Fare Astrositlerinin İzolasyonu ve Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması

Memeli merkezi sinir sistemi (CNS), çok sayıda farklı nöronal alt tip 1,2,3,4,5,6 dahil olmak üzere yüzlerce farklı hücre tipinden oluşan oldukça karmaşıktır. Diğer organ veya dokuların^{aksine 7,8,9,} memeli CNS çok sınırlı bir rejeneratif kapasiteye sahiptir; travmatik beyin hasarı veya nörodejenerasyon sonrası nöronal kayıp geri dönüşümsüzdür ve sıklıkla motor ve bilişsel eksikliklerle sonuçlanır¹⁰. Beyin fonksiyonlarını kurtarmayı amaçlayan, kayıp nöronları değiştirmek için farklı stratejiler yoğun bir araştırma altındadır¹¹. Bunlar arasında, somatik hücrelerin fonksiyonel nöronlara doğrudan yeniden programlanması, umut verici bir terapötik yaklaşım olarak ortaya çıkmaktadır¹². Doğrudan yeniden programlama veya transdiferansiyasyon, farklılaşmış bir hücre tipini, bir ara proliferatif veya pluripotent durumdan geçmeden yeni bir kimliğe dönüştürme işlemidir^13,14,15,16. MyoD1'in fibroblastları kas hücrelerine dönüştürmek için yeterli bir faktör olarak tanımlanmasının öncülüğünü yaptığı bu yöntem, 19,20,21 ^19,20,21 gibi çeşitli hücre tiplerini yeniden programlamak için başarıyla uygulanmıştır.

CNS^22,23'teki en bol makroglia olan astrositler^, çeşitli nedenlerden dolayı doğrudan nöronal yeniden programlama için özellikle umut verici bir hücre tipidir. İlk olarak, CNS boyunca yaygın ve eşit olarak dağılırlar ve yeni nöronlar için bol miktarda in loco kaynağı sağlarlar. İkincisi, astrositler ve nöronlar, embriyonik gelişim sırasında ortak bir atayı paylaştıkları için gelişimsel olarak yakından ilişkilidir, radyal glial hücreler²⁴. İki hücre tipinin ortak embriyonik kökeni, farklı germ katmanlarından hücrelerin yeniden programlanmasına kıyasla nöronal dönüşümü kolaylaştırıyor gibi görünmektedir^19,21. Ayrıca, astrositler tarafından radyal glia kökenleri yoluyla miras alınan modelleme bilgisi, yetişkin astrositlerde de korunmaktadır 25,26,27 ve bölgesel olarak uygun nöronal alt tiplerin ^28,29,30 oluşumuna katkıda bulunduğu görülmektedir. Bu nedenle, astrositlerin nöronlara dönüşümünü araştırmak ve anlamak, hücre bazlı değiştirme stratejileri için bu tekniğin tam potansiyelini elde etmenin önemli bir parçasıdır.

İn vitro kültürlü astrositlerin nöronlara dönüştürülmesi, doğrudan nöronal yeniden programlama alanında aşağıdakiler de dahil olmak üzere çeşitli atılımlara yol açmıştır: i) astrositlerden nöronlar üretmek için yeterli transkripsiyon faktörlerinin tanımlanması^15,19,31, ii) aynı hücresel bağlamda farklı yeniden programlama faktörleri tarafından tetiklenen moleküler mekanizmaların^{çözülmesi32} ve iii) astrositlerin gelişimsel kökeninin farklı nöronal alt tipleri indükleme üzerindeki etkisini vurgulamak^28,29,33. Ayrıca, astrositlerin in vitro doğrudan dönüşümü, artan reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi 34 ve astrositlerin ve nöronların mitokondriyal proteomu arasındaki farklar 35 gibi doğrudan nöronal yeniden programlamayı sınırlayan birkaç büyük engeli çözmüştür ³⁵. Bu nedenle, bu gözlemler, astrositlerin birincil kültürlerinin, biyoloji^12'de, hücre kimliğinin korunması, hücre kaderi değişikliklerini önleyen barikatlar ve metabolizmanın yeniden programlamadaki rolü ile ilgili birkaç temel soruyu araştırmak için doğrudan nöronal yeniden programlama için bir model olarak kullanılmasını güçlü bir şekilde desteklemektedir.

