Yöntem makalesi

Enfeksiyöz Mononükleozlu Çocuklardan Periferik Kan Örneklerinde İmmün Hücre Alt Popülasyonlarının Ayrılması

DOI:

10.3791/64212

⸱

7 Eylül 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, National Center for Children's Health, 2Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Periferik kan mononükleer hücrelerinin (monositler, CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreleri, B hücreleri ve doğal öldürücü hücreler) tanımlanmış bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncukları ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamasını birleştiren bir yöntem tanımladık. Bu yöntemi kullanarak, manyetik ve floresan olarak etiketlenmiş hücreler saflaştırılabilir ve analiz edilebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enfeksiyöz mononükleoz (IM), çoğunlukla primer Epstein-Barr virüsü (EBV) enfeksiyonu ile ilişkili akut bir sendromdur. Başlıca klinik semptomlar düzensiz ateş, lenfadenopati ve periferik kanda önemli ölçüde artmış lenfositlerdir. IM'nin patojenik mekanizması hala belirsizdir; bunun için etkili bir tedavi yöntemi yoktur, esas olarak semptomatik tedaviler mevcuttur. EBV immünobiyolojisindeki ana soru, enfekte bireylerin sadece küçük bir alt kümesinin neden ciddi klinik semptomlar gösterdiği ve hatta EBV ile ilişkili maligniteler geliştirdiği, çoğu bireyin virüsle yaşam boyu asemptomatik olduğudur.

B hücreleri ilk önce IM'ye dahil olurlar, çünkü EBV reseptörleri yüzeylerinde sunulur. Doğal öldürücü (NK) hücreler, EBV ile enfekte olmuş hücreleri öldürmek için önemli olan sitotoksik doğuştan gelen lenfositlerdir. CD4 + T hücrelerinin oranı azalırken, CD8 + T hücrelerinin oranı akut EBV enfeksiyonu sırasında dramatik olarak genişler ve CD8 + T hücrelerinin kalıcılığı IM'nin yaşam boyu kontrolü için önemlidir. Bu bağışıklık hücreleri IM'de önemli roller oynar ve işlevlerinin ayrı ayrı tanımlanması gerekir. Bu amaçla, monositler önce CD14 mikroboncukları, bir sütun ve manyetik bir ayırıcı kullanılarak IM bireylerinin periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) ayrılır.

Kalan PBMC'ler, CD4 + T hücrelerini, CD8 + T hücrelerini, B hücrelerini ve NK hücrelerini bir akış sitometresi kullanarak sıralamak için peridinin-klorofil-protein (PerCP) / Siyanin 5.5 anti-CD3, allofikokosyanin (APC) / Siyanin 7 anti-CD4, fikoeritrin (PE) anti-CD8, floresan izotiyosiyanat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 ve APC anti-CD16 antikorları ile boyanır. Ayrıca, IM'deki fonksiyonlarını ve patojenik mekanizmalarını araştırmak için beş alt popülasyonun transkriptom dizilimi yapıldı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan herpes virüsü tip 4 olarak da bilinen bir γ-herpes virüsü olan Epstein-Barr virüsü (EBV), insan popülasyonunda her yerde bulunur ve yetişkin nüfusun% 90'ından fazlasında yaşam boyu gizli enfeksiyon oluşturur1. EBV primer enfeksiyonunun çoğu çocukluk ve ergenlik döneminde ortaya çıkar, hastaların bir kısmı enfeksiyöz mononükleoz (IM)2 ile kendini gösterir, kandaki CD8 + T hücreleri ile aktive olmuş bir immün yanıt ve orofarenks3'te EBV ile enfekte B hücrelerinin geçici proliferasyonu dahil olmak üzere karakteristik immünopatoloji gösterir. IM'nin seyri 2-6 hafta sürebilir ve hastaların çoğunluğuiyileşir 4. Bununla birlikte, bazı bireylerde kronik aktif EBV enfeksiyonu (CAEBV)5 olarak sınıflandırılan yüksek morbidite ve mortalite ile kalıcı veya tekrarlayan IM benzeri semptomlar gelişir. Ek olarak, EBV, nazofaringeal karsinom, Burkitt lenfoma, Hodgkin lenfoma (HL) ve T / NK hücreli lenfoma6 gibi epiteloid ve lenfoid maligniteler de dahil olmak üzere çeşitli malignitelerle yakından ilişkili olan önemli bir onkojenik virüstür. EBV 50 yılı aşkın süredir çalışılmasına rağmen, patogenezi ve lenfositlerin proliferasyonunu indüklediği mekanizma tam olarak aydınlatılamamıştır.

