Yöntem makalesi

Western Blotting Kullanarak Nöronal K-Cl Co-Transporter KCC2'nin Fonksiyonlarının ve Aktivitelerinin İncelenmesi

DOI:

10.3791/64179

⸱

9 Aralık 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, nöronal K-Cl ko-transporter KCC2'nin fonksiyonlarını ve aktivitelerini incelemek için batı blotlama tekniğinin uygulanmasını vurgulamaktadır. Protokol, kinaz düzenleyici bölgeler Thr906/1007'de batı lekelenmesi yoluyla KCC2 fosforilasyonunun araştırılmasını açıklamaktadır. Ayrıca, KCC2 etkinliğini doğrulamak için ek yöntemler bu metinde kısaca vurgulanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potasyum klorür kotransporterleri 2 (KCC2), sadece nöronda bulunan katyon-klorür-kotransporterlerin (CCC'ler) çözünen taşıyıcı ailesi 12'nin (SLC12) bir üyesidir ve Cl-homeostazın düzgün çalışması ve sonuç olarak fonksiyonel GABAerjik inhibisyon için gereklidir. KCC2'nin uygun şekilde düzenlenmesindeki başarısızlık zararlıdır ve epilepsi de dahil olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların prevalansı ile ilişkilendirilmiştir. Araştırmacıların işlevlerini ve faaliyetlerini incelemelerini sağlayan tekniklerin geliştirilmesine akredite edilmiş KCC2'nin düzenlenmesinde yer alan mekanizmaların anlaşılması konusunda önemli ilerlemeler kaydedilmiştir; doğrudan (kinaz düzenleyici bölgelerin fosforilasyonunu değerlendirmek) veya dolaylı (GABA aktivitesini gözlemlemek ve izlemek) araştırmalar yoluyla . Burada protokol, kinaz düzenleyici bölgelerde (Thr906 ve Thr1007) KCC2 fosforilasyonunun batı lekelenme tekniğini kullanarak nasıl araştırılacağını vurgulamaktadır. Rubidyum iyonu ve talyum iyonu alım testi gibi KCC2 aktivitesini doğrudan ölçmek için kullanılan başka klasik yöntemler de vardır. GABA aktivitesini ölçmek için yama-kelepçe-elektrofizyoloji gibi diğer teknikler kullanılır; Bu nedenle, hücre içi klorür iyonu homeostazının değerlendirilmesi ile bilgilendirildiği gibi dolaylı olarak aktif ve / veya inaktive edilmiş KCC2'yi yansıtmaktadır. Bu ek tekniklerden birkaçı bu makalede kısaca tartışılacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potasyum klorür kotransporterleri 2 (KCC2), sadece nöronda bulunan katyon-klorür-kotransporterlerin (CCC'ler) çözünen taşıyıcı ailesi 12'nin (SLC12) bir üyesidir ve Cl-homeostazın düzgün çalışması ve sonuç olarak fonksiyonel GABAerjik inhibisyon 1,2,3,4 için gereklidir. KCC2 ile 4-6 mM'de düşük intranöronal Cl-konsantrasyonunun ([Cl-]i) korunması, beyin ve omurilikte γ-aminobütirik asit (GABA) / glisin hiperpolarizasyonunu ve sinaptik inhibisyonunu kolaylaştırır5. KCC2'nin uygun şekilde düzenlenmesindeki başarısızlık, epilepsi4 de dahil olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların prevalansı ile ilişkilendirilmiştir. Ayrıca, azalmış KCC2 aracılı Cl− ekstrüzyon ve bozulmuş hiperpolarize edici GABAA ve / veya glisin reseptörü aracılı akımlar epilepsi, nöropatik ağrı ve spastisite 6,7 ile ilişkilendirilmiştir. Nöronal KCC2, C-terminali hücre içi etki alanındaki anahtar düzenleyici kalıntıların, lizinsiz (WNK)-STE20 / SPS1 ile ilişkili prolin / alanin bakımından zengin (SPAK) / Oksidatif strese duyarlı (OSR) kinaz sinyal kompleksi1 tarafından fosforilasyonu yoluyla negatif olarak modüle edilir ve bu da olgunlaşmamış nöronlarda depolarize GABA aktivitesinin korunmasını kolaylaştırır 2,8,9 . WNK-SPAK / OSR1, treonin kalıntıları 906 ve 1007'yi (Thr906 / Thr1007) fosforile eder ve daha sonra KCC2'nin mRNA gen ekspresyonunu aşağı regüle eder ve bunun sonucunda fizyolojik fonksiyonundabozulmaya yol açar 8,10. Bununla birlikte, daha da önemlisi, WNK-SPAK / OSR1 kinaz kompleksinin KCC2 ekspresyonu 1,2,4,11,12'yi fosforile ettiği ve inhibe ettiği ve Thr906 / Thr1007'yi fosforile etmek için kinaz kompleksi sinyal yollarının inhibisyonunun KCC2 mRNA geninin artan ekspresyonu ile bağlantılı olduğu zaten bir gerçektir13,14,15 . Nöronal KCC2 ve Na+-K+-2Cl- kotransporters 1 (NKCC1) ekspresyonunun protein fosforilasyonu yoluyla düzenlenmesinin eşzamanlı ve ters paternlerde1,4,16 olarak çalıştığını belirtmek önemlidir.

