İlaç Dağıtım Sistemleri ve Hücreler Arasındaki Etkileşimlerin Deneysel Ölçümü In Vitro: Preklinik Nanotıp Değerlendirmesi İçin Bir Kılavuz

Summary

Yeni ilaç dağıtım sistemlerinin daha rasyonel değerlendirilmesini sağlamak için akış sitometrisi kullanılarak ilaç taşıyıcı-hücre etkileşimlerinin mutlak ölçümü için bir iş akışı gösterilmiştir. Bu iş akışı, her türlü ilaç taşıyıcısı için geçerlidir.

Abstract

İlaç dağıtım sistemlerinin tasarlanmasının önemli bir bileşeni, belirli hücre tipleriyle etkileşimlerin nasıl artırılacağı veya azaltılacağı ile ilgilidir. Örneğin, bir kemoterapi, kanser hücrelerine bağlanmayı arttırmak için bir antikor ile işlevselleştirilebilir ("hedefleme") veya bağışıklık hücresi tanımadan kaçınmaya yardımcı olmak için polietilen glikol ile işlevselleştirilebilir ("gizlilik"). Hücresel düzeyde bile, bir ilaç taşıyıcısının bağlanmasını ve alımını optimize etmek karmaşık bir biyolojik tasarım problemidir. Bu nedenle, yeni bir taşıyıcının bir hücreyle ne kadar güçlü etkileşime girdiğini, bir taşıyıcının kargosunun o hücreye teslim edildikten sonraki işlevsel etkinliğinden ayırmak değerlidir.

Kemoterapötik örneğe devam etmek gerekirse, "bir kanser hücresine ne kadar iyi bağlandığı", "bir kanser hücresini ne kadar iyi öldürür" den ayrı bir sorundur. İkincisi için kantitatif in vitro testler iyi kurulmuştur ve genellikle canlılığın ölçülmesine dayanır. Bununla birlikte, hücre-taşıyıcı etkileşimleri üzerine yayınlanan araştırmaların çoğu kalitatif veya yarı kantitatiftir. Genel olarak, bu ölçümler taşıyıcının floresan etiketlemesine dayanır ve sonuç olarak, göreceli veya keyfi birimlerdeki hücrelerle etkileşimleri bildirir. Bununla birlikte, bu çalışma standartlaştırılabilir ve az sayıda karakterizasyon deneyi ile kesinlikle nicel hale getirilebilir. Bu tür mutlak niceleme, çeşitli ilaç dağıtım sistemlerinin (nanopartiküller, mikropartiküller, virüsler, antikor-ilaç konjugatları, mühendislik terapötik hücreleri veya hücre dışı veziküller) rasyonel, sınıflar arası ve sınıflar arası karşılaştırmalarını kolaylaştırdığı için değerlidir.

Ayrıca, niceleme, sonraki meta-analizler veya in silico modelleme yaklaşımları için bir ön koşuldur. Bu makalede, taşıyıcı ilaç dağıtım sistemleri için in vitro nicelemenin nasıl sağlanacağına dair bir karar ağacının yanı sıra, taşıyıcı boyut ve etiketleme yöntemindeki farklılıkları dikkate alan video kılavuzları sunulmaktadır. Ek olarak, gelişmiş ilaç dağıtım sistemlerinin nicel değerlendirmesi için daha fazla husus tartışılmaktadır. Bunun, yeni nesil tıp için rasyonel değerlendirme ve tasarımı geliştirmek için değerli bir kaynak olarak hizmet etmesi amaçlanmıştır.

Introduction

Hangi hücre tipiyle karşılaştıklarına bağlı olarak spesifik, tasarlanmış davranış sergileyen ilaç dağıtım yapılarının tasarımı, önemli araştırma ilgisini çekmiştir. Potansiyel ilaç dağıtım yapıları veya "taşıyıcılar" arasında lipit formülasyonları, nano-yetiştirilen inorganikler, polimerik montajlar, hücre dışı veziküller, işlevselleştirilmiş bakteri hücreleri veya modifiye virüsler bulunur. Bunların hepsi, fiziksel özellikler, yüzey özellikleri veya antikor eki^1,2 gibi mühendislik kimyasal işlevlerine bağlı olarak organ^, doku veya hücre özgüllüğü gösterebilir.

İn vitro taşıyıcı değerlendirmesinde neredeyse her yerde bulunan bir adım, söz konusu ilaç yüklü taşıyıcıyı içeren bir süspansiyonla hücreleri inkübe etmektir. Kuluçka sonrası, taşıyıcı performansı, ilaç kargosunun performansının, örneğin transfeksiyon verimliliği veya toksisitesinin işlevsel bir okuması ile ölçülür. İşlevsel okumalar, taşıyıcı etkinliğinin aşağı akış ölçüsü oldukları için yararlıdır. Bununla birlikte, daha karmaşık ilaç dağıtım yapıları için, fonksiyonel okumaların ötesine geçmek ve ilgilenilen hücre ile taşıyıcı etkileşiminin derecesini ayrı ayrı ölçmek giderek daha önemlidir. Bunun birkaç nedeni var.