Burada, astrositleri murin omuriliğinden izole ederek gösterildiği gibi, doğum sonrası (P) yaşta farelerden çok yüksek saflıkta astrositleri izole etmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz²⁹. Ayrıca astrositleri viral transdüksiyon veya DNA plazmid transfeksiyonu yoluyla nöronlara yeniden programlamak için protokoller sağlıyoruz. Yeniden programlanmış hücreler, yeniden programlama verimliliği ve nöronal morfoloji gibi çeşitli yönleri değerlendirmek için transdüksiyondan sonraki 7 günde (7 DPT) analiz edilebilir veya zamanla olgunlaşmalarını değerlendirmek için birkaç hafta boyunca kültürde tutulabilir. Önemli olarak, bu protokol omurilik astrositlerine özgü değildir ve astrositleri kortikal gri madde, orta beyin ve beyincik de dahil olmak üzere diğer çeşitli beyin bölgelerinden izole etmek için kolayca uygulanabilir.

Aşağıdaki prosedür, Helmholtz Zentrum Münih'in bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı direktife uygun olarak hayvan bakım kılavuzlarını takip etmektedir. Lütfen diseksiyonun yapıldığı kurumun hayvan bakım kurallarına uyduğunuzdan emin olunuz.

1. Diseksiyon, dissosiyasyon ve kültür materyallerinin hazırlanması

NOT: Tüm kültür reaktiflerini biyolojik bir güvenlik kabini içinde hazırlayın ve sadece otoklavlanmış veya steril ekipman kullanarak çalışın. Diseksiyon ve ayrışma reaktifleri biyolojik güvenlik kabini dışında hazırlanabilir.

1. Bir T25 kültür şişesini H2 O'da en az 2 saat boyunca poli-D-lizin (stok 1 mg / mL; çalışma çözeltisi₂₀μg / mL) ile kaplayarak kültür şişeleri hazırlayın. Daha sonra, H2 O ile 3x_durulayınve hava kurutun.
2. 500 mL Hank'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS) 5 mL 1 M HEPES tampon çözeltisi ekleyerek diseksiyon tamponunu hazırlayın.
3. Nöral doku ayrışma kitinden 1950 μL tampon X ekleyerek altı omurilik başına bir C-tüpü (Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın (bkz. Diseksiyon sırasında buz üzerinde saklayın. C-tüpü başına 20 μL tampon Y ve 10 μL tampon A ekleyerek enzimatik sindirim ana karışımını hazırlayın (nöral doku ayrışma kitinin bir parçası; bakınız Malzeme Tablosu). İyice karıştırın ve ihtiyaç duyulana kadar 4 ° C'de saklayın.
4. Kalsiyum ve magnezyum ile 1x fosfat tamponlu salin (1x PBS) hazırlayın ve buzun üzerine yerleştirin. 485 mL DMEM / F12'ye 5 mL penisilin-streptomisin (son konsantrasyon, 100 U / mL), 5 mL% 45 D-glikoz ve 5 mL glutamin takviyesi (son konsantrasyon 2 mM; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek temel kültür ortamını hazırlayın. Temel ortam 4 hafta boyunca 4 ° C'de kararlıdır.
5. 44 mL bazik kültür ortamına 1 mL B27 takviyesi ve 5 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyerek astrosit kültür ortamı hazırlayın. Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve bazik-fibroblast büyüme faktörü (bFGF) (her biri 10 ng / mL) ile ek ortam. Uygun miktarda ortama kullanmadan hemen önce EGF ve bFGF ekleyin.
6. Omurilik dokusunun diseksiyonu için, bükülmüş uçlu bir çift büyük forseps, bükülmüş uçlu bir çift küçük forseps, bir çift küçük forseps, bir çift küçük makas ve küçük bir spatula kullanın.