Birçok çalışmada transkriptom dizilimi ile EBV enfeksiyonunun immünopatolojisi için moleküler imzalar araştırılmıştır. Zhong ve ark., CD8 + T hücre genişlemesinin ağırlıklı olarak IM grubu7'de bulunduğunu bulmak için IM veya CAEBV'li Çinli çocuklardan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) tüm transkriptom profillemesini analiz ettiler ve CD8 + T hücrelerinin IM'de önemli bir rol oynayabileceğini düşündürdüler. Benzer şekilde, başka bir çalışmada, birincil EBV enfeksiyonunun neden olduğu IM'li hastalarda, hem EBV reaktivasyonunun hem de diğer ajanların neden olduğu IM'li hastalara göre daha düşük oranda EBV'ye özgü sitotoksik T ve CD19 + B hücrelerinin daha düşük oranları veCD8 + T hücrelerinin daha yüksek yüzdeleri bulunmuştur. B hücreleri ilk önce IM'ye dahil olurlar, çünkü EBV reseptörleri yüzeylerinde sunulur. Al Tabaa ve ark., IM9 sırasında B hücrelerinin poliklonal olarak aktive olduğunu ve intoplazmablastlar (CD19+, CD27+ ve CD20− ve CD138− hücreleri) ve plazma hücrelerinin (CD19+, CD27+ ve CD20− ve CD138+) farklılaştığını bulmuşlardır. Ayrıca, Zhong ve ark. monosit belirteçleri CD14 ve CD64'ün CAEBV'de yukarı regüle olduğunu bulmuşlardır, bu da monositlerin antikora bağımlı hücresel sitotoksisite (ADCC) ve hiperaktif fagositoz7 yoluyla CAEBV'nin hücresel immün yanıtında önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Alka ve ark., dört IM veya HL hastasından CD56dim CD16 + NK hücrelerini sıralayan MACS'nin transkriptomunu karakterize ettiler ve hem IM hem de HL'den NK hücrelerinin, NK hücrelerinin hipoyanıtlılığından sorumlu olabilecek doğuştan gelen bağışıklık ve kemokin sinyal genlerini aşağı regüle ettiğini bulmuşlardır10. Ek olarak, Greenough ve ark., IM'li bireylerin 10 PBMC'sinden sıralanmış CD8 + T hücrelerinin gen ekspresyonunu analiz ettiler. IM'deki CD8 + T hücrelerinin büyük bir kısmının virüse özgü, aktive edilmiş, bölünen ve efektör aktivitelerini uygulamak için astarlanmış olduğunu bildirmişlerdir11. Hem T hücresi aracılı, EBV'ye özgü yanıtlar hem de NK hücre aracılı, spesifik olmayan yanıtlar primer EBV enfeksiyonu sırasında önemli roller oynamaktadır. Bununla birlikte, bu çalışmalar sadece immün hücrelerin çeşitli karışımının veya sadece belirli bir lenfosit alt popülasyonunun transkriptom sonuçlarını araştırmıştır; bu, aynı hastalık durumundaki IM'li çocuklarda farklı immün hücre alt popülasyonlarının moleküler özelliklerinin ve fonksiyonlarının kapsamlı bir şekilde karşılaştırılması için yeterli değildir.