İlk olarak, çeşitli yükleri taşıyabilen "platform" taşıyıcı teknolojilerini keşfetmeye (ve yinelemeli olarak iyileştirmeye) artan ilgi var. Örneğin, RNA'yı kapsüllemek için tasarlanmış lipit nanopartikülleri (LNP'ler), birkaç uyarı³ ile bir RNA dizisini diğeriyle değiştirebilir. Bu nedenle, taşıyıcı teknolojisini yinelemeli olarak geliştirmek için, kargo işlevselliğinden bağımsız olarak performansını ölçmek çok önemlidir. İkincisi, fonksiyonel okumalar, taşıyıcı formülasyonlarını hızlı bir şekilde yineleme ve değerlendirme yeteneğinden ödün vererek, ilgilenilen kargo için basit olmayabilir. Basit bir fonksiyonel okuma (örneğin, floresan) ile bir model kargo kullanarak in vitro optimizasyon yapılabilirken, kargonun değiştirilmesi bir taşıyıcı^4'e biyolojik tepkiyi değiştirebilir ve bu nedenle temsili sonuçlar vermeyebilir. Üçüncüsü, birçok taşıyıcı belirli bir hücre tipi ile etkileşime girmek ve bunlar tarafından ele geçirilmek üzere tasarlanmıştır. Bir taşıyıcının bu hedefleme yeteneği , terapötik kargo sonrası hedeflemesinin performansından ayırt edilebilir ve edilmelidir. LNP örneğine devam etmek için, bir RNA kargosu son derece güçlü olabilir, ancak LNP hücreye bağlanamazsa, içselleştirilemez ve RNA'yı serbest bırakamazsa, aşağı akış fonksiyonel etkisi gözlenmez. Bu, özellikle T hücreleri⁵ gibi transfekte edilmesi zor hücre tiplerini hedeflemeyi amaçlayan taşıyıcılar için bir sorun olabilir. Tersine, bir LNP son derece etkili bir şekilde hedefleyebilir, ancak RNA kargosu çalışmayabilir. Sadece kargo işlevselliğini ölçen bir aşağı akış testi, bu iki durum arasında ayrım yapamaz, böylece taşıyıcı ilaç dağıtım sistemlerinin geliştirilmesini ve optimizasyonunu zorlaştırır.

Bu çalışmada, taşıyıcı ilişkisinin kesin olarak nasıl ölçüleceği tartışılmıştır. İlişkilendirme, bir taşıyıcı ile bir hücre arasındaki deneysel olarak ölçülen etkileşim derecesini ifade eden bir terimdir. İlişkilendirme, membran bağlama ve içselleştirme arasında ayrım yapmaz – bir taşıyıcı, hücre yüzeyine bağlı olduğu veya hücre onu içselleştirdiği için ilişkili olabilir. İlişkilendirme genellikle hücre taşıyıcı inkübasyon deneylerinin bir parçası olarak ölçülür. Tarihsel olarak, ilişkilendirme ya keyfi floresan birimlerinde (tipik olarak "medyan floresan yoğunluğu" veya MFI) ya da sınırlamaları daha önce tartışılan metrikler olan "yüzde ilişkisi" olarak bildirilmiştir⁶. Kısacası, bu ölçümler deneysel protokoller, akış sitometresi ayarları ve farklı taşıyıcıların etiketleme yoğunluklarındaki farklılıklar nedeniyle deneyler, laboratuvarlar ve ilaç taşıyıcıları arasında karşılaştırılamaz. Sitometreyi kalibre ederek birincisinin üstesinden gelmek için çaba sarf edilmiştir, böylece MFI'nin göreceli ölçüsünü kesinlikle nicel bir floresan⁷ ölçüsüne dönüştürmüştür. Bununla birlikte, bu yöntem çeşitli taşıyıcıların etiketleme yoğunluğundaki değişkenliği hesaba katmaz ve bu nedenle,⁸. seçimin hedef hücresindeki çeşitli taşıyıcı performanslarının rasyonel olarak karşılaştırılmasına izin vermez.

