Burada, doğum sonrası farelerin merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerinden türetilen astrositlerin yüksek oranda zenginleştirilmiş kültürlerini ve transkripsiyon faktörlerinin zorla ekspresyonu ile fonksiyonel nöronlara doğrudan dönüştürülmelerini sağlamak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Astrositlerinin İzolasyonu ve Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Doğrudan nöronal yeniden programlama, multipotent ara ürünlerden geçmeden farklı başlangıç hücresi popülasyonlarından fonksiyonel nöronlar üretmek için güçlü bir yaklaşımdır. Bu teknik, örneğin nörodejeneratif hastalıklardan muzdarip hastalar için fibroblastları nöronlara dönüştürmeye izin verdiği için hastalık modellemesi alanında büyük vaatlerde bulunmakla kalmaz, aynı zamanda hücre bazlı replasman tedavileri için umut verici bir alternatifi temsil eder. Bu bağlamda, büyük bir bilimsel atılım, astrositler gibi merkezi sinir sistemi içindeki farklılaşmış nöral olmayan hücrelerin in vitro fonksiyonel nöronlara dönüştürülebileceğinin gösterilmesiydi. O zamandan beri, astrositlerin nöronlara in vitro doğrudan yeniden programlanması, zorla kimlik dönüşümünün altında yatan moleküler mekanizmalar ve verimli yeniden programlamayı önleyen engeller hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, farklı laboratuvarlarda gerçekleştirilen in vitro deneylerden elde edilen sonuçların, astrositleri izole etmek, kültürlemek ve yeniden programlamak için kullanılan yöntemlerdeki farklılıklar nedeniyle karşılaştırılması zordur. Burada, manyetik hücre sıralama yoluyla doğum sonrası yaşlarda farelerin merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerinden yüksek saflıkta astrositleri güvenilir bir şekilde izole etmek ve kültürlemek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, kültürlenmiş astrositleri viral transdüksiyon veya DNA transfeksiyonu yoluyla nöronlara yeniden programlamak için protokoller sağlıyoruz. Bu kolaylaştırılmış ve standartlaştırılmış protokol, hücre kimliğinin korunmasının altında yatan moleküler mekanizmaları, yeni bir nöronal kimliğin oluşturulmasını, ayrıca spesifik nöronal alt tiplerin üretimini ve fonksiyonel özelliklerini araştırmak için kullanılabilir.
Giriş
Memeli merkezi sinir sistemi (CNS), çok sayıda farklı nöronal alt tip 1,2,3,4,5,6 dahil olmak üzere yüzlerce farklı hücre tipinden oluşan oldukça karmaşıktır. Diğer organ veya dokularınaksine 7,8,9, memeli CNS çok sınırlı bir rejeneratif kapasiteye sahiptir; travmatik beyin hasarı veya nörodejenerasyon sonrası nöronal kayıp geri dönüşümsüzdür ve sıklıkla motor ve bilişsel eksikl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıdaki prosedür, Helmholtz Zentrum Münih'in bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı direktife uygun olarak hayvan bakım kılavuzlarını takip etmektedir. Lütfen diseksiyonun yapıldığı kurumun hayvan bakım kurallarına uyduğunuzdan emin olunuz.
1. Diseksiyon, dissosiyasyon ve kültür materyallerinin hazırlanması
NOT: Tüm kültür reaktiflerini biyolojik bir güvenlik kabini içinde hazırlayın ve sadece otoklavlanmış veya steril ekipman kullanarak çalışın. Diseksiyon ve ayrışma reaktifleri biyolojik güvenlik kabini dışında hazırlanabilir.
- Bir T25 kült....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Astrositlerin birincil kültürleri tipik olarak MAC sıralama ve kaplamadan 7 ila 10 gün sonra% 80 ila% 90 akıcılığa ulaşır (Şekil 1B). Genel olarak, tek bir T25 kültür şişesi yaklaşık 1-1.5 x 106 hücre verir, bu da hücreleri kuyu başına 5-5.5 x 104 hücre yoğunluğunda tohumlarken 20-30 örtü kayması için yeterlidir. Kaplamadan sonraki gün, hücreler tipik olarak örtü kayma yüzeyinin% 50-60'ını kaplar (Şekil 1C). Bu aşamada, kültürler neredeyse .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Murin astrositlerinin birincil kültürleri, doğrudan nöronal yeniden programlamayı incelemek için dikkate değer bir in vitro model sistemidir. Aslında, doğum sonrası bir aşamada izole edilmiş olmalarına rağmen, hücreler tipik astrosit belirteçlerini 29 eksprese eder,28,29 model genlerinin ekspresyonunu korur vekarşılaştırılabilir bir 38 yaşında in vivo astrositlere benzer şekilde çoğalma kapasitesini korur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yeniden programlama için yapıları klonladığı için Ines Mühlhahn'a, viral üretim için Paulina Chlebik'e ve el yazması hakkındaki yorumları için Magdalena Götz ve Judith Fischer-Sternjak'a teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.05 Tripsin / EDTA | Yaşam Teknolojileri | 25300054 | |
| 4 ', 6-Diamidino-2-fenyindol, dilaktat (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-fare IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Fare IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat # 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-fare IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-tavşan Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly / Mount | Polysciences | Cat # 18606-20 | |
| B27 Ek | Yaşam Teknolojileri | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Yaşam Teknolojileri | 13256029 | |
| Sığır Serumu Albümin (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat # A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tüpler | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM / F12 | Yaşam Teknolojileri | 21331020 | |
| Dorsomorfin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Yaşam Teknolojileri | PHG0311 | |
| Fetal Sığır Serumu | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat # Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glukoz | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Yaşam Teknolojileri | 35050038 | |
| HBSS | Yaşam Teknolojileri | 14025050 | |
| Hepes | Yaşam Teknolojileri | 15630056 | |
| Lipofektamin 2000 (Transfeksiyon reaktifi) | Thermo Fisher Cat | # 11668019 | |
| MACS Akıllı Süzgeç 70&mikro; m | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Ayırıcı | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Fare anti-ACSA-2 MicroBeat Kiti | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Fare IgG1 anti-Sinaptofizin 1 | Sinaptik Sistemler | Kedi # 101 011 RRID: AB_887824) | |
| Fare IgG2b anti-Tuj-1 (β III-küvet) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS sütunları | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Ek | Yaşam Teknolojileri | 17502048 | |
| Nöral Doku Ayrışma Kiti | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Ayırıcı | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serumu azaltılmış ortam) | Thermo Fisher Cat | # 51985-026 | |
| Penisilin / Streptomisin | Yaşam Teknolojileri | 15140122 | |
| Poli-D-Lizin | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Tavşan anti-RFP | Rockland | # 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Tavşan anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Kedisi# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Termo Balıkçı Kedi | # S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Kedi # T9284 |
Kaynaklar
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014(2020).
- Lake, B. B., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