Bu yazıda, PBMC'lerin (monositler, CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreleri, B hücreleri ve NK hücreleri) tanımlanmış immün hücre alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncukları ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamayı (FACS) birleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, manyetik ve floresan olarak etiketlenmiş hücreler manyetik bir ayırıcı ve FACS kullanılarak saflaştırılabilir veya akış sitometrisi ile analiz edilebilir. RNA, transkriptom dizilimi için saflaştırılmış hücrelerden ekstrakte edilebilir. Bu yöntem, IM'li bireylerin aynı hastalık durumlarında farklı bağışıklık hücrelerinin karakterizasyonunu ve gen ekspresyonunu sağlayacak ve bu da EBV enfeksiyonunun immünopatolojisi hakkındaki anlayışımızı genişletecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IM'li hastalardan (n=3), sağlıklı EBV taşıyıcılarından (n=3) ve EBV ile enfekte olmayan çocuklardan (n=3) kan örnekleri alındı. Gönüllüler Pekin Çocuk Hastanesi, Capital Medical Üniversitesi'nden işe alındı ve tüm çalışmalar etik olarak onaylandı. Etik onay, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi Etik Kurulu tarafından alınmıştır (Onay Numarası: [2021]-E-056-Y). Hastaların bilgilendirilmiş onamından feragat edildi, çünkü çalışma sadece klinik testler için kalan örnekleri kullandı. Hasta gizliliğini korumak için tüm veriler tamamen kimliksizleştirildi ve anonimleştirildi.

1. PBMC'lerin periferik kandan izolasyonu

  1. IM'li hastalardan standart venipunktur ileK3EDTA tüplerine taze periferik kan (2 mL) toplayın.
    NOT: Hücre canlılığını korumak için işlemin hızlı olması gerekir.
  2. Periferik kanı fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kat hacme kadar seyreltin ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde insan lenfosit ayırma ortamının (yoğunluk: 1.077 ± 0.001 g / mL) üzerine yerleştirin.
    NOT: Kan, PBS ve ayırma ortamının hacim oranı 1: 1: 1 idi. Kanı yavaşça ayırma ortamına ekleyin ve kanın ayırma ortamına yerleşmesini önlemek için hemen santrifüj yapın.
  3. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 800 × g'da santrifüj. Orta tabakayı (zenginleştirilmiş PBMC'ler) başka bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra, tüpün dibinde eritrositler, orta tabaka ayırma ortamı, üst tabaka plazma ve plazma tabakası ile ayırma sıvı tabakası arasında PBMC'ler (lenfositler ve monositler dahil) bulunur.
  4. PBMC'leri 10 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 800 × g'da santrifüj yapın; süpernatantı dikkatlice atın.
  5. Yıkama ve santrifüjlemeyi tekrarlayın (adım 1.4) 2 x. PBMC'leri 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL PBS ile yeniden askıya alın ve hücreleri tripan mavisi tabanlı, otomatik bir sayaçla sayın.