Burada, göreceli, keyfi floresan birimlerinden "hücre başına taşıyıcı sayısının" mutlak nicel metriğine pratik olarak nasıl dönüştürüleceği, az sayıda ek karakterizasyon deneyi yapılarak gösterilmiştir. Başka bir taşıyıcı konsantrasyonu metriği istenirse (örneğin, hücre başına taşıyıcı kütle veya hücre başına taşıyıcı hacim), taşıyıcı karakterizasyonu yapılmış olması koşuluyla, hücre başına taşıyıcılardan dönüştürmek kolaydır. Kısalık ve jargondan kaçınmak için, "taşıyıcı" kelimesi bu çalışmada ilaç dağıtım yapılarının geniş çeşitliliğine atıfta bulunmak için kullanılmıştır. Bu niceleme teknikleri, nano mühendislik ürünü bir altın parçacığına veya biyo-mühendislik ürünü bir bakteriye uygulanıp uygulanmadığına bakılmaksızın eşit derecede uygulanabilir.

Birkaç gerçek, keyfi floresan birimlerinden hücre başına taşıyıcılara dönüşümü mümkün kılar. İlk olarak, ölçülen floresan yoğunluğu, floresanın cihazın algılama sınırları içinde olduğu ve enstrümantasyon ayarlarının aynı olduğu varsayılarak, bir florofor^9'un (veya floresan olarak etiketlenmiş bir taşıyıcının) konsantrasyonu ile orantılıdır. Böylece, bir taşıyıcının floresansı ve bir numunenin floresansı biliniyorsa, tüm ölçümler aynı ayarlar ve koşullar altında gerçekleştirilmişse, o numunede kaç taşıyıcının bulunduğu belirlenebilir. Bununla birlikte, özellikle küçük taşıyıcılar için, aynı cihazda aynı aletlerde taşıyıcı floresansı, hücre otofloresansını ve taşıyıcılarla ilişkili hücre floresansını aynı ayarlarla ölçmek mümkün olmayabilir. Bu durumda, bir cihazda ölçülen floresan ile başka bir cihazda ölçülen floresan arasında dönüştürme yapmayı mümkün kılmak için ikinci bir gereklilik vardır. Bunu yapmak için, Eşdeğer Çözünür Florokrom Molekülleri (MESF) standart^9'dan yararlanarak, her iki cihazdaki floresan yoğunluğunu ölçmek için standart bir florofor konsantrasyonu eğrisi oluşturulabilir. Bu daha sonra, taşıyıcı floresansının sitometre olmayan bir sitometre üzerinde toplu olarak ölçülmesine izin verir, bu da herhangi bir boyut veya özellikteki taşıyıcılar üzerinde yapılabilecek bir ölçümdür. Bu tür bir kütle miktarı, bilinen konsantrasyondaki bir taşıyıcı süspansiyonunda yapıldığında, bir numunenin hücresi başına düşen taşıyıcı sayısı, bir kez daha, hesaplanabilir.

Bu çalışma, taşıyıcı ilişkisini ölçme sürecini gösterirken (ölçülen floresan yoğunluğu ile belirlendiği gibi), hücre-taşıyıcı etkileşiminin diğer ölçümleri için benzer bir protokol gerçekleştirilebilir (örneğin, içselleştirilmiş ve membrana bağlı taşıyıcıları ayırt eden deneysel bir protokol). Ek olarak, eğer ilişki floresan olmayan bir tahlille (örneğin, kütle sitometrisi yoluyla) ölçülürse, bu protokol büyük ölçüde aynı olacaktır.

Protocol

1. Uygun akışı seçme

1. Kullanılan deney düzeni için en iyi iş akışını (akış) belirlemek üzere Şekil 1'de özetlenen karar ağacını izleyin (Şekil 2). Bu akış seçimi hakkında daha fazla yorum için tartışmaya bakın.
2. Sitometre Akışını izliyorsanız, 2.1.1-2.2.7 adımlarıyla devam edin. Toplu Akış'ı izliyorsanız 3.1.1.1-3.1.5.7 adımlarıyla devam edin.

Şekil 1: İş akışı karar ağacı. Hangi Akışın kullanılacağına ilişkin karar, öncelikle taşıyıcının ilgilendiği ilgi türüne bağlıdır. Yüksek saçılma özelliklerine sahip daha büyük taşıyıcılar ve taşıyıcılar, sitometrelerde ayrı ayrı daha kolay tespit edilebilir, böylece Sitometre Akışı kullanılarak niceleme için uygun hale getirilir. Toplu Akış, diğer tüm taşıyıcı tipleri için uygundur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İş akışlarına genel bakış. Bu protokol iki farklı Akışa bölünmüştür. Sitometre Akışı, süspansiyondaki taşıyıcıları saymak, bireysel floresanlarını ölçmek ve daha sonra taşıyıcılarla inkübe edilen hücrelerin floresansını belirlemek için hassas bir sitometre kullanır. Toplu Akış, süspansiyondaki taşıyıcıları saymak için Nanopartikül İzleme Analizi gibi sitometri tabanlı olmayan teknikler kullanır. Bireysel taşıyıcı floresan daha sonra bir mikroplaka okuyucu veya spektroflorometre kullanılarak ölçülür. Bu nedenle, akış sitometresinin kullanımı, taşıyıcılarla inkübe edilen hücrelerin nihai floresansını ölçmekle sınırlıdır; bu, daha geniş bir sitometre aralığında yapılabilen ve kullanılan taşıyıcı tipinden bağımsız bir ölçümdür. Kısaltmalar: MESF = eşdeğer çözünür florokrom molekülleri; MFI = medyan floresan yoğunluğu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Sitometre Akışı

