radyoizleyicilerin (yani, immünoPET görüntüleme yaklaşımları) kullanımını bildiren daha önceki yayınlarda da gösterdik.

DOTA şelatörü, bakır-64 işaretli peptitler ve antikorlar ile klinik PET görüntülemede kullanıldığı için kullanıldı ve hCD19-mAb'yi MS hastalarının klinik görüntülemesi için çevirmeyi amaçlıyoruz. DOTA, in vivo olarak bakır-64'e yeterli bağlanma afinitesine sahiptir. İn vivo stabilite çok önemlidir çünkü serbest 64Cu karaciğere gider ve bağlı radyoizleyicinin sinyalini gizleyebilir; Bu nedenle, diğer organlara kıyasla bağıl sinyali hesaplamak için karaciğerdeki sinyali ölçmek önemlidir. Kas tipik olarak bir kontrol dokusu olarak alınır, ancak EAE durumunda kaslarda iltihaplanma olabilir. 64Cu'nun yarı ömrü 12.7 saattir, bu da sinyalin PET ile ölçülebilmesini sağlarken DOTA-hCD19-mAb'ın hedefine bağlanması için yeterli zaman sağlar. Konjugatı hazırlarken, istenen DOTA/mAb oranını üretmek için mAb'ye eklenecek DOTA miktarını belirlemek için küçük ölçekli (75-125 μg) test reaksiyonları gerçekleştirilmelidir (örneğin, mol mAb başına 6-10 kat fazla DOTA-NHS-ester reaksiyonu 1-2 DOTA/mAb'lik bir konjugat). Reaksiyon süresi ve sıcaklığı (örneğin, 2-4 saat veya gece boyunca 4 °C veya oda sıcaklığında) da DOTA/mAb oranını etkiler ve optimize edilmelidir. mAb başına DOTA sayısını hesaplamak için radyoaktif olmayan bakır ile bir titrasyon gerçekleştirilebilir; ancak, daha güvenilir ve doğru sonuçlar için MALDI-MS ve/veya LC-MS yapmanızı öneririz.

Hesaplanan DOTA/mAb oranı, belirli bir numune için ortalama bir değerdir ve bazı farklılıklar beklenir. MALDI için, konjuge ve konjuge olmayan mAb'ler için numune başına birkaç çekim yapılır. Daha sonra ortalama DOTA/mAb sayısını belirlemek için konjuge ve konjuge olmayan oranını hesaplıyoruz. DOTA/mAb oranı önemlidir çünkü çok fazla şelatör antikor bağlanmasını bozar ve çok azı tutarsız radyoetiketlemeye ve düşük sinyale yol açar. Tutarlı sinyal yoğunluğunu ve bağlanma kinetiğini korumak için oran, eşlenik partileri arasında çok yakın olmalıdır; İdeal olarak, belirli bir çalışmadaki tüm deneyler için aynı eşlenik parti kullanılmalıdır. Olası aşırı konjugasyona bağlı immünoreaktivite üzerindeki potansiyel etkileri azaltmak için umut verici bir teknik, bölgeye özgü konjugasyon10'u kullanmaktır, bu sayede şelatör konjugasyonu antikorun ağır zincirli glikanları üzerinde bölge seçicidir, böylece mAb başına 1 şelatör ilavesini garanti eder.

Diğer koşulların yanı sıra antikor, DOTA/mAb oranı ve 64Cu molar aktivitedeki farklılıklar radyo-etiketlemeyi etkileyeceğinden, radyoetiketleme reaksiyon koşulları en yüksek etiketleme verimliliğini ve verimini sağlamak için optimize edilmelidir. Optimum 64Cu / mAb eşlenik oranının kullanılması, radyoizleyicinin saflaştırılmadan kullanılmasına izin vererek, yerçekimi akış kolonu ve radyoaktif bozunma nedeniyle radyo-etiketleme ve kayıp için gereken süreyi azaltabilir. Aynı 64Cu / mAb konjugat oranı kullanıldığında tutarlı ve güvenilir bir molar aktivite de elde edilebilir, bu özellikle birden fazla fare kohortu veya görüntüleme çalışmaları arasındaki sonuçları karşılaştırırken önemlidir. ITLC koşulları da her kullanıcıya uyacak şekilde değiştirilebilir. Saflaştırma gerekliyse, molar aktivitenin hesaplanabilmesi için HPLC ve/veya UV/Vis spektrofotometrisi için bir alikot kaydedilmelidir.