2. Astrosit izolasyonu

1. Astrositleri, fonksiyonel nöronlara doğrudan yeniden programlamalarını gerçekleştirmek için doğum sonrası farelerin omuriliğinden izole edin (Şekil 1A). Bu protokol için, doğumdan sonraki 2-3. günde farelerden omurilik dokusu toplayın. Astrosit izolasyonu için altı ila sekiz omurilik toplayın. Astrositleri korteks, orta beyin ve beyincik gibi sinir sisteminin diğer bölgelerinden izole etmek için aynı protokolü kullanın. Bu bölgeler için, doğumdan beş ila yedi gün sonra hücreleri elde edin.
   NOT: Astrositleri bu protokolde belirtilmeyen bölgelerden izole etmeyi amaçlarken, yaş ve giriş materyali deneysel olarak belirlenmelidir.

3. Omurilik dokusu diseksiyonu

NOT: Doku diseksiyonu biyolojik güvenlik kabininin dışında gerçekleştirilebilir.

1. Hayvanı anestezi olmadan kafasını keserek P2-P3'te fareleri kurban edin. Gövdeyi 35 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve buz üzerinde tutun.
2. Cildi makasla açın, omurları küçük makasla çıkarın, omuriliği çıkarın ve buz üzerindeki diseksiyon tamponuna yerleştirin. 2x büyütmeli stereotaktik diseksiyon mikroskobu altında, forseps kullanarak meninksleri izole omuriliklerden çıkarın ve disseke edilmiş ve temizlenmiş omurilik dokusunu bir C-tüpüne aktarın.

4. Manyetik aktif hücre sıralama (MACS)

1. Nöral doku ayrışma kitinden 50 μL enzim P ekleyin ( bakınız Malzeme Tablosu) ve her bir C-tüpüne önceden hazırlanmış 30 μL enzim karışımı. C tüplerini ters çevirin ve ısıtılmış bir ayrışıcıya yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu), tüm dokuların tüpün kapağında toplandığından emin olun.
2. 37_NTDK_1 ayrışma programını yaklaşık 22 dakikalık bir çalışma süresiyle çalıştırın. Programın bitiminden kısa bir süre önce, kullanılan C tüplerinin sayısına eşit sayıda 15 mL'lik tüplerin üzerine 70 μm'lik bir süzgeç yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve süzgeci 2 mL buz gibi soğuk PBS ile önceden ıslatın. Tüm MACS prosedürü boyunca 1x PBS'yi buz üzerinde saklayın.
3. Programın tamamlanmasından sonra, C tüplerini çıkarın ve tüplerin altındaki dokuyu toplamak için kısaca santrifüj yapın. Ayrışmış dokuyu C tüplerinden süzgeçten geçirerek hazırlanan 15 mL tüplere aktarın. Süzgeci 15 mL tüplerde bırakın.
4. Artık dokuyu toplamak için C-tüpünü 10 mL 1x PBS ile durulayın ve süzgeçten bir kez daha geçerek aynı 15 mL tüpte toplayın. Ayrışmış doku içeren 15 mL tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
   NOT: Bu adımdan sonra santrifüjü 4 °C'ye kadar soğutun.
5. Hücreleri 80 μL 1x PBS'de yeniden askıya almadan önce hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın; fare anti-ACSA-2 MicroBead kitinden 10 μL bloke edici reaktif ekleyin (bkz. Pipetleme ile nazikçe karıştırın.
6. Karanlıkta 10 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin (buzdolabı). 10 μL anti-astrosit hücre yüzeyi antijen-2-kuplajlı mikroboncuklar ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve pipetleme ile yavaşça karıştırın. Karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
7. 3 mL 1x PBS ekleyerek hücreleri yıkayın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Santrifüj yaparken, altında 15 mL'lik bir toplama tüpü bulunan separatörün üzerine uygun sayıda manyetik ayıklama sütunu (bkz. Malzeme Tablosu) yerleştirerek manyetik bir ayırıcı (bkz. Kolonları 500 μL 1x PBS ile durulayın.
8. Süpernatantı çıkarın ve hücre süspansiyonlarını manyetik sütunlara aktarmadan önce hücreleri 500 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın. Yerçekimi ile boşalmasına izin verin. 15 mL tüpleri 500 μL 1x PBS ile yıkayın ve kolona uygulayın. Ek iki yıkama için sütunları 500 μL 1x PBS ile yıkayın.
9. Kolonu ayırıcıdan çıkararak, 800 μL astrosit kültür ortamı ekleyerek ve hücreleri birlikte verilen pistonla kolondan dışarı iterek hücreleri yükseltin.
10. Daha önce hazırlanan kültürdeki plaka hücreleri, EGF ve bFGF ile desteklenmiş 4.2 mL astrosit kültür ortamı ve 37 °C'de kültür ve% 5 CO₂ eklenerek şişelenir.
    NOT: Kaplama kültürü şişeleri, diğer beyin bölgelerinden izole edilen astrositler için gerekli değildir, ancak omurilikten izole edilen astrositler için daha iyi bir substrat sağlar.
11. Kültür hücreleri yaklaşık 7 gün boyunca akıcılığa kadar (%80-%90). Hücreler 7 gün sonra birleşmezse, kaplamadan önce 10 güne kadar bekleyin. 10 gün sonra, hücreler artık çoğalmaz ve yeniden programlama verimliliği düşer.