1. Taşıyıcı sayımı
   NOT: Akış hızının (μL/s) bilinmesi koşuluyla bu ölçüm için herhangi bir akış sitometresi kullanılabilir. Akış hızı bilinmiyorsa ve belirlenemiyorsa, bu adıma devam etmeyin. Bunun yerine, adım 3.1 ile devam edin. Süspansiyondaki taşıyıcıların sayılması, her hücre deneyinde inkübe edilen taşıyıcı sayısının doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde belirlenmesini sağlar.
   1. Hem optik saçılma kanalı (tipik olarak yan saçılma [SSC]) hem de floresan ile taşıyıcıları tespit etmek için sitometreyi ayarlayın. Eşiği, taşıyıcıların algılanmasına izin verecek şekilde ayarladığınızdan emin olun.
      NOT: SSC net bir sinyal sağlamıyorsa (örneğin, ileri saçılma [FSC]) farklı optik saçılma kanalları üzerinden yineleme gerekebilir.
   2. Hem SSC hem de floresan kanallarındaki arka plan olay sayısını ölçmek için yalnızca seyreltici bir örnek çalıştırın.
      NOT: İdeal arka plan etkinlik sayıları <100 olay/sn'dir.
   3. Taşıyıcıları akış sitometrisi için hazırlayın.
      1. İlgili taşıyıcı sisteme bağlı olarak, taşıyıcıların vorteks veya sonikasyon ile iyi bir şekilde askıya alındığından emin olun.
      2. Mümkünse, taşıyıcı konsantrasyonunun 1.000 taşıyıcı / μL ile 10.000 taşıyıcı / μL arasında olduğundan emin olun. Arka plandan daha yüksek bir ila iki büyüklük sırasına sahip bir olay sayısı iyi bir başlangıçtır. Taşıyıcı konsantrasyonunun büyüklük sırası bilinmiyorsa, stoktan 1:1.000 seyreltme hazırlamak iyi bir başlangıçtır. Gelecekteki numune seyreltmelerini bildirmek için ilk sonuçları geri bildirim olarak kullanın.
         NOT: Bulutlu bir süspansiyon genellikle çok konsantredir.
   4. İlk taşıyıcı numuneyi sitometreye yükleyin ve kayda başlayın.
   5. Hem SSC hem de floresan kanallarından kaynaklanan olay sayılarını karşılaştırın; bunlar yaklaşık olarak eşit olmalıdır (<% 10 fark). Değilse, sitometre ayarlarını, örneğin fotoçarpan tüp (PMT) ayarlarını ve floresan kanal için lazer yoğunluğunu kontrol edin. Alternatif olarak, taşıyıcıların floresan etiketlemesinin mevcut ve düzgün olduğunu doğrulamak için konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemleri kullanın.
   6. 2.1.3-2.1.5 arasındaki adımları stoktan farklı seyreltmelerle iki veya daha fazla kez tekrarlayın. Her örneklemdeki olay sayısının, arka plan olay sayısından en az bir büyüklük sırası daha yüksek olduğundan emin olun.
   7. Üç veya daha fazla numunenin doğrusal bir eğilim gösterdiğini, yani iki katlı bir numune seyreltmesinin, ölçülen taşıyıcı konsantrasyonunda karşılık gelen iki kat azalmaya neden olması gerektiğini doğrulayın.
   8. Denklem (1)'e göre stok taşıyıcı konsantrasyonunu hesaplamak için doğrusal aralıktaki numuneleri, karşılık gelen seyreltme faktörlerini ve bilinen sitometre akış hızını kullanın:
      (1)
      burada C , taşıyıcılar / mL'deki stok taşıyıcı konsantrasyonudur. Floresan yerine optik saçılma algılamasından türetilen olay sayısının kullanılması önerilir.
2. Taşıyıcı başına floresan yoğunluğunun belirlenmesi de dahil olmak üzere taşıyıcı-hücre deneyinin akış sitometrisi okuması
   NOT: İdeal olarak, taşıyıcı başına floresan yoğunluğu, taşıyıcı-hücre deneyine mümkün olduğunca yakın bir şekilde belirlenecektir. Bu, bireysel taşıyıcılar için elde edilen MFI'ların, taşıyıcılarla ilişkili hücrelerin MFI'leriyle doğrudan karşılaştırılabilmesini sağlamak içindir. Uygulamada, bir sitometre genellikle aynı PMT voltajlarını kullanarak ardışık günlerde kullanıldığında benzer sonuçlar üretecektir, ancak bu garanti edilemez.
   1. Taşıyıcı hücre deneyini tasarlayın. İstenilen taşıyıcı dozunu uygulamak için adım 2.1'de belirlenen taşıyıcı konsantrasyonunu kullanın.
   2. İlgili kanallarda optimal PMT voltaj ayarlarını belirleyerek son taşıyıcı-hücre deneyi için akış sitometresini kurun. Eşikleri, taşıyıcı algılamaya izin verecek şekilde ayarlayın.
   3. Mevcut PMT ayarları altında taşıyıcı başına floresan yoğunluğunu belirlemek için taşıyıcıları süspansiyonda çalıştırın.
   4. Gerekirse, taşıyıcıları değil, hücreleri tespit etmek için sitometre eşiklerini değiştirin.
   5. Hücrelerin arka plan floresansını (otofloresan) belirlemek için taşıyıcılarla inkübe edilmemiş negatif bir kontrol numunesi (hücreler) çalıştırın.
   6. Hücre başına floresan yoğunluğunu belirlemek için taşıyıcı hücre örneklerini çalıştırın. Bu floresan, hücresel otofloresan ve floresan taşıyıcıların varlığının doğrusal bir kombinasyonudur.
   7. Aşağıdaki denklemi kullanarak hücre başına taşıyıcı sayısını hesaplayın (2):
      (2)
      burada P_assoc, hücre başına ilişkili taşıyıcıların sayısıdır, FI _hücresi, taşıyıcılarla inkübe edilen hücrelerin MFI'sidir, FI _{arka planı}, taşıyıcılarla inkübe edilmemiş hücrelerin MFI'sidir ve FI taşıyıcısı, süspansiyondaki _{taşıyıcıların} MFI'sidir.