2. CD14 mikroboncukları kullanılarak CD14 + monositlerin PBMC'lerden izolasyonu

  1. PBS'de (pH 7.2) %0.5 fetal sığır serumu (FBS) ve 2 mM EDTA içeren bir tampon çözeltisi hazırlayın. Tamponu soğuk tutun (2-8 °C).
    NOT: Hava kabarcıkları sütunu tıkayabileceğinden kullanmadan önce tamponun gazını çözün. Hücre yüzeyindeki antikorların kapanmasını ve spesifik olmayan hücre etiketlemesini önlemek için hücreleri soğuk tutun.
  2. PBMC'leri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice atın. Hücreleri 80 μL tampon ile yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna 20 μL CD14 mikroboncuk ekleyin.
    NOT: ≤107 PBMC varsa, yukarıda belirtilen birimi kullanın. >107 PBMC varsa, tüm reaktif hacimlerini ve toplam hacmi orantılı olarak artırın.
  3. CD14 mikroboncuklarını ve hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde iyice karıştırın ve 4 ° C'lik bir buzdolabında 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. PBMC'leri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 × g'da 1 mL tampon ve santrifüj ile yıkayın. Süpernatantı tamamen atın. Hücreleri 500 μL tampon ile yeniden askıya alın.
    NOT: ≤108 PBMC varsa, yukarıda belirtilen birimi kullanın. >108 PBMC varsa, arabellek birimini orantılı olarak artırın.
  4. Sütunlarla manyetik ayırma:
    1. Kolonu manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin ve sütunu 3 mL tamponla yıkayın. Hücre askıya alma özelliğini (adım 2.3'ten itibaren) sütuna ekleyin.
    2. Kolondan geçen etiketsiz hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve sütunu 3 mL tamponla yıkayın. Kolonu 3 x 3 mL tamponla yıkayın. Toplam atık suyu 15 mL santrifüj tüpünde toplayın.
    3. Kolonu yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Sütuna 5 mL arabellek ekleyin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri derhal 15 mL santrifüj tüpüne boşaltmak için pistonu sıkıca sütuna itin.
    4. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Sonraki transkriptom dizilemesinde kullanılmak üzere 500 μL PBS'deki hücreleri 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde yeniden askıya alın.

3. Floresan etiketli antikor boyama ve FACS ile lenfosit popülasyonlarının PBMC'lerden ayrılması

  1. Etiketlenmemiş hücreleri (adım 2.4.2) 5 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. 100 μL PBS'deki hücreleri 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde yeniden askıya alın.
  2. 100 μL hücre süspansiyonuna her etiketli antikorun (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) 2 μL'sini ekleyin (antikorların hacimleri ve konjuge florofor bilgileri Tablo 1'de gösterilmiştir), 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve ışıktan koruyun.
  3. 1 mL PBS ekleyerek ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yaparak hücreleri 2 x yıkayın. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde 500 μL PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Bir akış hücresi sıralayıcı sitometresinde veri elde etmeden önce hücre süspansiyonunu yavaşça vorteksleyin.