5. Yeniden programlama için astrositlerin tohumlanması

NOT: Aşağıdaki adımlar, güvenlik seviyesi 1 (SL1) olan biyolojik bir güvenlik kabini altında gerçekleştirilmelidir.

1. Poli-D-lizin kaplı cam kapaklarla 24 delikli plakaları, daha önce kültür şişelerinin hazırlandığı şekilde hazırlayın. Gerekli plaka sayısını belirlemek için, astrositlerin²⁴ kuyucuklu bir plakada kuyu başına 5-5.5 x 10 4 hücre yoğunluğunda kaplandığını düşünün. Genellikle, altı omuriliği P2 farelerinden izole etmek, yaklaşık 1 x 10⁶ hücre verir.
2. Kültürlü astrositleri içeren T25 kültür şişelerinden gelen medyayı aspire edin ve 1x PBS ile bir kez yıkayın. 0,5 mL% 0,05 Tripsin / EDTA ekleyerek astrositleri kültür şişesinden ayırın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hücreleri kültür şişesi yüzeyinden serbest bırakmak için şişenin yan tarafına hafifçe dokunun ve 10X büyütme kullanarak parlak alan mikroskobu altında ayrılmayı kontrol edin.
3. 2.5 mL astrosit kültür ortamı ile tripsinizasyonu durdurun ve 15 mL tüplerde hücre süspansiyonunu toplayın. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj yapın, süpernatan aspire edin ve 1 mL astrosit kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın. Bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayma sistemi kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın.
4. Hücre sayısına bağlı olarak, mL başına 1-1.1 x 10⁵ hücrelik bir çözelti elde etmek için hücre süspansiyonunu taze astrosit ortamı ile seyreltin. Ortamı faktör başına 10 ng / mL'de EGF ve bFGF ile destekleyin. Daha önce hazırlanmış²⁴ delikli plakaların ve kültür hücrelerinin her bir kuyucuğuna 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de 5-5.5 x 10 4 hücreye eşdeğer 500 μL hücre süspansiyonu_ekleyin.

6. Transkripsiyon faktörlerinin zorla ifade edilmesi

NOT: Protokole devam etmeden önce, deneyi uygun şekilde tasarlamak önemlidir. Özellikle, yeniden programlama için her zaman olumsuz bir kontrol, yani yeniden programlama faktörünün ifade edilmediği bir koşul dahil etmek önemlidir. Örneğin, yeniden programlama faktörü ve bir muhabir (örneğin, yeşil floresan proteini (GFP), DsRed) için cDNA'yı taşıyan vektörler kullanıldığında, negatif kontrol yalnızca muhabiri taşıyan aynı vektörle temsil edilir. Farklı muhabirleri taşıyan birden fazla faktörü ifade ederken, olumsuz kontrol buna göre ayarlanmalıdır.