3. Toplu Akış

1. Taşıyıcı sayımı: nanopartikül izleme analizi
   NOT: Toplu Akışta, taşıyıcı sayımı, taşıyıcı başına mutlak floresan yoğunluğunu ölçmek için gerekli bir adımdır (bkz. adım 3.1.4). Ek olarak, süspansiyondaki taşıyıcıların sayılması, her hücre deneyinde inkübe edilen taşıyıcı sayısının doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde belirlenmesini sağlar.
   1. Hazırlık
      1. Akış hücresini lazer modüle monte edin ve tüm lazer modülünü cihazın içindeki yerine kilitleyin.
      2. Yavaşça (0,1 mL/sn'den daha hızlı değil) akış hücresini ~1 mL damıtılmış su ile yıkayın. Akış hücresi içinde kabarcıklar oluşursa, devam etmeden önce kabarcığı hava-sıvı arayüzü ile birleştirmek için süspansiyonu kısmen geri çekin.
      3. Kamerayı kızarma işleminin yaklaşık yarısına kadar başlatın; taşıyıcı kalıntıların yıkandığını onayladığınızdan emin olun. Yakalama Ayarları sekmesini açmak için Yakala'yı seçin ve Kamerayı Başlat'ı tıklatın.
      4. Sistemi 1 mL hava ile kurulayın. Ekranda herhangi bir statik taşıyıcı görünüyorsa, akış hücresini üreticinin talimatlarına göre temizleyin.
      5. İlgili taşıyıcı sisteme bağlı olarak, taşıyıcıların vorteks veya sonikasyon yoluyla iyi bir şekilde askıya alınmasını sağlayarak taşıyıcıları Nanopartikül İzleme Analizi için hazırlayın. Stok konsantrasyonunun büyüklük sırası bilinmiyorsa, stoktan 1:100'lük bir seyreltme hazırlayın ve gelecekteki numune seyreltmelerini bildirmek için ilk sonuçları geri bildirim olarak kullanın. Taşıyıcıları fosfat tamponlu salin (PBS) yerine suda seyrelterek her numunenin en az ~ 0.6-1 mL'sini 1 ila 10 10 7 taşıyıcı / mL ile 1 ×^{10 9} taşıyıcı / mL arasında bir taşıyıcı konsantrasyona sahip ×.
         NOT: Bulutlu bir süspansiyon genellikle çok konsantredir. Tamponlar ve tuzlar yüksek arka plan gürültüsü oluşturabilir.
   2. Ölçüm
      1. Lazer Modül'ü çıkarın ve dik olarak yerleştirin.
      2. İlk taşıyıcı numuneyi 1 mL'lik bir şırıngaya hazırlayın. Şırıngayı tüp girişine takın ve numuneyi akış hücresine dikkatlice yükleyin. Akış hücresi içinde kabarcıklar oluşursa, devam etmeden önce kabarcığı hava-sıvı arayüzü ile birleştirmek için süspansiyonu kısmen geri çekin. Tüm akış hücresinin sıvı ile dolu olduğundan emin olun, ardından duraklatın.
      3. Tek tek taşıyıcıları görselleştirmek için gerekirse kamera odağını ayarlayın. Cihazın sağ tarafındaki dönen düğme ile kaba odak ayarlamaları yapın. Donanım sekmesini seçerek daha ince ayarlamalar yapın | Pompalar/Sahne. Netleme kaydırıcısını ayarlayarak odağı değiştirin.
      4. Aşırı doygunluk olmadığından emin olmak için kamera seviyesini ayarlayın. Yakala sekmesinde, kaydırıcıyı ayarlayarak en uygun Kamera Düzeyini seçin.
      5. Cihaz bu aksesuarla donatılmışsa, ölçümler sırasında sürekli numune akışını sağlamak için taşıyıcı numuneyi içeren şırıngayı Şırınga Pompasına yükleyin.
      6. SÇP sekmesi altında, her biri 30 sn'lik beş yakalama yapmak için Standart Ölçüm'ü seçin. Temel dosya adını girin ve isterseniz, Gelişmiş düğmesini tıklatarak ek örnek bilgileri ekleyin (çeşitli seçeneklerle kalıcı bir iletişim kutusu açar).
         NOT: Bir seyreltme faktörü girilirse, son taşıyıcı konsantrasyon ölçümü yazılım tarafından otomatik olarak ayarlanacaktır. Bu faktörün girilmesine karşı tavsiye edilir. Bunun yerine, ayarlamayı manuel olarak gerçekleştirin, bu da analizi kolaylaştırır ve her seyreltmenin cihazın dinamik aralığına girip girmediğinin değerlendirilmesine olanak tanır (adım 3.1.3.4).
      7. Komut Dosyası Oluştur ve Çalıştır'a basın ve Lütfen örneği ilerletin seçeneğini soran bir açılır pencerenin görünmesini bekleyin.
