Yöntem makalesi

ImageJ Kullanarak Salmonella'nın Hücre İçi Fenotiplerinin Otomatik Analizi

DOI:

10.3791/64263

⸱

9 Ağustos 2022

 ,  , 
1Risk Analysis and Genomic Epidemiology Unit, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna (IZSLER)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salmonella, hem Salmonella'ya özgü vakuollerde hem de sitosolde serbest (hiper-replikasyon) bağırsak epitel hücrelerinin içinde istila eder ve çoğalır. Burada, Salmonella'nın hücre içi fenotiplerini ImageJ aracılığıyla iki tamamlayıcı görüntü analizi ile ölçmek, tek hücreli çözünürlüğe ve puanlamaya ulaşmak için yüksek verimli floresan mikroskopi tabanlı bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salmonella, bağırsak epitelini istila edebilen ve enterositlerde hem Salmonella'ya özgü vakuollerin içinde hem de sitozolde serbest (sitozolik hiper-replikasyon) çoğalabilen enterik bir patojendir. Hücre içi replikasyonun bu farklı fenotipleri patogenezin farklı yolaklarına yol açar, yani sitozolik hiper-replikasyon inflamatuar hücre ölümünü ve bağırsak lümenine ekstrüzyonu indüklerken, vakuolar replikasyon transepitel penetrasyonuna ve sistemik yayılmaya yol açar. mCherry ve GFP'nin diferansiyel ekspresyonu ile vakuoler ve sitozolik bakteriler arasında ayrıma izin veren pCHAR-Duo floresan muhabir plazmidi gibi istila edilmiş hücreler içindeki Salmonella'nın davranışını incelemek için mikroskopi araçları oluşturmak için önemli çaba sarf edilmiştir. Bununla birlikte, hücre içi fenotipler genellikle manuel olarak puanlanır, analizi az sayıda örnek ve hücreyle sınırlayan zaman alıcı bir prosedürdür. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, serbestçe kullanılabilen bir görüntü analiz yazılımı olan ImageJ kullanılarak iki tamamlayıcı ve otomatik görüntü analizi geliştirilmiştir. Yüksek verimli protokolde, epitel hücreleri, 96 delikli plakalar kullanılarak pCHAR-Duo taşıyan Salmonella ile enfekte edildi. Görüntüleme otomatik floresan mikroskobu kullanılarak yapıldı. Daha sonra, Salmonella'nın hücre içi davranışını farklı detay seviyelerinde ölçmek için iki görüntü analiz yöntemi uygulandı. İlk yöntem, genel hücre içi bakteri yükünü ve sitozolik hiper-replikasyonun derecesini ölçer. Hızlıdır ve çok sayıda hücre ve numunenin puanlanmasına izin verir, bu da tarama deneyleri gibi yüksek verimli testler için uygun hale getirir. İkinci yöntem, enfekte hücrelerin yüzdesini, Salmonella'nın ortalama vakuolar yükünü ve epitel hücreleri içindeki Salmonella davranışı hakkında daha fazla ayrıntı veren sitozolik hiper-replikasyon oranını belirlemek için tek hücreli analiz gerçekleştirir. Protokoller, Salmonella-enterosit etkileşiminin ana adımlarının toplu analizlerini otomatik olarak çalıştırmak için özel olarak tasarlanmış ImageJ komut dosyaları tarafından gerçekleştirilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salmonella, Avrupa Birliği'nde gıda kaynaklı hastalık salgınlarına neden olan en sık bildirilen bakteriyel ajandır1. Salmonella enfeksiyonunun birincil patolojik belirtisi, yutulmayı takiben bağırsaktaki patojen davranışın ve bunun sonucunda ortaya çıkan lokal enflamatuar yanıtın sonucu olan enterittir2. Bununla birlikte, Salmonella ayrıca ekstra-intestinal bölgelere yayılabilir ve özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış bireylerde sistemik enfeksiyona neden olabilir. Salmonella ve bağırsak epiteli arasındaki etkileşim tipi, enfeksiyonun sonucunu şartlandırır. Bağırsak lümenine girdikten sonra, Salmonella bağırsak epitel hücrelerinin içinde istila eder ve çoğalır. Hücre içi düzeyde, Salmonella iki farklı replikasyon fenotipi, sitozolik hiper-replikasyon ve Salmonella içeren vakuoller (SCV'ler) içinde intravakuoler yavaş replikasyon sunabilir. Sitozolik hiper-replikasyon, inflamatuar konakçı hücre ölümünü ve bağırsak lümenine Salmonella ekstrüzyonunu indükler3; vakuolar replikasyon transepitel penetrasyonuna ve sistemik yayılıma yol açar4. Bu nedenle, invazyon ve vakuolar ve sitozolik replikasyonun derecesi enfeksiyonun seyrini etkiler.