1. Kaplamadan sonraki gün, hücrelerin kapak kapaklarına yapıştığından emin olmak için 24 delikli plakaları inceleyin.
2. Deneysel amaca ve mevcut kaynaklara dayanarak, yeniden programlama faktörlerinin zorla ekspresyonu, viral transdüksiyon (bkz. adım 6.3) veya DNA transfeksiyonu (bkz. adım 6.4) ile sağlanabilir.
   NOT: Retrovirüs veya lentivirüs kullanımı devlet makamlarının onayını gerektirir ve güvenlik seviyesi 2 (SL2) olan bir laboratuvarda biyolojik bir güvenlik kabini altında yapılmalıdır.
3. Aşağıda açıklandığı gibi ilgilenilen yeniden programlama faktörünü (faktörlerini) ifade etmek için hücreleri genetik bilgiyi taşıyan retrovirüs veya lentivirüs ile dönüştürerek astrositleri yeniden programlayın.
   1. 1 x 10 10-1 x 10¹² partikül / mL'lik yüksek virüs titresine sahip hücreleri, hücre süspansiyonunun 1 μL'sini doğrudan astrosit ortamına ekleyerek dönüştürün. Bu, yüksek bir enfeksiyon oranı sağlar. Deneyin amacına bağlı olarak, bölüm 7 veya bölüm 8'e geçmeden önce viral parçacıklar içeren astrosit ortamına sahip hücreleri 24-36 saat boyunca 37 ° C'de kültürleyin.
      NOT: Transgenlerin ekspresyonunu yönlendirmek için farklı promotörler kullanılabilir (ayrıca bakınız Temsili Sonuçlar). Kurucu promotörler (örneğin, CMV, CAG), transgenin ekspresyonunu indüklenebilir promotörlerden daha erken indükler; Bununla birlikte, her iki promotör tipi de hücreleri nöronlara yeniden programlamak için başarıyla kullanılmıştır.
4. DNA plazmidleri, aşağıda açıklandığı gibi DNA transfeksiyonu yoluyla astrositlere de sokulabilir.
   NOT: Bu, SL1 için onaylanmış bir biyolojik güvenlik kabini altında yapılabilir.
   1. Transfeksiyondan önce, transfeksiyon reaktifini, istenen yapıların plazmid DNA'sını, taze astrosit ortamını ve serum indirgenmiş ortamı elde edin (bkz. 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunun 300 μL serum indirgenmiş ortam gerektirdiğini göz önünde bulundurarak gerekli serum azaltılmış ortam miktarını hesaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız). 50 mL'lik bir tüpe uygun miktarda serum indirgenmiş ortam ekleyin ve 37 ° C'ye ısıtın.
   2. Serumla indirgenmiş ortam sıcak olduğunda, astrosit ortamını tüm kuyucuklardan aspire edin ve 50 mL'lik bir tüpte toplayın. Ayrılmış hücreleri çıkarmak için toplanan astrosit ortamını 0,45 μM şırınga filtresiyle filtreleyin.
   3. Filtrelenmiş ortama eşit miktarda taze astrosit ortamı ekleyin ve kuyu başına 1 mL astrosit ortamı eklemek için yeterli bir çözelti elde edin. Astrosit şartlandırılmış ortamı inkübatörde kullanıma kadar 37 ° C'de tutun (adım 6.4.9).
      NOT: Kültür ortamı, kültürün yaşayabilirliğini destekleyen birkaç salgılanan faktör içerdiğinden yeniden kullanılır.
   4. Her bir oyuğa 300 μL önceden ısıtılmış serum azaltılmış ortam ekleyin ve 24 delikli plakayı inkübatöre geri yerleştirin.
   5. DNA ve serum indirgenmiş ortamdan oluşan A çözeltisini hazırlayın. Her kuyucuk için toplam 0.6 μg DNA kullanın ve 50 μL serum indirgenmiş ortama ekleyin. A çözeltisini kullanana kadar oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Tipik olarak, koşul başına teknik bir üçlü olarak kabul edilir. Bu nedenle, 24 delikli bir plakanın üç kuyuğunu transfekte etmek için yeterli materyali sağlamak için 3.5 reaksiyon için yeterli bir karışım hazırlanır (örneğin, 175 μL serum indirgenmiş ortamda seyreltilmiş toplam DNA'nın 2.1 μg'ı).
   6. Transfeksiyon reaktifi ve serum indirgenmiş ortamdan oluşan B çözeltisini hazırlayın. Her bir kuyucuk için, 50 μL serum indirgenmiş ortama 0.75 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin. Bu çözüm tüm transfeksiyon koşullarında ortak olduğundan, transfeksiyonlar arasındaki değişkenliği azaltmak için toplu olarak hazırlayın.
   7. B çözeltisini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. B çözeltisini A çözeltisine 1:1 oranında damla damla ekleyin ve hafifçe karıştırın. Girdap yapmayın. Kaputun altındaki oda sıcaklığında 20-30 dakika boyunca A + B çözeltisini inkübe edin.
   8. Tüm transfeksiyon koşulları için adım 6.4.5-6.4.7'yi yineleyin. 20-30 dakika sonra, 100 μL'lik son hacim için damla damla damla her kuyucuğa damla damla A + B çözeltisi ekleyin. plakayı hafifçe sallayın ve hücreleri 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübatöre geri yerleştirin.
   9. 4 saat sonra, transfeksiyon ortamını çıkarın ve adım 6.4.3'te hazırlanan önceden ısıtılmış astrosit şartlandırılmış ortamdan 1 mL ekleyin. Deneyin amacına bağlı olarak, bölüm 7 veya bölüm 8'e devam etmeden önce hücreleri 36-48 saat boyunca koruyun.