Araştırmacıların işlevlerini ve faaliyetlerini incelemelerini sağlayan tekniklerin geliştirilmesine akredite edilmiş KCC2'nin düzenlenmesinde yer alan mekanizmaların anlaşılması konusunda tutarlı ve önemli ilerlemeler kaydedilmiştir; doğrudan (kinaz düzenleyici bölgelerin fosforilasyonunu değerlendirmek) veya dolaylı (GABA aktivitesini gözlemlemek ve izlemek) araştırmalar yoluyla . Burada sunulan protokol, kinaz düzenleyici bölgeler Thr906/1007'de kotransporterin fosforilasyonunu araştırarak nöronal K + -Cl - ko-transporter KCC2'nin fonksiyonlarını ve aktivitelerini incelemek için batı lekeleme tekniklerinin uygulanmasını vurgulamaktadır.

Western blot, bir doku veya hücre örneğinden ilgilenilen spesifik proteinleri tespit etmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem önce proteinleri elektroforez yoluyla boyutlarına göre ayırır. Proteinler daha sonra, hedef protein spesifik bir antikor kullanılarak işaretlenmeden önce elektroforetik olarak katı bir desteğe (genellikle bir zar) aktarılır. Antikorlar, kolorimetrik, kemilüminesans veya floresan yöntemleri kullanılarak tespit edilen farklı etiketlere veya florofor konjuge antikorlara konjuge edilir. Bu, belirli bir hedef proteinin bir protein karışımından tespit edilmesini sağlar. Bu teknik, KCCs1'in fosfospesifik bölgelerini karakterize etmek için kullanılmıştır ve KCC3 Thr991 / Thr1048 fosforilasyon17'yi inhibe eden kinaz inhibitörlerini tanımlamak için kullanılmıştır. Bu protokolü izleyerek, hücre / doku lizatlarından toplam ve fosforile KCC2'yi spesifik olarak tespit edebilirsiniz. Prensip olarak, protein konjuge antikorların bu teknikle tespiti, fizyolojik düzenlemelerinde yer alan moleküler mekanizmalara ışık tutan KCC2'nin fosfo-bölgelerindeki işbirlikçi faaliyetlerin anlaşılmasını geliştirmeye yardımcı olduğu için oldukça etkilidir. Toplam protein ekspresyonunun kantitatif analizi, KCC2'nin işlevini ve aktivitesini temsil eder. Rubidyum iyonu ve talyum iyonu alım testi gibi KCC2 aktivitesini doğrudan ölçmek için kullanılan başka klasik yöntemler de vardır. GABA aktivitesini ölçmek için yama-kelepçe-elektrofizyoloji gibi diğer teknikler kullanılır; Bu nedenle, hücre içi klorür iyonu homeostazının değerlendirilmesi ile bilgilendirildiği gibi dolaylı olarak aktif ve / veya inaktive edilmiş KCC2'yi yansıtmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Protokol, ilgilenilen spesifik proteinleri tespit etmek için batı lekeleme yöntemini açıklar.