4. Akış sitometrisi parametre ayarı

  1. Gerektiğinde 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde hücre süspansiyonunun 100 μL'sini (bkz. bölüm 1) alın ve negatif kontrol numunesi, CD3 tek boyama örneği, CD4 tek boyama örneği, CD8 tek boyama örneği, CD19 tek boyama örneği ve CD56/CD16 boyama örneği ayarlayın.
  2. Hücre süspansiyonunun ve girdabının 100 μL'si başına karşılık gelen floresan etiketli antikorun 2 μL'sini ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. 300 × g'da 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı aspire edin. Peletleri 500 μL PBS ve vorteks ile yeniden askıya alın.
  3. Sıralama akışını devreye alın ve floresan boncukları kullanarak damlacıkları aşağıdaki gibi geciktirin:
    1. Hücre sıralama sistemini açın, açma programını çalıştırın, 85 μm nozulu takın ve sıralama akışını açın. Sıralama voltajını 4.500 V'a ve Freq'i 47 V'a ayarlayın.
    2. Ana akış damlacık kesme noktasını ve damlacık gecikmesini üreticinin talimatlarına göre ayarlayarak parametreleri ayarlayın12. İlk damlacık kesme noktası konumunu (Drop1) 275'e ve Breakoff penceresinde Gap'i 8'e ayarlayın. Sitometrinin akışı stabilize etmek için damlacık genlik değerini otomatik olarak belirlemesine izin vermek için Sweet Spot otomatik sıralama modunu açın.
    3. Floresan boncukları yükleyerek damlacık gecikmesini Yan Akış penceresinde 30,31'e ayarlayın ve boncukların başlangıç veya ince ayar modunda %>99'luk bir yan akış sapması elde etmesini sağlayın.
  4. Geçitlemeyi aşağıdaki gibi gerçekleştirmek için Şekil 1'de gösterilen geçit stratejisine bakın:
    1. İleri saçılma alanı (FSC-A)/yan saçılma alanı (SSC-A) nokta grafiği kullanarak, bozulmamış lenfosit popülasyonunu tanımlamak için çokgen kapısını (P1) çizin.
    2. FSC-A/FSC yüksekliği (FSC-H) nokta grafiği kullanarak, tek hücreleri tanımlamak ve çiftleri dışlamak için çokgen kapısını (P2) çizin (Şekil 1A).
    3. CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A nokta grafiği kullanarak, CD3+ T hücrelerini ve CD19+ B hücrelerini seçmek için dikdörtgen geçidi (P3) çizin (Şekil 1A,B).
    4. CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A nokta grafiği kullanarak, CD4 + T hücrelerini ve CD8 + T hücrelerini (sırasıyla bu belirteçler için yüksek floresanslı hücreler) seçmek için dikdörtgen bir kapı çizin.
    5. CD56/CD16 APC-A/SSC-A nokta grafiği kullanarak, CD56+/CD16+ NK hücrelerini seçmek için dikdörtgen bir kapı çizin (Şekil 1C).
  5. Negatif kontrol örneğini kullanarak enstrümantal parametreleri ayarlayın:
    1. Negatif kontrol tüpünü yükleme portuna takın ve Edinme Kontrol Paneli'nde Yükle'ye tıklayın. Yazılımda Sitometre Ayarları'nı seçin.
    2. Denetçi penceresinde, Parametreler sekmesini tıklatın ve FSC, SSC ve farklı floresan boyaların voltajlarını ayarlayın; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Siyanin 7: 824, FITC: 555, PerCP-Siyanin 5.5: 663.
  6. Tek lekeli numuneleri kullanarak kompanzasyonu ayarlayın13.
    1. Tek lekeli tüpleri sitometriye sırayla yükleyin ve yazılımda Sitometre Ayarları'nı seçin. Tazminatı ayarlamak için Ücret sekmesini tıklatın.
      NOT: Akış sitometrisinin kompanzasyon referansı Tablo 2'de gösterilmiştir.