7. Astrositlerin yeniden programlanması (7 günlük analiz)

1. 49 mL temel kültür ortamına 1 mL B27 takviyesi ekleyerek nöronal farklılaşma ortamı hazırlayın (bkz. adım 1.4). 24-48 saat sonra, hücrelerin transdüke edilmiş veya transfekte edilmiş olmasına bağlı olarak (sırasıyla 6.3 ve 6.4. adımlara bakınız), astrosit ortamını kuyu başına 1 mL nöronal farklılaşma ortamı ve kültür hücrelerini 37 ° C'de ve% 9 CO₂ ile değiştirin.
   NOT: Hücreler,% 9 CO 2 inkübatörü mevcut değilse% 5 CO_2'de de tutulabilir. Bununla birlikte, nöronal yeniden programlama bu koşullar altında daha verimlidir.
2. İsteğe bağlı: Yeniden programlama verimliliğini artırmak için, astrosit ortamını farklılaşma ortamına değiştirirken nöronal farklılaşma ortamını Forskolin (30 μM'lik son konsantrasyon) ve Dorsomorfin (1 μM'lik son konsantrasyon) ile destekleyin. Hücreleri Forskolin ve Dorsomorfin ile tedavi etmeyi tercih ederken, ilk tedaviden 2 gün sonra ikinci bir doz Dorsomorfin sağlayın. Bu ikinci tedaviyi doğrudan kültür ortamına ekleyin.
3. Murin astrositlerinin nöronal hücrelere doğrudan yeniden programlanması normalde ortamı değiştirdikten sonraki 7 gün içinde gerçekleşir. Bu nedenle, nöronal yeniden programlamanın başlatılmasından 7 gün sonra, aşağı akış analizi için hücreleri düzeltin veya toplayın.