1. Hücre kültürü ve transfeksiyon

  1. Hücre kültürü prosedüründen önce boncuk banyosundaki (37 ° C) tüm reaktifleri ısıtın. % 10 fetal sığır serumu,% 1 2mM L-glutamin, 100x esansiyel olmayan amino asit, 100 mM sodyum piruvat ve 100 birim / mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş kültür ortamı olan Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) hazırlayın.
  2. Çözülebilir transfekte sıçan KCC2b insan embriyonik böbrek 293 hücre (HEK293rnKCC2b)18 tamamen boncuk banyosunda (37 ° C). Hücreleri kriyoviyal tüpten 5 mL taze ortam içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreyi 3-5 dakika boyunca 1200 ×g'de döndürün.
  3. Süpernatantı aspire etmek için bir aspiratör pipeti (vakum pompasına sabitlenmiş) kullanın ve hücreleri yeniden askıya almak için 10 mL taze ortam ekleyin. Hücre süspansiyonunu 10 cm'lik bir çanak tabağa aktarın.
  4. Çanağı inkübatöre yerleştirin ve nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 48 saat büyümesine izin verin. Sağlıklı hücre büyümesini sağlamak için kuluçka süresini izleyin. Ayrıca, kuluçka döneminden sonra% 90'ın üzerinde birleşme elde ettiklerinde hücreleri bölün.
  5. Eski ortamı hücre çanağından aspire edin ve hücreleri 2 mL fosfat tampon salin (PBS) ile nazikçe durulayın. 2 mL tripsin ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık 1-2 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. Tripsinize hücreleri tabakta nazikçe yıkamak için 2 mL komple ortam kullanın. Yeni yemeklere 9 mL taze medya ekleyin ve eski yemekten yenilerinin her birine 1 mL çözelti ekleyin. Bölünmüş hücre kaplarını% 90'lık ≥ akıcılık elde etmek için 48 saat boyunca inkübatöre geri aktarın.
  7. Hücreleri lizis tamponunda toplamadan önce hücreleri kontrol olarak dimetil sülfoksit (DMSO), 8 μM staurosporin veya 0.5 mM N-etilmaleimid (NEM) ile 15 dakika boyunca tedavi edin.

2. Hücre lizatlarının hazırlanması ve numunelerin yüklenmesi

  1. Kültür çanağındaki medyayı aspire edin (transfeksiyon prosedürlerinden). Hücre kültürünü buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
  2. PBS'yi aspire edin, ardından 50 mM tris-HCl (pH 7.5), 1 mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N,N,N′,N′-tetraasetik asit (EGTA), 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 50 mM sodyum florür, 5 mM sodyum pirofosfat, 10 mM sodyum-β-gliserofosfat, 1 mM sodyum ortovanadat,% 1 (w/v) Triton X-100, 0.27 M sakkaroz, içeren 1.0 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin, Yemeğe 1 mM benzamin,% 0.1 (v / v) 2-merkaptoetanol ve 2 mM fenilmetilsülfonilflorür (PMSF).
    NOT: Hücre hasadı sırasında lizis tamponunun hacmi, çanak boyutlarına göre değişir, örneğin, 1 x 107 hücre/100 mm çanak/150 cm2 şişe başına 1 mL lizis tamponu uygunken, 5 x 10 6 hücre/60 mm çanak/75cm2 şişe başına 0,5 mL uygundur.
  3. Hücreleri kabın altından kazımak için soğuk bir plastik hücre kazıyıcı kullanın, ardından hücre süspansiyonunu zaten buz üzerinde bulunan bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için yavaşça bir pipet kullanın. Tüpü 4 ° C'de 30 dakika boyunca sürekli çalkalayın.
  4. Hücre lizatlarını 20 dakika boyunca 16.000 x g'da soğuk bir santrifüjde (4 ° C) döndürün, tüpü santrifüjden yavaşça çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Süpernatantı önceden soğutulmuş taze bir tüpe toplayın ve peleti atın.
    NOT: Hücre tipine bağlı olarak santrifüjleme kuvvetini ve süresini değiştirmek gerekebilir. Bununla birlikte, genel kurallar 20 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüjlemeyi teşvik eder. Ancak, bu her deney için belirlenmelidir. Örneğin, lökositler gibi hassas hücrelerin çok hafif bir santrifüj hızına ihtiyacı vardır.