      8. Şırınga Pompası kullanıyorsanız, Donanım sekmesini seçin | Şırınga Pompası sekmesi | İnfüzyon Hızını 30-80 olarak ayarlayın ve Infuse tuşuna basın. Şırınga Pompasını kullanmıyorsanız, numuneyi manuel olarak ilerletin.
      9. Yakalamaya başlamak için açılır pencerede Tamam'ı seçin. Beş yakalamanın her birinden sonra, Lütfen önceden örnek açılır penceresi yeniden göründüğünde, numunenin akış hücresinde manuel olarak veya Şırınga Pompası aracılığıyla hala hareket edip etmediğini kontrol edin. Ardından, bir sonraki yakalamaya devam etmek için Tamam'ı seçin.
         NOT: Beş yakalamadan sonra, yazılım otomatik olarak İşlem sekmesini açar ve işlem ayarlarını yapmanızı isteyen bir açılır pencere açar.
   3. Analiz
      1. İşlem sekmesinde, ekranda görünen farklı taşıyıcıları doğru şekilde tanımlamak için Algılama Eşiği kaydırıcısını (4 ile 8 arasında) ayarlayın. Görselleştirmeye yardımcı olmak için Ekran Kazancı'nı da ayarlayın; aşağı akış analizini etkilemeyecektir. Algılama eşiği ayarına yardımcı olmak üzere videonun birden çok karesi arasında gezinmek için yakalama ekranının altındaki kaydırıcıyı kullanın.
         NOT: Algılama eşiği bir kez ayarlanmalı ve daha sonra ölçümler veya numuneler arasında değiştirilmemelidir.
      2. Açılır pencerede (3.1.2.9 adımından sonra not alın), izleme analizini başlatmak için Tamam'a basın. Analiz sekmesine tıklayarak analizin ilerlemesini izleyin | Tek Analiz sekmesi.
      3. Analiz tamamlandıktan sonra, varsayılan olarak PDF Ekle ve Deneme Özetini Dahil Et'in seçili olması gereken bir Dışa Aktarma Ayarları isteminin görünmesine bakın. İstediğiniz gibi diğer dışa aktarma biçimlerini seçin.
      4. PDF veri dışa aktarımının Sonuçlar bölümünde, ölçülen konsantrasyonun güvenilir olduğundan emin olmak için, ölçülen taşıyıcı konsantrasyonunun 1 ila 10 10⁷ taşıyıcı/mL ile 1 ×× 10⁹ taşıyıcı/mL (cihazın dinamik aralığı) arasında olduğunu doğrulayın ve konsantrasyon ölçüm sonucunun altında herhangi bir hata mesajı veya uyarı mesajı olup olmadığını kontrol edin.
      5. 3.1.2.1-3.1.3.4 arasındaki adımları stoktan farklı seyreltmelerle iki veya daha fazla kez tekrarlayın. Her numunenin konsantrasyonunun cihazın doğrusal aralığına düştüğünden emin olun.
      6. Doğrusal bir eğilim gösteren üç veya daha fazla numune seçin, yani iki katlı bir numune seyreltmesi, ölçülen taşıyıcı konsantrasyonunda karşılık gelen iki kat azalmaya neden olmalıdır. Stok taşıyıcı konsantrasyonunu hesaplamak için seçilen numuneleri ve ilgili seyreltme faktörlerini kullanın.
   4. Taşıyıcı başına mutlak floresan yoğunluğunun belirlenmesi
      NOT: Bu akıştaki bireysel taşıyıcıların floresansı doğrudan karakterize edilemediğinden, floresan yoğunluğu toplu olarak ölçülür. Bu yöntem, floresan yoğunluğunun Lambert-Beer yasasına göre florokrom konsantrasyonu ile doğrusal olarak ilişkili olduğu gerçeğine dayanır. Süspansiyondaki taşıyıcıların bu tür toplu miktarları, bilinen taşıyıcı konsantrasyonunun bir süspansiyonu üzerinde yapıldığında (bkz. adım 3.1), taşıyıcı başına floresan elde edilebilir. Bu adım bir floresan plaka okuyucu veya bir spektroflorometre üzerinde yapılabilir. Floresan yoğunluğu, MESF sayısı olarak verilen, bilinen mutlak floresanlı numunelerin standart bir eğrisiyle karşılaştırılır.