8. Astrositlerin olgun nöronlara yeniden programlanması (uzun süreli kültürler)

1. 49 mL temel kültür ortamına 1 mL B27 takviyesi ekleyerek nöronal farklılaşma ortamı hazırlayın (bkz. adım 1.4). 24-48 saat sonra, hücrelerin dönüştürülüp dönüştürülmediğine veya transfekte edilip edilmediğine bağlı olarak (sırasıyla 6.3 ve 6.4. adımlara bakınız), astrosit ortamını, kuyu başına Forskolin (30 μM'lik son konsantrasyon) ve Dorsomorfin (1 μM'lik son konsantrasyon) ve 37 ° C'de kültür hücreleri ve% 9 CO₂ ile desteklenmiş 1 mL nöronal farklılaşma ortamı ile değiştirin.
   NOT: Hücreler,% 9 CO 2 inkübatörü mevcut değilse% 5 CO_2'de de tutulabilir. Bununla birlikte, nöronal yeniden programlama bu koşullar altında daha verimlidir.
2. Dorsomorfin tedavisini ilk tedaviden 2 gün sonra doğrudan nöronal farklılaşma ortamına ekleyerek tekrarlayın.
3. Nöronal yeniden programlamanın başlamasından 7 gün sonra, 189.2 μL nöronal farklılaşma ortamına 6 μL N2, 1.2 μL NT3 (stok 20 μg / mL), 1.2 μL BDNF (stok 20 μg / mL), 1.2 μL GDNF (stok 20 μg / mL) ve 1.2 μL cAMP (stok 100 mM) ekleyerek olgunlaşma ortamını hazırlayın. Her bir kuyucukta 200 μL olgunlaşma ortamı bulunan nöronal farklılaşma ortamına ek olarak.
   NOT: Olgunlaşma ortamı sadece ilk tedavi için desteklenir. Sonraki tüm tedaviler, aşağıda açıklandığı gibi nöronal farklılaşma ortamının kısmen değiştirilmesiyle yapılır.
4. 200 μL nöronal farklılaşma ortamını çıkararak ve 6 haftaya kadar haftada iki kez 200 μL taze olgunlaşma ortamı ekleyerek tedaviyi küçük moleküllerle tekrarlayın. Olgunlaşma sırasında, elektrofizyolojik deneyler için hücreleri kullanın (tipik olarak, 21. günde veya daha sonra) veya aşağı akış analizi için sabitleyin (örneğin, immünofloresan).

Astrositlerin birincil kültürleri tipik olarak MAC sıralama ve kaplamadan 7 ila 10 gün sonra% 80 ila% 90 akıcılığa ulaşır (Şekil 1B). Genel olarak, tek bir T25 kültür şişesi yaklaşık 1-1.5 x 106 hücre verir, bu da hücreleri kuyu başına 5-5.5 x 104 hücre yoğunluğunda tohumlarken 20-30 örtü kayması için yeterlidir. Kaplamadan sonraki gün, hücreler tipik olarak örtü kayma yüzeyinin% 50-60'ını kaplar (Şekil 1C). Bu aşamada, kültürler neredeyse tamamen astrositlerden oluşurken, nöroblastlar gibi diğer hücre tipleri neredeyse yoktur (Şekil 1D)29.

Yeniden programlama faktörleri astrositlere retroviral veya lentiviral transdüksiyon veya DNA plazmidlerinin transfeksiyonu yoluyla iletilebilir. Genellikle, viral transdüksiyon, transfeksiyona kıyasla daha fazla hücreyi enfekte eder. Doğrudan nöronal dönüşüm önemli miktarda hücre ölümüne neden olduğundan34,35, analiz için hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için retroviral veya lentiviral transdüksiyon tercih edilir. Yeniden programlama faktörlerinin ifadesini kontrol etmek için farklı promotörler kullanılabilir: kurucu (örneğin, CMV, CAG)15,32, indüklenebilir (örneğin, Tet-duyarlı elemanlar, Tet-ON)21 veya hücre tipine özgü (örneğin, GFAP promotörü)36,37. Kurucu veya hücre tipine özgü promotörler kullanıldığında, astrositler, gen dağıtımından sonraki 24 saat içinde, floresan muhabir ekspresyonu (örneğin, GFP, DsRed) ile değerlendirilen transgenlerin tespit edilebilir seviyelerini ifade etmeye başlar ve her hücre diğerlerinden bağımsızdır. Tersine, indüklenebilir promotörler, transgenlerin ekspresyonunu, kültür ortamına küçük bir molekülün (örneğin, doksisiklin) eklenmesini takiben aktive edildiklerinden, dönüştürülen hücreler arasında senkronize etmeye izin verir. Transkripsiyon faktörlerinin saptanabilir seviyelerine genellikle promotörün aktivasyonundan 18-20 saat sonra ulaşılır. Çoğu durumda, yeniden programlama faktörü ekspresyonunun zirvesine yaklaşık 48 saatte ulaşılır, lentivirüs aracılı ekspresyon biraz daha uzun sürer.