3. İmmünopreçökitanların hücre lizatlarından hazırlanması

  1. Pipet 300 μL protein-G-sefaroz bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilir. Çözeltiyi 2 dakika boyunca 500 x g'da döndürün ve süpernatanı atın.
  2. 500 μL PBS ekleyin ve çözeltiyi iyice vorteksleyin. Çözeltiyi 2 dakika boyunca 500 x g'da döndürün ve süpernatanı atın. Bu adımı tekrarlayın.
  3. 1 mg anti-KCC2 Thr906 ve anti-KCC2 Thr1007 antikorlarını 200 μL protein G-sefaroz boncukları ile karıştırın ve PBS ile 500 μL'ye kadar olan hacmi oluşturun. Titreşimli bir platformda veya dönen tekerlekte 4 °C'de 2 saat boyunca çalkalayın. PBS ile 2 kat yıkayın.
  4. Tüm hücre lizatları üzerinde protein miktarı ölçümü yapın ve yıkanmış boncuklara 1 mg hücre lizatı ekleyin. Uçtan uca bir rotatörde 4 °C'de 2 saat boyunca nazikçe inkübe edin. Boncukları döndürün ve 150 mM sodyum klorür (NaCl) içeren PBS ile 3 kat yıkayın.
  5. İmmünopreseptitanları (boncukları) 200 μL PBS ile 3 kat yıkayın. Son peleti 100 μL 1x lityum dodesil sülfat (LDS) numune tamponunda yeniden askıya alın.
  6. Tüpleri oda sıcaklığında bir rotor çalkalayıcıda 5 dakika çalkalayın ve 10 dakika boyunca 75 ° C'de bir ısıtma bloğunda inkübe edin. Yükleme numunesini 2 dakika boyunca 11.000 x g'de santrifüj edin ve jel yükleme için süpernatantı kullanın.

