Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Murin Kemik İliği Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin ve Stromal Niş Hücrelerin Akış Sitometri Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Kemik iliği (BM), yeni kan hücrelerinin üretildiği süreç olan hematopoezin öncelikle meydana geldiği kemiklerde bulunan yumuşak dokudur. Bu nedenle, hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC'ler) ve HSPC'lerin bakımına ve düzenlenmesine katkıda bulunan destekleyici stromal hücreleri içerir. hematolojik ve diğer BM bozuklukları, hematopoetik hücreleri doğrudan ve / veya BM nişinin değiştirilmesi yoluyla etkileyerek hematopoezi bozar. Burada, murin BM HSPC'lerinin ve stromal niş popülasyonlarının akış sitometrisi ile fenotipik analizi yoluyla sağlık ve malignitede hematopoez incelemek için bir yöntem tanımlanmıştır. Yöntemimiz, endosteal ve santral BM fraksiyonlarında BM hücrelerini zenginleştirmek için gerekli adımları ve HSPC regülasyonunda yer alan iki anahtar niş hücre tipini, endotel hücrelerini ve mezenkimal kök hücreleri tanımlamak için uygun geçit stratejilerini detaylandırmaktadır. Burada önerilen fenotipik analiz, HSPC bölmesini ve nişini karakterize etmek için fare mutantları, hastalık modelleri ve fonksiyonel testlerle birleştirilebilir.
Giriş
Akım sitometrisi, immün ve hematopoetik hücreleri karakterize etmek ve prospektif olarak izole etmek için paha biçilmez bir yöntemdir. Ayrıca, farklı dokuların stromal ve epitel popülasyonlarını analiz etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Hematopoetik kök hücre (HSC) kendini yenileme ve multipotens gibi benzersiz özelliklere sahiptir. Yetişkin memelilerde, HSC'ler öncelikle çevredeki mikro çevreden veya niş1'den sessizlik ve hayatta kalma sinyalleri aldıkları kemik iliğinde (BM) bulunur. HSC'ler resmi olarak fonksiyonel tahlilleregöre tanımlanır 2. Bununla birlikte, birkaç dönüm noktası makalesi, HSC'leri tanı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokolde kullanılan hayvanlar, i3S hayvan tesisinde belirli patojensiz koşullar altında 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsünde ve sıcaklık kontrollü bir ortamda barındırılmıştır. Standart kemirgen chow ve suya ücretsiz erişim sağlandı. Tüm hayvanlar, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Avrupa Laboratuvar Hayvanları Bilim Dernekleri Federasyonu tarafından belirtilen kriterlere göre insancıl bakım almıştır (AB Direktifi 2010/63/EU). Hayvanlar üzerinde yapılan deneysel prosedür (ötenazi), i3S Hayvan Etik Komitesi (ref. DD_2019_15) ve Direção-Geral de Alimentação e Veterinária tarafından onaylanmıştır. Bu protokol boyunca kullanılan malzemelerin d....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sağlıklı bir genç yetişkin C57Bl/6 farede HSC'lerin ve MPP'lerin akış sitometri analizinin temsili grafikleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Geçit stratejisi, ISEH13 tarafından önerilen en son uyumlaştırıcı isimlendirmeyi takip eder. Enfeksiyon veya kanser gibi bir pertürbasyonun etkisini analiz ederken, normal kapılar için referans olarak bir kontrol faresi kullanmak önemlidir. Floresan eksi bir (FMO) kontrolleri, kapıların sınırlarını tanımlamak için özellikle yararlı o.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Açıklanan protokol basit ve gerçekleştirilmesi kolay olsa da, belirli adımlara özel dikkat gösterilmelidir. Örneğin, yıkanmış BM elde ederken (adım 5.2), PBS% 2 FBS'yi kemiğin orta kısmının içinden geçirmek için belirtilen hacim veya sayı aşılmamalıdır, çünkü bu, yıkanmış numunenin endosteal hücre popülasyonları tarafından önemli ölçüde kontaminasyonuna neden olabilir.
Araştırmacı tarafından yürütülmesini kolaylaştırmak için protokolde değişiklikler yapılabilir. Numune ekstraksiyonunda (bölüm .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
LM, Lady Tata Memorial Trust'tan bir hibe ile desteklendi. JR, Fundação para a Ciência e Tecnologia'dan (FCT; FCT bursu UI/BD/150833/2021). ML, FCT'den bir doktora bursu (FCT bursu 2021.04773.BD) ile desteklenmiştir. DD, Amerikan Hematoloji Derneği, Pablove Vakfı, FCT (EXPL / MED-ONC / 0522/2021) ve Portekiz Hematoloji Derneği'nden gelen hibelerle desteklendi. i3s'deki TRACY tesisinden Dr. Catarina Meireles ve Emilia Cardoso'nun desteğine teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 647 anti-fare CD54 / ICAM-1 antikoru | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC / Cyanine7 anti-fare CD117 (c-kit) antikoru | BioLegend | 105826 | |
| APC / Cyanine7 anti-fare CD45 antikoru | BioLegend | 103116 | |
| APC / Cyanine7 anti-fare TER-119 / eritroid hücreler antikoru | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-fare CD3 ve epsilon; antikor | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-fare CD4 antikoru | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-fare CD8a antikoru | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-fare Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antikoru | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-fare TER-119 / eritroid hücreler antikoru | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-fare / insan CD11b antikoru | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-fare / insan CD45R / B220 antikoru | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-fare CD150 (SLAM) antikoru | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Renkli Boncuk | BD Biosciences | ||
| Kollajenaz IV | Merck Yaşam Bilimleri | C1889 | |
| Dispase II | Merck Yaşam Bilimleri | D4693 | |
| Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısı inaktive edilmiş, AB onaylı, Güney Amerika Menşeili | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Fare Leptin R Biyotinillenmiş Antikor | R & D sistemleri | BAF497 | |
| NucBlue Sabit Hücre Reaktifi (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reaktifi |
| PE anti-fare endomüsin antikoru | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-fare Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-fare CD31 antikoru | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-fare CD48 antikoru | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-fare Ly-6A/E (Sca-1) antikoru | BioLegend | 108122 | |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) tabletleri | Merck Life Science | P4417 | |
| Saflaştırılmış anti-fare CD16/32 antikoru | BioLegend | 101302 | |
| RBC lizis tamponu 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombi Menekşe Tamir Edilebilir Canlılık Boyası | BioLegend | 423114 | floresan boya |
Kaynaklar
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