Görüntüleme için radyoaktif işaretli antikorların kullanılmasının zor olabileceğini unutmamak önemlidir. Radyoizleyici için kullanılan antikorun fizyolojik bir etkiye sahip olmaması için biyolojik olarak inert olması esastır. Ayrıca, antikorlar uzun bir kan ikametgahına sahip olduklarından, görüntü kalitesinden ödün vermeden uygun bir sinyal-arka plan sağlamak için belirli bir mAb'nin dolaşımı, bağlanması ve temizlenmesi için yeterince uzun süre beklenmelidir. Tipik olarak 64 Cu etiketli bir mAb için 20-48 saat beklemek yeterlidir, ancak belirli bir kemirgen modelinde görüntüleme için en iyi zaman noktasını belirlemek için yeni bir mAb PET izleyiciyi değerlendirirken enjeksiyondan 2, 4, 6, 12, 24, 48 saat sonra görüntülenmelidir. Aynısı, en yüksek sinyal-arka plan oranına sahip ARG görüntülerini elde etmek için de geçerlidir. Bu protokoldeki temsili görüntüler enjeksiyondan 18-20 saat sonra alınmıştır, ancak kullanılan radyoizotopa bağlı olarak başka zaman noktaları da kullanılabilir. CD19'un farklı epitoplarına bağlanan farklı antikorlar farklı sonuçlar verecektir ve titizlikle karakterize edilmelidir.

Omurilik sinyalini analiz ederken, solunumun neden olduğu hareketi azaltmak için fareleri tarama yatağında sırt üstü konumlandırmak önemlidir. Ek olarak, sırtüstü yerleştirme, EAE hastalığının ilerlemesi nedeniyle omurga eğriliği artmış farelerde omurgayı düzeltmeye yardımcı olabilir. Omurga ve omurilikteki sinyali tespit etmeyi hedeflerken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önemli husus, MOG1-125'in yan tarafa enjekte edilmesinden kaçınmaktır, çünkü enjeksiyon bölgeleri bu bölgelerdeki ilişkili bağışıklık tepkisi nedeniyle izleyiciyi bağlayabilir. Enjeksiyon bölgesinin yakınlığı omurilik analizini etkileyebilir; Bu nedenle, burada açıklanan uygulama için göğüste enjeksiyonlar tercih edilir.

Kullanılan görüntü analiz teknikleri CNS görüntülemeye özgüdür. Görüntü analiz yazılımı içindeki bir beyin atlası aracı, PET ve CT kaydı doğru olduğu sürece tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar verir. Yarı otomatik 3D beyin atlasını kullanmak ve her farenin kafatasına uyacak şekilde ayarlamak, hayvanlar arasında tutarlı yatırım getirisi sağlar. Şu anda omuriliklerdeki sinyali analiz etmek için otomatik veya yarı otomatik bir yaklaşım olmadığından, manuel ROI'ler çizilmelidir. Özellikle, CD19 + B hücrelerini (veya hem kemik iliğinde hem de omurilikte bulunan herhangi bir hücre tipini) ölçerken, omurga ve kemik iliğinden kaynaklanan sinyali mümkün olduğunca ortadan kaldırmak çok önemlidir. Bunun nedeni, saf farelerin kemik iliğinde, B hücrelerinin CNS 5,11'e sızmak için çevreyi terk ettiği EAE farelerinden daha fazla CD19 + B hücresi içerdiğinin bilinmesidir. Bu kemik iliği sinyali, omurilikteki gerçek sinyali gizleyebilir.

Omurga ve kemik iliğinden gelen sinyalin katkısını en aza indirirken gerçek omurilik sinyalini tanımlamak için, BT görüntüsünün Otsu eşiklemesi, omurga için değişmez bir ROI oluşturmak için kullanılabilir. Ayrı bir omurilik ROI'si daha sonra omurga içinde kolayca çizilebilir. Aynı teknik, uyluk kemiğindeki kemik iliğini ölçmek için de uygulanabilir. Bu, omurilikteki izleyici bağlanması hakkında bilgi edinmek için çok yararlı bir yöntemdir. Bununla birlikte, PET'in nispeten düşük uzamsal çözünürlüğü ve farelerin küçük anatomik bölgelerini tararken kısmi hacim etkisi ile ilgili sorunlar nedeniyle, ek ex vivo doğrulayıcı tekniklerin (örneğin, gama sayımı, ARG) kullanılması, omurilikte kan, beyin omurilik sıvısı veya omurgadan yayılma sinyali olmadan radyoizleyici bağlanmasının doğrulanmasını sağlar.

