Klasik olarak, fare embriyonik kapak primordiyumunun endokardiyumu transversal, koronal veya sagital kesitler kullanılarak analiz edilmiştir. Valvulojenik bölgelerde endokardın en yüzlü, iki boyutlu görüntülenmesi için yeni yaklaşımımız, kapak gelişimi sırasında endokardın düzlemsel polarite ve hücre yeniden düzenleme analizine izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
En Yüz Fare Embriyolarında Düzlemsel Morfogenez Analizi için Endokardiyal Minderin Hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Memeli kalbinin gelişiminin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların incelenmesi, insan konjenital kalp hastalığını ele almak için esastır. İlkel kalp kapakçıklarının gelişimi, lokal endüktif miyokard ve endokardiyal sinyallere yanıt olarak endikonitriyal hücrelerin atriyoventriküler kanal (AVC) ve kalbin çıkış yolu (OFT) bölgelerinden epitel-mezenkimal geçişini (EMT) içerir. Hücreler delaminasyona girdiğinde ve endokard ile miyokard arasında bulunan hücre dışı matriksi (kardiyak jöle) istila ettiğinde, ilkel endokardiyal yastıklar (EC) oluşur. Bu işlem, endokardın delamine edilmiş hücreler tarafından bırakılan boşlukları doldurması ve bir eksen boyunca yakınsamak (daralmak) veya uzatmak (uzatmak) için kendini yeniden organize etmesi gerektiği anlamına gelir. Mevcut araştırmalar, bu süreçte yer alan faktörlerin hücre altı lokalizasyonunu düzenlemede düzlemsel hücre polaritesi (PCP) yolunu etkilemiştir. Klasik olarak, kalp kapağı gelişiminin ilk aşamaları, embriyonik kalplerin kesitlerinde veya kollajen jelleri üzerinde kültürlenmiş ex vivo AVC veya OFT eksplantlarında incelenmiştir. Bu yaklaşımlar apiko-bazal polaritenin analizine izin verir, ancak epitel düzlemindeki hücre davranışının veya göç eden hücrelerin morfolojik değişikliklerinin analizine izin vermez. Burada, valvulojenik bölgelerdeki endokardın hücrelerin düzlemsel bir alanı olarak görselleştirilmesini sağlayan deneysel bir yaklaşım sunuyoruz. Bu deneysel yaklaşım, valf gelişimi sırasında OFT ve AVC'nin endokardiyumunda PCP, düzlemsel topoloji ve hücreler arası iletişimi inceleme fırsatı sunar. Kardiyak kapak morfogenezinde rol oynayan yeni hücresel mekanizmaların deşifre edilmesi, endokardiyal yastık defekti ile ilişkili konjenital kalp hastalığının anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Giriş
Kalp, bir memeli embriyosunun ilk fonksiyonel organıdır. Farelerde embriyonik gün (E) 7.5 civarında, bilateral prekardiyak mezoderm hücreleri ventral taraftaki kardiyak hilali oluşturur1. Kardiyak hilal, miyokard ve endokard2'nin progenitörlerini içeren iki prekardiyak hücre popülasyonu içerir. E8.0 civarında, kardiyak öncüller orta hatta kaynaşır ve iki epitel dokusundan, dış miyokarddan ve kardiyak jöle adı verilen hücre dışı bir matrisle ayrılmış özel bir endotel olan iç endokarddan oluşan ilkel kalp tüpünü oluşturur. Daha sonra, E8.5'te, kalp tüpü sağa doğru döngüye girer. Döngülü kalp, çıkış yolu (OFT), ventriküller....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan çalışmaları Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) Hayvan Deneyleri Etik Komitesi ve Madrid Topluluğu tarafından onaylanmıştır (ref. PROEX 155.7/20). Tüm hayvan prosedürleri, Real Decreto 1201/2005 kapsamında İspanyol yasalarında yürürlüğe giren, deneysel ve diğer bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63EU sayılı AB Direktifi ve 2007/526/EC sayılı Tavsiye Kararı'na uygundur.
1. ESÜ ve / veya OFT'lerin obtensiyonu (Xiao ve ark. 25)
- Öğleden sonra kadın mTmG ve erkek VE-Cadherin-Cre-ERT / + arasında h....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol kullanılarak üretilen veriler, AVC'nin endokardının en yüz görüntülemesinin gerçekleştirilmesinin mümkün olduğunu göstermektedir. İlk amaç, kapakçıkların oluşumu sırasında endokardın hücre şeklini hücresel çözünürlükte analiz etmekti (Şekil 1). E9.5'teki bireysel endokardiyal hücreleri vurgulamak için, iki transgenik fare suşu kullandık. (1) ROSAmT/mG, hücre zarında floresansı tespit edilen iki renkli floresan Cre muhabir alelidir (tdTomato/mT
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Endokard, embriyonik kalp tüpünün tüm iç yüzeyini kaplayan epitel tek katmanlıdır. Kapak gelişimi sırasında, prospektif kapak bölgelerindeki endokardiyal hücreler EMT'ye maruz kalır, böylece endokardiyal hücreler endokarddan kardiyak jöleye doğru delaminasyon yapmak için sitoiskeletlerini dönüştürür ve yeniden düzenler. Biz ve diğerleri, endokardın 6,8,24,32 hücre sırası olarak gösterildiği E8.5 ve E9.5 embriyonik kalplerinin enine bölümlerini analiz ederek fare embriyolarında kapak ge.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, MCIN/AEI/10.13039/501100011033'den J. L. P. J.G.-B.'ye PID2019-104776RB-I00 ve CB16/11/00399 (CIBER CV) hibeleri ile desteklenmiştir. Comunidad de Madrid'den Programa de Atracción de Talento tarafından finanse edildi (2020-5ª / BMD-19729). T.G.-C. Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054) tarafından finanse edilmiştir. MCIN/AEI /10.13039/501100011033 ve FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16) tarafından ortaklaşa finanse edilen CNIC Mikroskopi ve Dinamik Görüntüleme Birimi, CNIC, ICTS-ReDib'e teşekkür ederiz. Ayrıca A. Galiçya ve L. Méndez'e fare yetiştiriciliği için teşekkür ederiz. Bu yayının maliyeti kısmen Avrupa ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 4-OH-Tamoksifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| %16 Paraformaldheyde | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 157-10 | Suda% 4'e seyreltin |
| anti-GFP Aves | Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Keçi anti-Tavuk, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Keçi Anti-Fare Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slaytlar Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Montajı Orta | Vektör Laboratuvarları | H-1000-10 |
Kaynaklar
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbou....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