Yeniden programlama faktörlerinin ekspresyonunu takiben transkripsiyonel değişiklikler 4 saat 32 gibi erken bir tarihte tespit edilebilirken,24 saat sonra ve daha sonra29,32 saat sonra sağlam değişiklikler meydana gelir. Morfolojik değişiklikler transkripsiyonel değişiklikleri takip eder ve ilk dönüşüm belirtileri transdüksiyon / transfeksiyondan yaklaşık 3 gün sonra gözlenebilir (3 DPT). 7 DPT'de, indüklenen nöronal hücreler astrositlerden açıkça ayırt edilebilir: soma'ları kontrol veya yeniden programlanmamış astrositlerden daha küçüktür, uzun süreçlere sahiptirler ve nöronal belirteç βIII-küvet için pozitiftirler ve astrosit belirteci GFAP için negatiftirler (Şekil 1E). Bununla birlikte, bazı hücrelerin hem GFAP hem de βIII-küvet için pozitif olabileceğini, nöronal programın indüklendiğini, ancak astrosit kimliğinin inhibe edilmediğini veya astrosit kimliğinin baskılandığını ancak nöronal kaskadın indüksiyonunun olmadığını gösteren her iki belirteç için de negatif olabileceğini belirtmek gerekir. Her iki durumda da, hücreler genellikle bir astrosit morfolojisini korur.

Elektrofizyoloji veya üretilen nöronal alt tiplerin değerlendirilmesi gibi daha fonksiyonel analizler için, kültürler genellikle en az 21 DPT için tutulur ve olgunlaşma ortamı ile muamele edilir. 21 DPT'de, birçok indüklenmiş nöron aksiyon potansiyellerini ateşleyebilir ve olgun nöronal belirteç NeuN'nin yanı sıra pan-sinaptik protein Sinaptofizin29 için pozitiftir (Şekil 1F).

Şekil 1: Astrosit kültürüne genel bakış ve yeniden programlama . (A)Astrosit-nörona doğrudan dönüşümün zaman çizelgesi. Her siyah çizgi protokolde önemli bir adımı temsil eder. (B) Kültürde 7 gün sonra kültürlü omurilik kaynaklı astrositlerin temsili parlak alan görüntüleri. Resimler parlak alan mikroskobu ve 10x objektif kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. (C) 24 kuyucuklu bir plakada kuyu başına 5.5 x 104 hücre yoğunluğunda yeniden kaplandıktan 1 gün sonra omurilik astrositlerinin temsili parlak alan görüntüleri. Görüntüler parlak alan mikroskobu ve 10x objektif kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu 100 μm. (D) Kültür saflığını göstermek için kaplamadan 1 gün sonra sabitlenen astrositler üzerinde βIII-küvet, Sox9, GFAP üçlü boyama immünofloresan görüntüsü. Hücreler 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitlendi ve 1x PBS ile iki kez yıkandı. Hücreler 1x PBS çözeltisinde %3 BSA, %0.5 Triton-X 100 kullanılarak bloke edildi. Primer antikorlar, bloke edici çözeltide uygun konsantrasyonda (örneğin, anti-GFAP 1:250; anti-βIII-küvet 1:250; anti-Syp1 1:500) seyreltildi ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi. Hücreler 1x PBS ile üç kez yıkandı ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca florofor konjuge sekonjuge sekonder antikorlarla inkübe edildi. Kapak kapakları, Aqua Poly/Mount ile monte edilmeden önce 1x PBS ile üç kez yıkandı. Görüntüler bir epifloresan mikroskobu ve 40x objektif kullanılarak elde edildi. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. (E) Bir βIII küvetinin immünofloresan görüntüsü, 7 DPT'den sonra Ascl1 ile astrositin nörona dönüşümünü göstermek için DsRed çift boyaması. Ölçek çubuğu 20 μm. (F) Bir βIII-tub, DsRed, Sinaptofizin 1 (Syp1) üçlü boyamasının immünofloresan görüntüleri, Ascl1 ile yeniden programlamanın 21 DPT'sinden sonra nöronal olgunluğu göstermek için. İmmünofloresan ve görüntü elde etme protokolü yukarıda tarif edildiği gibi idi. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.