      1. Taşıyıcıyı etiketlemek için serbest florokromdan bir çözelti kullanın: boyayı uygun tamponda (örneğin, DMSO) yeniden askıya alın ve taşıyıcı seyreltici ile aynı tamponda daha fazla seyreltme gerçekleştirin. Alternatif olarak, florokroma konjuge edilmiş bir antikor çözeltisi kullanın. Denklem (3) kullanarak mg / mL cinsinden konsantrasyondan, mg / mol cinsinden moleküler ağırlıktan ve Avogadro sayısından stok çözeltisinin (MESF / mL) konsantrasyonunu hesaplayın. Standart eğri numuneleri oluşturmak için taşıyıcı seyrelticide seri seyreltme gerçekleştirin.
         (3)
         NOT: Florokrom konjuge bir antikoru, yalnızca etiketleme derecesi, yani çözeltideki florokrom ve antikor arasındaki molar oran biliniyorsa kullanın. Başlangıçta, taşıyıcı numunenin floresan yoğunluğu hala bilinmediğinden, geniş bir aralıkta standart bir eğri oluşturun. Buradan, gerekli aralığı içerecek şekilde daraltın.
      2. Taşıyıcı numuneleri hazırlayın.
         NOT: En iyi uygulama, ölçümlerin doğrusal olduğunu ve standart eğri aralığına girdiğini doğrulamak için iki veya daha fazla taşıyıcı seyreltmesini test etmektir.
      3. Her numunenin eşit hacimlerinin, yani hem taşıyıcı hem de standart eğrilerin floresansını ölçün.
      4. Standart bir eğri oluşturun ve ölçülen taşıyıcı numuneler için MESF/mL cinsinden toplu mutlak floresan yoğunluğunu düşürün.
      5. Taşıyıcı başına mutlak floresan yoğunluğunu (MESF/taşıyıcı) kütle floresansını (MESF/mL) denklemdeki (4) gibi taşıyıcı konsantrasyonuna (taşıyıcılar/mL) bölerek hesaplayın:
         (4)
   5. Hücre deneyi (taşıyıcı başına eşdeğer floresan yoğunluğunun belirlenmesi dahil)
      NOT: Bu adımda, MESF ve MFI arasındaki ilişkinin standart bir eğrisini oluşturmak için akış sitometrisi kantitasyon boncukları kullanılır. Bu kantitasyon boncukları, boncuk başına bilinen sayıda MESF'ye sahip çoklu boncuk popülasyonlarından oluşur ve bu bireysel boncuklar herhangi bir sitometre ile tespit edilebilir. İdeal olarak, MESF standart eğrisi, taşıyıcı hücre deneylerinin okunmasıyla aynı anda belirlenir. Bu, tek tek taşıyıcılar için hesaplanan MFI değerlerinin, taşıyıcılarla ilişkili hücrelerin MFI'si ile doğrudan karşılaştırılabilmesini sağlamak içindir. Uygulamada, bir sitometre genellikle aynı PMT voltajlarını kullanarak ardışık günlerde kullanıldığında benzer sonuçlar üretecektir, ancak bu garanti edilemez.
      1. Taşıyıcı hücre deneyini tasarlayın. İstenilen taşıyıcı dozunu uygulamak için bölüm 3.1.3'te belirlenen taşıyıcı konsantrasyonunu kullanın.
      2. İlgili kanallarda optimal PMT voltaj ayarlarını belirleyerek son taşıyıcı-hücre deneyi için akış sitometresini kurun.
      3. Arka plan floresansını belirlemek için negatif bir kontrol örneği, yani taşıyıcılarla inkübe edilmemiş hücreler çalıştırın.
      4. Akış sitometrisi kantitasyon boncuklarını hazırlayın ve yeniden askıya alın. Hücre örnekleri için kullanılanla aynı arabelleği kullanın (örneğin, PBS). Boncuk popülasyonları ayrı ayrı sağlanmışsa, bunları bir araya getirin.
      5. Akış sitometrisi kantitasyon boncuk örneğini çalıştırın.
      6. Hücre başına floresan yoğunluğunu belirlemek için taşıyıcı hücre örneklerini çalıştırın.
      7. Mutlak floresan yoğunluğunu (MESF) MFI'ye dönüştüren standart bir eğri oluşturmak için kantitasyon boncuk örneğini kullanın. Taşıyıcıların teorik MFI'sini hesaplamak için bu standart eğriyi ve adım 3.1.4'ün sonuçlarını kullanın. Denklem (5) kullanarak hücre başına taşıyıcı sayısını hesaplayın:
         (5)
         P_assoc'un hücre başına ilişkili taşıyıcıların sayısı olduğu durumlarda, FI _hücresi taşıyıcılarla inkübe edilen hücrelerin MFI'sidir, FI _{arka planı} taşıyıcılarla inkübe edilmemiş hücrelerin MFI'sidir ve FI taşıyıcısı, süspansiyondaki _{taşıyıcıların} hesaplanan MFI'sidir (adım 3.1.4).