4. Batı lekesini gerçekleştirmek

  1. Döküm aparatını monte edin ve taze hazırlanmış% 8 ayırma jeli dökün (tarif/hazırlık için Tablo 1'e bakınız), jeli döküm camının üstünden yaklaşık 2 cm alana izin verecek şekilde dökün. Kuruluma 200 μL mutlak izopropanol ekleyin ve 60 dakika boyunca oda sıcaklığında durmasına izin verin.
    NOT: Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için poliakrilamid jel tarifi, ilgilenilen proteinin boyutuna bağlıdır (Tablo 2). Bu nedenle, istenen jel yüzdesini belirlemeden önce protein boyutunu not edin.
  2. İzopropanolü çıkarmak için bir pipet kullanın ve jeli yaklaşık 200 μL damıtılmış su ile dikkatlice durulayın. Döküm kurulumundaki yaklaşık 2 cm'lik alanı doldurmak için taze hazırlanmış% 6 istifleme jeli ekleyin (tarif/hazırlık için Tablo 1'e bakınız). Kuyu tarağına yavaşça oturtun ve 30 dakika oda sıcaklığında bekletin.
  3. Döküm jeli elektroforez tankına sabitleyin.
  4. 10x transfer tamponu hazırlamak için 30.3 g Tris bazı, 144.1 g glisin ve 10 g SDS'yi 1000 mL damıtılmış suda çözün. 890 mL damıtılmış suya 10 mL %10 SDS ve 100 mL 10x transfer tamponu ekleyerek 1x çalışan tampon hazırlayın.
  5. Tankın içine 1x çalışan tampon dökün. İlk kuyucuğa 5 μL moleküler ağırlık işaretleyicisi ve SDS-PAGE jelinin her bir kuyucuğuna eşit miktarda protein yükleyin (kullanılan tarak boyutuna bağlı olarak 18-30 μL arasında). Boş kuyucukları 1x LDS ile doldurun ve jeli 120 V'ta yaklaşık 90-120 dakika çalıştırın.
  6. 10x transfer tamponu hazırlamak için 58.2 g Tris baz ve 29.3 g glisini 1000 mL damıtılmış suda çözün. Nitroselüloz membranı% 20 metanol içeren 1x transfer tamponu ile aktive edin. Jeli ve membranı transfer tamponu ile durulayın ve bunları hazırlama yığınına yavaşça yayın.
    NOT: Çalışan tamponların pH'ını ayarlamaya gerek yoktur, çünkü gereken optimum pH'ta olmaları gerekir. Ayrıca, zamandan tasarruf etmek için bu tamponların hazırlanması ve deneyden önce oda sıcaklığında saklanması önerilir.
  7. Aktarılacak sandviçi şu sırayla düzenleyin: negatif elektrot (siyah çerçeve / uç) - sandviç köpüğü - filtre kağıdı - durulanmış SDS-PAGE jel - durulanmış nitroselüloz membran - filtre kağıdı - sandviç köpüğü - pozitif elektrot (kırmızı çerçeve). Birleştirilmiş sandviçi transfer tankına istifleyin ve 90 dakika boyunca 90 V'ta veya 360 dakika boyunca 30 V'ta çalıştırın.

5. Antikor boyama ve görüntü geliştirme

  1. Membranı çıkarın ve kurumasını bekleyin. %0,1 1x Tween 20 (1x TBS-T) içeren Tris tamponlu salin içinde %5 yağsız sütten yapılmış bir blokaj tamponu kullanarak membranı oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edin.
  2. Membranları, oda sıcaklığında 1 saat boyunca veya 4 °C'de gece boyunca bloke edici tamponda uygun primer antikor 8,15,19 ve beta-aktin (yükleme kontrolü) seyreltilmeleri ile inkübe edin. Membranı, her biri 5 dakika boyunca 1x TBS-T'lik üç yıkamada yıkayın.
    NOT: Ayrı membranın beta-aktin, alfa-tübülin veya gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz antikorları gibi yükleme kontrolleri ile inkübasyonu, sonraki niceleme sırasında diğer batı lekelenme sonuçlarını normalleştirmektir. Her birincil antikor için önerilen seyreltme, üreticinin el kitabında mevcuttur.
  3. Yıkanmış membranı, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca bloke edici tamponda 5000 kat seyreltilmiş sekonder antikor ile inkübe edin. Yine, membranı her biri 5 dakika boyunca 1x TBS-T'de 3x yıkayın.
    NOT: Sekonder antikorun, primer antikorun yükseldiği türlere karşı yükseltilmesi şiddetle tavsiye edilir. Örneğin, toplam KCC2'nin birincil antikoru fare anti-KCC2 ise, anti-fare için ikincil antikor kullanılmalıdır.
  4. Yıkanmış zarı görüntüleme kartına yerleştirin. Her bir gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktifinin eşit hacimlerini karıştırın ve sinyaller geliştirmek için karışık çözeltiyi membran üzerine yavaşça yayın.