Servikal / torasik omurilikteki sinyal, EAE farelerinde hastalığın ciddiyetine ve adaptif immün yanıt sırasında kaç B hücresinin sızdığına bağlı olarak değişme eğilimindedir. Saf farelerin pelvik / spinal kemik iliğindekilere kıyasla CNS'deki az miktarda B hücresinin yanı sıra sızan B hücrelerinin sayısındaki bu varyasyon, farelerde omurilik dokusunun in vivo kantitasyonunu zorlaştırabilir. Küçük hayvan görüntülemede PET'in uzamsal çözünürlüğü göz önüne alındığında, kemik iliğinden gelen sinyal omurilik sinyaline yayılabilir. Burada tamamlanan ex vivo biyodağılım ve otoradyografi, omurların omurilik dokusuna karşı PET sinyalinin doğrulanmasına yardımcı olur. Fareler, kan havuzundaki herhangi bir bağlanmamış izleyiciyi çıkarmak için diseksiyondan önce perfüze edilir, böylece gama sayımı ve otoradyografi sonuçları, o organdaki kan havuzundaki izleyiciden ziyade her organda gerçekten bağlı olan izleyiciyi yansıtır.

Radyoizleyiciler kanda dolaşır ve antikor izleyicileri ile, özellikle, ilk enjeksiyondan sonra haftalarca kanda genellikle bağlanmamış radyoizleyici bulunur. Birçok kan damarına sahip olan beyni ve omuriliği görüntülediğimiz için, sinyalin hangi kısmının gerçekten kan havuzunda bulunana karşı ilgilenilen beyin/dokudaki izleyici bağlanmasından kaynaklandığını anlamak önemlidir. Bu nedenle beyin sinyalini kalp/kan havuzundaki sinyale bölmek gerekir. Klinik ortamda, omurların Otsu eşiklemesi ve omurilik dokularının ROI'leri ile aynı görüntü analiz teknikleri miktar tayini için kullanılabilir. İnsanlarda farelere kıyasla daha büyük doku hacimleri göz önüne alındığında, kısmi hacim etkilerinden önemli ölçüde daha az etki olmalıdır, bu da doğruluğun artmasına ve in vivo bulguları doğrulamak için ex vivo tekniklere olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Klinikte PET kullanımı, klinisyenlerin bireysel B hücresi yüküne bağlı olarak her hasta için tedaviyi kişiselleştirmesine olanak tanıyacaktır.

ARG, beyin sapı ve beyincik gibi küçük bölgelerde izleyici bağlanmanın uzamsal konumunun daha doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlamak için yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için özellikle yararlıdır. Aynı kesitler ve/veya bitişik kesitler, B hücrelerinin varlığını doğrulamak için immünohistokimyasal boyalar için kaydedilebilir. Daha önce CNS dokularını CD45R/B220 (Ek Şekil S1) ile boyayarak B hücrelerinin sayısını PET ve ARG sinyali 5,9 ile ilişkilendirmiştik. Boyama daha sonra radyoizleyici sinyalinin boyama modeliyle eşleştiğini doğrulamak için ARG sonuçlarıyla uzamsal olarak karşılaştırılabilir. B hücreleri, beyin sapı boyunca kümeler halinde veya yaygın olarak bulunabilir; PET duyarlılığı, sinyali ölçmek için yeterince yüksektir, bu da klinik çeviri için cesaret vericidir. Omurilik ARG için, omuriliğin omurlardan çıkarılması, ölçülen sinyalin kemik iliği ve/veya kandan ziyade omurilik dokusundaki izleyici bağlanmasından kaynaklanmasını sağlar ve bu da kısmi hacim etkileri nedeniyle PET görüntülerini gizleyebilir.