Results

Daha önce tartışıldığı gibi, farklı ilaç taşıyıcı tipleri, hücre-taşıyıcı ilişkisinin mutlak niceliği için farklı tekniklerin kullanılmasını gerektirir. Örneğin, 633 nm disülfür stabilize poli (metakrilik asit) (PMA_SH) çekirdek kabuk parçacıkları, hassas bir akış sitometresi kullanılarak tespit edilebilecek kadar büyük ve yoğundur. Bu nedenle, bu parçacıklar floresan olarak etiketlendi, daha sonra yan açılı ışık saçılması (SALS, SSC'ye benzer) ve uygun floresan kanalı (Şekil 3) ku...

Discussion

İlaç taşıyıcıları ve hücreler arasındaki etkileşimlerin karakterize edilmesi, yeni ilaç dağıtım sistemlerinin geliştirilmesinde giderek daha önemli hale gelmektedir. Spesifik olarak, çeşitli taşıyıcı yapıların rasyonel olarak değerlendirilmesine ve karşılaştırılmasına izin vermek için, söz konusu taşıyıcının hedef ve hedef dışı hücrelerle etkileşime girme performansının mutlak olarak ölçülmesi kritik öneme sahiptir. Bu protokol, bir ilaç taşıyıcısı ile çalışan herhangi bir araştırmacının, hücre-taşıyıcı ilişkisi hakkında...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	150 nm, 235 nm veya 633 nm PMASH taşıyıcıları etiketlemek için kullanılan pH stabil boya; Hücre-taşıyıcı ilişkilendirme çalışmalarında kullanılacak iyi boya örneği
Apogee A50 Mikro Akış	Apogee		Saymak için küçük taşıyıcıları tespit edebilen hassas akış sitometresi
CytoFLEX S Akış Sitometresi Beckman	Coulter		Son hücre bariyeri deneyleri için sayma ve okuma için küçük taşıyıcıları tespit edebilen hassas akış sitometresi
FCS Express	De Novo Yazılım		Akış sitometrisi verilerini analiz etmek, yani geçit yapmak ve tercih edilen popülasyonların medyan floresan yoğunluk değerlerini türetmek için kullanılan yazılım. Alternatifler arasında FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Çözeltideki taşıyıcıların toplu floresan ölçümleri için kullanılan standart mikroplaka okuyucu cihazı
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Daha az hassas akış sitometresi, ancak araştırmacılar için daha genel olarak kullanılabilen bir tane daha var. Son hücre taşıyıcı deneyini okumak için kullanılabilir
: NanoSight NS300	Nanopartikül İzleme Analizi için kullanılan	Malvern Panalitik
, Prism 8	GraphPad		Yazılımı. Alternatifler arasında Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python ve diğerleri arasında
Quantum MESF kitleri, Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Akış sitometresi için mutlak kantitasyon boncukları bulunur. Bir mikroplaka okuyucuda toplu olarak ölçülen floresan yoğunluklarını, MESF standardı kullanılarak bir akış sitometresinde ölçülen floresan yoğunluklarına dönüştürmek için kullanılır