6. Bir görüntüleme sistemi kullanarak görüntü toplama ve veri ölçümü

  1. Görüntüleme kartını, görüntüleme için görüntüleme sistemindeki uygun bölmeye aktarın. Görüntü işleme için bilgisayardaki görüntüleme yazılımını açın.
  2. Araç çubuğunda, Yeni Protokol'ü tıklatın ve Tek Kanal'ı seçin. Jel görüntüleme/uygulama iletişim kutusu altında Seç'i tıklatın, Leke'ye gidin ve Chemi Hi Sensitivity veya Chemi Hi Resolution seçeneklerinden birini seçin. Ardından, elde edilecek görüntülerin süresini ve sayısını ayarlamak için Sinyal Biriktirme Kurulumu'na tıklayın.
  3. Protokol kurulumu altında Konum Jeli'ne tıklayın ve gerekirse jeli görüntüleme sisteminde ayarlayın. Görüntüleri almak için Protokolü Çalıştır'ı tıklatın.
  4. Görüntüleri bilgisayara kaydetmek için görüntüleme kataloğu kutusunun altındaki alınan görüntülerden birine sağ tıklayın. İstediğiniz görüntüye gidin ve Çalıştır iletişim kutusunun altındaki Görüntü Seç ve Devam Et'e tıklayın.
  5. Görüntünün kontrastını ve piksel doygunluğunu ayarlamak için Görüntü Dönüştürme simgesine tıklayın. İstediğiniz görüntü formatına bağlı olarak görüntüyü bilgisayara kaydetmek için genel araç çubuğundaki Ekran Görüntüsü simgesine tıklayın.
  6. ImageJ yazılımını kullanarak bant yoğunluklarını ölçün ve uygun istatistiksel araçları kullanarak analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Şekil 1'de sunulan temsili sonuç, batı lekeleme tekniğini kullanarak KCC2b'yi (HEK rnKCC2b)18 kararlı bir şekilde eksprese eden HEK293 hücre hatlarında KCC2 veNKCC1'in WNK-SPAK / OSR1 aracılı fosforilasyonu üzerine staurosporin ve NEM'in etkisini araştırmıştır. Temsili sonuçlarla ilgili kapsamlı ayrıntılar Zhang ve ark.15'te tartışılmaktadır. NEM'e benzer şekilde, staurosporin, KCC2 taşıma aktivitesini artırabilen ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KCC2 de dahil olmak üzere nöronlarda eksprese edilen CCC'lerin SLC12 aktivitelerini ölçmek için birçok yöntem kullanılmıştır. Bu tekniklerin birçoğunun, bu taşıyıcıların fonksiyonel ilgisinin analizi ve hastalıkla ilgili farklı mutasyonlardaki yapı-fonksiyon paternleri hakkında bilimsel bilgiyi arttırdığı kanıtlanmıştır. Kritik olarak, çeşitli yöntemlerin avantajları ve uyarıları vardır21. Bununla birlikte, yukarıda açıklanan protokol, KCC2'nin işlevlerini ve faaliyetlerini incelemede yardımcı ola...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma The Royal Society UK (Hibe no. IEC\NSFC\201094) ve Commonwealth Ph.D. Bursu tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 40 akrilamidSigma-AldrichA2917SDS-PAGE için ayırma ve istifleme jeli yapmak için kullanılır 
Amonyum Per SülfatSigma-Aldrich248614SDS-PAGE için ayırma ve istifleme jeli yapmak için kullanılır.
anti pSPAKDundee ÜniversitesiS670Biçin birincil antikor olarak kullanılır
Dundee ÜniversitesiS700Cbirincil antikor olarak kullanılır
pSer940 ThermoFisher ScientificPA5-95678
için birincil antikor olarak kullanılırBatı lekeleme
anti-KCC2 pThr906Dundee ÜniversitesiS959Cbirincil antikor olarak kullanılır
Hücre Sinyalleme teknolojisi66002için ikincil antikor olarak kullanılır
Dundee ÜniversitesiS841Biçin birincil antikor olarak kullanılır
Dundee ÜniversitesiS763Bbirincil antikor olarak kullanılır
Hücre Sinyalleme teknolojisiC29F4için ikincil antikor olarak kullanılır