ARG'ye benzer şekilde, ex vivo gama sayımı, tek tek organlarda radyoaktif sinyalin ölçülmesini sağlar. Bu özel teknik için, tüpleri gama sayacına yerleştirmeden önce dokuların ıslak ağırlığını ölçmek ve ilgili tüplerinin dibinde olduklarından emin olmak önemlidir. Tüpler, doğru tüpün kullanılması için fare numarası ve dokusu ile etiketlenmelidir; Tüp daha sonra kalibre edilmiş bir terazide tartılır ve organlar bir mikrogramın en yakın onda birine (0.0001 mg) yerleştirilir. Bazı dokular son derece küçüktür ve öncesi ve sonrası tüp kütlesindeki fark 0.0001 mg mertebesinde olacaktır. Nem kaybını önlemek için dokular diseksiyondan hemen sonra tartılmalıdır, bu da daha düşük bir kütle ile sonuçlanır. Tartıldıktan sonra, bu dokular ARG için dondurulmadan önce kurumasını önlemek için beyin ve omurilik tüpleri PBS ile doldurulmalıdır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD19 antikoru Horizon Therapeutics tarafından sağlandı.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stanford'daki SCi3 küçük hayvan görüntüleme tesisinden ve PET/CT ile ilgili teknik yardımı için Dr. Frezghi Habte'den destek için minnettarız. LC-MS, Stanford Üniversitesi Kütle Spektrometresi (SUMS) çekirdek tesisindeki çekirdek personel tarafından gerçekleştirilir ve bu hizmeti sağlayan personele teşekkür ederiz. Horizon Therapeutics'e hCD19-mAb'ı çok nazik bir şekilde sağladığı için ve özellikle Jodi Karnell'e teknik rehberliği ve desteği için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1) tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 mL 50 kDa MWCO Santrifüj filtreMiliporeSigmaUFC505008santrifüj filtre
64< / sup>Cu-CuCl3< / sub>Washington Üniversitesi, St. Louis; Wisonsin Üniversitesi, Madison; veya başka bir satıcı
AR-2000 Radio-TLC Görüntüleme TarayıcısıEckert & ZieglerAR-2000
Otoradyografi kasetiCole PalmerEW-21700-34Alüminyum, 8 "x 10"
Otoradyografifilmi  GE Yaşam Bilimleri28-9564-78Depolama Fosforlu Ekran BAS-IP SR 2025 E Süper Çözünürlük, 20 x 25 cm, yalnızca ekran
Kelebek İğneli KateterSAI İnfüzyon TeknolojileriBLF-24
DOTA-NHS-esterMakrosikliklerB-280
EAE İndüksiyon KitiHooke LaboratuvarlarıEK-2160
Geiger SayacıLudlum14C
GNEXT PET / CT TarayıcıSofieGNEXT
Hidex Otomatik Gama SayacıHidexAMG
HPLC SütunPhenomenex  00H-2146-K05 μ m SEC-s3000 400 &, 300 x 7,8 mm
Illustra NAP-5 sütunuCytiva17085301DNA yerçekimi sütunu
Resim: JNIHARG analiz yazılımı
Düşük Protein Bağlayıcı Toplama Tüpleri (1,5 mL)Thermo ScientificPI90410
NanoDrop Lite SpektrofotometreThermo Scientific840281400 UV-Vis mikro/nano spektrofotometre
PCR tüpleri 0.2 mL, DNA sınıfıiçin Eppendorf30124707
Typhoon fosfor görüntüleyici 9410GE Sağlık Hizmetleri8149-30-9410
VivoQuantInvicroSürüm 4 Yama 3PET Analiz Yazılımı; Beyin atlası eklentisi satın alınmalıdır
Zeba Spin Tuz Giderme Kolonları, 7K MWCO, 0,5 mLThermo ScientificPI89882Tuz Giderme sütunu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  2. Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
  3. Hauser, S. L., et al. B-cell depletion with Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis. The New England Journal of Medicine. 358 (7), 676-688 (2008).
  4. Chen, D., Gallagher, S., Monson, N. L., Herbst, R., Wang, Y. Inebilizumab, a B cell-depleting anti-CD19 antibody for the treatment of autoimmune neurological diseases: Insights from preclinical studies. Journal of Clinical Medicine. 5 (12), 107(2016).
  5. Stevens, M. Y., et al. Development of a CD19 PET tracer for detecting B cells in a mouse model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 275(2020).
  6. Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke. Journal of Visualized Experiments. (136), e57243(2018).
  7. Lyons, J. -A., Ramsbottom, M. J., Cross, A. H. Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein. European Journal of Immunology. 32 (7), 1905-1913 (2002).
  8. Haugen, M., Frederiksen, J. L., Degn, M. B. cell follicle-like structures in multiple sclerosis-With focus on the role of B cell activating factor. Journal of Neuroimmunology. 273 (1-2), 1-7 (2014).
  9. James, M. L., et al. Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).
  10. Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).
  11. Lyons, J. -A., et al. B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide. European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

B H cresi G r nt lemePET RadyotracerOmurilik AnaliziGama Say mAutoradyografiAk Sitometrisimm nohistokimya

İlgili makaleler