5. Akış sitometrisi ile hücre sıralama ve veri toplama

  1. Tüpü sitometreye yüklemeden önce hücreleri kısa bir süre için hücre süspansiyonunu (bölüm 1-3'e göre ayrılmış PBMC'ler) vorteksleyin. Kalan tüpleri buz üzerinde tutun.
  2. Sıralanmış hücrelerin tüp duvarına yapışmasını önlemek için dört toplama akış tüpüne 200 μL FBS ekleyin ve sitometre toplama odasına yerleştirin.
  3. CD3 + CD4 + T hücrelerini, CD3 + CD8 + T hücrelerini, CD3 − CD19 + B hücrelerini ve CD3 − CD56 + / CD16 + NK hücrelerini, dört akış tüpünde IM'li bir hastanın örneğinden ayrı olarak toplayın (Şekil 2A).
  4. Ayrılan hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Transkriptom dizilimi için hücrelere 200 μL RNA izolasyon reaktifi ekleyin.
  5. Örneklerin immün hücre alt popülasyonlarını sağlıklı EBV taşıyıcılarından ve EBV ile enfekte olmamış çocuklardan yukarıdaki adımlara göre ayırın (Şekil 2B, C).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçit stratejisinin referansı
Dört lenfosit alt popülasyonunu sıralamak için kullanılan geçit stratejisi Şekil 1'de gösterilmiştir. Kısaca, lenfositler, granüloziteye (SSC-A) karşı boyutu (FSC-A) gösteren bir nokta grafiği üzerinde seçilir (P1). Ardından, boyutu (FSC-A) ve ileri dağılımı (FSC-H) gösteren bir nokta grafiğinde tek hücreler (P2) seçilirken, çift hücreler hariç tutulur. CD3+ T hücreleri (P3) ve CD19+ B hücreleri (Şek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, periferik kan bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını sıralamanın etkili bir yolunu temsil eder. Bu çalışmada IM'li hastalardan, sağlıklı EBV taşıyıcılarından ve EBV ile enfekte olmamış çocuklardan alınan venöz kan örnekleri araştırma amacı olarak seçilmiştir. IM hastalarının periferik kanını kullanan bu çalışma, esas olarak çok renkli akış sitometrisi yoluyla farklı hücre alt kümelerinin oranlarını analiz etmeye ve belirlemeye odaklanmaktadır. Transkriptom dizilimi, esas olarak, aynı hastalık durumundaki IM...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82002130), Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7222059) ve Tıp Bilimleri için CAMS İnovasyon Fonu (2019-I2M-5-026) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
APC anti-insan CD16Biolegend302012Floresan antikor 
APC anti-insan CD56 (NCAM)Biolegend362504Floresan antikor 
APC / Cyanine7 anti-insan CD4Biolegend344616Floresan antikor 
Otomatik hücre sayacıBIO RADTC20Hücre sayımı
BD FACSAria floresanla aktif  Akış  hücre  sıralayıcı-sitometre (BD FACSAria II)Becton, Dickinson and Company644832Hücre sıralama
CD14 Mikro Boncuklar, insanMiltenyi Biotec130-050-201mikro boncuklar
Hücre ctng slaytlarıBIO RAD1450016Hücre sayımı
Santrifüj tüpleriFalcon3520971515 mL santrifüj tüpü
EDTA (≥ %99, BioPremium)BeyotimeST1303EDTA
Etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) antikoagülan tüplerBecton, Dickinson and Company  367862 EDTA antikoagülan tüpler
FITC anti-insan CD19Biolegend302206Floresan antikor 
Gibco Fetal Sığır SerumuThermo Fisher Scientific16000-044Fetal Sığır Serumu
  Yüksek hızlı  santrifüjSigma  15mL santrifüj tüpü için 3K15 Hücre santrifüjü
  Yüksek hızlı  santrifüjEppendorf5424R1.5 mL Eppendorf (EP) tüpü için hücre santrifüjü
İnsan lenfosit ayırma ortamıDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque
LS  Ayrılık  sütunlarMiltenyi Biotec130-042-401Ayırma  sütunlar
Mikrosantrifüj tüpleriAxygenMCT-150-C1.5 mL mikrosantrifüj tüpü
MidiMACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-042-302Manyetik boncuk ayırıcı
PE anti-insan CD8Biolegend344706Floresan antikor 
PerCP / Siyanin5.5 anti-insan CD3Biolegend344808Floresan antikor 
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Polistiren yuvarlak tabanlı tüplerFalcon352235FACS akış sitometresi için 5 mL tüp
RNA ekstraksiyonu içinTRIzol reaktifiAmbion15596024
Tripan Mavi Boyama Hücresi Canlılık Test KitiBeyotimeC0011Tripan Mavisi Boyama
Lyse hücreleri

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60(2016).
  2. Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
  3. Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
  4. Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
  5. Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
  6. Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270(2017).
  7. Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775(2017).
  8. Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
  9. Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
  10. M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907(2020).
  11. Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
  12. Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961(2019).
  13. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  14. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431(2019).
  15. Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
  16. Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836(2021).
  17. Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110(2018).
  18. Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753(2020).
  19. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416(2018).
  20. Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mm n H cre Ay rmaEpstein Barr Vir sAk SitometrisiFloresan Aktive S ralamamm nomanyetik BoncuklarCD4 T H creleriCD8 T H creleriDo al Katil H creler

İlgili makaleler