için ikincil antikor olarak kullanılır
Dundee ÜniversitesiS669DBatı lekeleme
için birincil antikor olarak kullanılıranti-β-Tubulin IIISigma-AldrichT8578Batı lekelemesi için birincil antikor olarak kullanılır
BenzamineMerck UK135828Lizis tamponunun bileşeni olarak kullanılır
Beta-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148Yükleme tamponu ve lizis tamponunun bileşeni olarak kullanılır
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209Lizat proteini miktar tayini için kullanılır
Döküm aparatıAtto WSE-1165WSDS-sayfa elektroforezini çalıştırmak için kullanılır
SantrifüjEppendorf5804Lizat hazırlamada kullanılır
SantrifüjVWRMicroStar 17RNumuneleri eğirmek için kullanılır
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLHücre kültürü deneyi için kullanılır
Kurutulmuş Yağsız SütMarvelN/AEngelleme yapmak için kullanılır tampon
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium - yüksek glikozSigma-AldrichD6429Hücre kültürü için kullanılır
ECL reaktifiPerkin ElmerORTT755/2655Western blotting için görüntü geliştirmek için kullanılır
EDTAFisher ScientificD/0700/53Lizis tamponunun bileşeni olarak kullanılır
EGTASigma-Aldriche4378Lizis bileşeni olarak kullanılır tampon
Elektroforez Güç KaynağıBioRadPowerPAC HCSDS-sayfa elektroforezini çalıştırmak için güç sağlamak için
EtanolThermoFisherE/0650DF/17Sterilize edilmiş ekipman ve ortamın hazırlanmasında kullanılır
Fetal Sığır Serumu -  ısı inaktive edilmişMerck Yaşam Bilimleri İngiltereF9665Hücre kültürü için kullanılır
Duman YürüteçA7277Hücre kültürü için kullanılır
Jel Lekeleme - WhatmanGE Healthcare 10426981Batı böplemede transfer sandviçi yapmak için kullanılır
GlisinSigma-Aldrich15527Tampon yapmak için kullanılır
GraphPad Prizma YazılımıGraphPad Software, Inc., ABDSürüm 6.0Grafikleri çizmek ve batı lekeleme HCl
Acros Organics10647282SDS-PAGE  için ayırma ve istifleme jeli yapmak için kullanılır;
Isıtma bloğuGrantQBT1WB yükleme örneklerini ısıtmak için kullanılır
HEK293 hücreleriMerck UK12022001-1VLKültür deneyi için hücre hattı
ImageJ YazılımıWayne Rasband ve Katkıda Bulunanlar; NIH, ABD ImageJ 1.53eBatı lekeleme görüntülerinden bant yoğunluklarını ölçmek için kullanılır
Görüntüleme sistemiBioRadChemiDoc MPBatı lekeleme görüntüleri çekmek için kullanılır
İnkübatörLEECLEEC hassas 190DHücre kültürü için kullanılır
İzopropanolHoneywell24137Elektroforez için döküm jelinde kullanılır
L-glutamin çözeltisiSigma-AldrichG7513Hücre kültürü için kullanılır
Lityum dodesil sülfat (LDS)NovexNP0008Batı lekeleme için yükleme tamponu olarak kullanılır
MEM Esansiyel olmayan amino asit Merck Yaşam Bilimleri UKM7145Hücre kültürü için kullanılır
MikrosantrifüjEppendorf5418WB için lizat hazırlamak için kullanılır Mikroplaka
okuyucuBioRadiMarkLizat protein konsantrasyonu okuması için kullanılır
Microsoft PowerpointMicrosoft, ABDPowerPoint2016Batı lekeleme görüntülerini düzenlemek için kullanılır
Moleküler Ağırlık İşaretleyiciBioRad1610373Batı kurutma için kullanılır
N-etilmaleimidThermo Fisher Scientific23030Hücre kültürü deneyi için kullanılır
Nitroselüloz membranFisher Scientific45004091Batı kurutma için kullanılır
Penisilin-StreptomisinGibco15140122Hücre kültürü için kullanılır
pH MetreMettler ToledoYedi kompakt s210Tampon çözeltilerinin pH'ını izlemek için kullanılır
Fenilmetilsülfonilflorür (PMSF)Sigma-AldrichP7626Lizis tamponunun bileşeni olarak kullanılır
Fosfat Tamponu SalinSigma-AldrichD8537Hücre kültürü PKC ve delta için kullanılır
; pThr505Hücre Sinyalizasyon teknolojisi9374Western blotting için birincil antikor olarak kullanılır
Sefaroz Protein GGeneronPG50-00-0002İmmünopresipitasyon için kullanılır
Sodyum klorürSigma-AldrichS7653Yıkama tamponunun bileşeni olarak kullanılır
Sodyum KlorürSigma-AldrichS7653TBS-T tamponu hazırlamak için kullanılır
Sodyum Dodesil SülfatSigma-AldrichL5750SDS-PAGE  için ayırma ve istifleme jeli yapmak için kullanılır;
sodyum ortovanadatSigma-AldrichS6508Lizis tamponunun bileşeni olarak kullanılır
Sodyum PirüvatSigma-AldrichS8636Hücre kültürü
sodyum-β-gliserofosfatiçin kullanılır Merck UKG9422Lizis tamponunun bileşeni olarak kullanılır
Staurosporin (Streptomyces sp.'den)Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri, İngiltereS4400-1MGHücre kültürü deneyi için kullanılır
SucroseScientifc Laboratuvar MalzemeleriS0389Lizis tamponunun bileşeni olarak kullanılır
TEMEDSigma-AldrichT7024SDS-PAGE  için ayırma ve istifleme jeli yapmak için kullanılır;
Transfer OdasıBioRad1658005EDUprotein aktarmak için western blotlamada kullanılır
SDS-PAGE  için ayırma ve istifleme jeli yapmak için kullanılır;
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Lizis tamponunun bileşeni olarak kullanılır
Tripsin-EDTA ÇözeltisiMerck Yaşam Bilimleri İngiltereT4049Hücre kültürü için kullanılır
Tween-20Sigma-AldrichP3179TBS-T tamponu yapmak için kullanılır
Vakum pompasıCharles AustenDymax 5Hücre kültürü için kullanılır
VorteksBilimsel EndüstrilerK-550-GENumune hazırlamada kullanılan
Vorteks karıştırıcıScientific Industries LtdVortex-Genie  K-550-GEÇözülmüş numuneyi karıştırmak için kullanılır
Su banyosu GrantInstruments Ltd. (JB Academy)JBA5Çözeltileri inkübe etmek için kullanılır
Batı lekeleme anti-KCC2 Batı lekeleme anti-KCC2 için Batı lekeleme anti-KCC2 pThr1007 Dundee Üniversitesi S961C için birincil antikor olarak kullanılır Batı lekeleme anti-fare için Batı lekeleme anti-NKCC1 Batı blotlama anti-NKCC1 pThr203 / 207/212 Batı lekeleme anti-tavşan için Batı lekeleme anti-koyun abcam ab6900 Batı lekeleme anti-SPAK için verileri analiz etmek için kullanılır Membran Tris Sigma-Aldrich T6066 üzerinde

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776(2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142(2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65(2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78(2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967(2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3(2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986(2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820(2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429(2012).
  28. Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992(2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255(2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032(2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10(2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

KCC2 FunctionNeuronal KCC2Western BlottingKCC2 PhosphorylationChloride HomeostasisGABAergic InhibitionProtein QuantificationHEK293 CellsKinase Regulatory SitesProtein Kinase C

İlgili makaleler