Salmonella cinsi, farklı konakçı aralıklarına ve hastalığa neden olma yeteneklerine sahip binlerce serotip de dahil olmak üzere çok çeşitlidir. Örneğin, S. Typhimurium, genelci bir serovar olarak tanımlanır, çünkü birden fazla ilgisiz konağı enfekte eder ve insan salmonellozunun ana nedenlerinden birini temsil eder. Farklı olarak, S. Derbi, çoğunlukla domuzdan izole edildiği için domuz adaptasyonlu bir serovar olarak kabul edilir, ancak aynı zamanda insan enfeksiyonundan sorumlu serovarların ilk beşinde de bildirilmiştir1. Bununla birlikte, epitel hücrelerinin içindeki bakteriyel davranış hakkındaki bilgi, esasen S olarak birkaç referans suşunun incelenmesiyle sınırlıdır. Typhimurium SL1344, Salmonella patojenitesinin geniş doğal çeşitliliğini temsil etmez. Farklı Salmonella suşlarının epitel hücreleri ile etkileşimini karakterize etmek, farklı patojenitelerinin anlaşılmasına katkıda bulunacaktır. Bu nedenle, çok sayıda suşun hücre içi davranışını hızlı ve büyük ölçüde otomatik bir şekilde analiz etmek için yüksek verimli floresan mikroskopi tabanlı bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokolde 96 delikli görüntüleme plakalarında epitel hücrelerinin enfeksiyonu gerçekleştirilmiş ve otomatik floresan mikroskobu kullanılarak görüntü elde edilmiştir. pCHAR-Duo plazmid, floresan mikroskopi5 ile epitel hücreleri içindeki Salmonella'nın invazyon ve replikasyon fenotiplerini gözlemlemek için kullanıldı. Bu plazmid, dönüştürülmüş tüm bakteri hücreleri tarafından yapısal olarak eksprese edilen kırmızı floresan muhabir mCherry'yi kodlayan geni ve ekspresyonu sadece ökaryotik hücrelerin sitosolünde bulunan ve SCV'lerde bulunmayan glikoz-6-fosfat tarafından aktive edilen yeşil floresan muhabir GFP'yi kodlayan geni taşır. Bu nedenle, plazmid, mCherry ve GFP muhabirlerinin diferansiyel ekspresyonu ile vakuoler ve sitozolik bakteriler arasında ayrım yapılmasına izin verir.

Mikroskopi görüntülerindeki vakuolar ve sitozolik bakteriler genellikle manuel puanlama6 ile ölçülür, ancak bu, analizi az sayıda numuneyle sınırlayan zaman alıcı bir yöntemdir. Bu nedenle, ücretsiz olarak kullanılabilen bir görüntü analiz yazılımı olan ImageJ7 kullanılarak iki tamamlayıcı ve otomatik görüntü analizi geliştirildi - alan analizi ve tek hücreli analiz. Alan analizi, elde edilen her mikroskopi görüntüsünde epitel hücreleri, kırmızı ve yeşil Salmonellae tarafından işgal edilen alanların verilerini kullanarak genel hücre içi bakteri yükünü ve sitozolik hiper-replikasyonun derecesini ölçer. Bu yöntem düşük büyütme ile elde edilen görüntülere uygulanabilir; bu nedenle, az sayıda görüntüyle çok sayıda epitel hücresinin puanlanmasına izin vererek edinme süresini kısaltır. Tek hücreli analiz, enfekte hücrelerin yüzdesini, ortalama vakuolar yükü ve tek hücreli çözünürlükte sitozolik hiper-replikasyon geçiren enfekte hücrelerin yüzdesini belirlemek için hücre segmentasyonunu kullanır.

Bu protokolde, görüntü analizinin tüm adımları manuel olarak gerçekleştirilmek üzere ayrıntılı olarak açıklanmıştır, ancak aynı analiz özel olarak tasarlanmış ImageJ komut dosyalarımız tarafından otomatikleştirilebilir. Bu komut dosyaları ayrıca birden fazla görüntüyü otomatik olarak analiz etmek için toplu analizler çalıştırmaya izin verir ve böylece yöntemin yürütülmesini hızlandırır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Epitel hücrelerinin pCHAR-Duo muhabir plazmidi taşıyan Salmonella ile enfeksiyonu

NOT: Çok kanallı pipet önerilir.

  1. Kullanmadan hemen önce siyah duvarlı ve düz cam tabanlı 96 kuyucuklu görüntüleme plakalarını kolajenle kaplayın.
    1. 20 mM'lik bir asetik asit çözeltisi elde etmek için buzul asetik asidi (17. 4 M) kimyasal bir başlık altında steril demineralize suda seyreltin. Steril koşullar altında, çözeltiyi 0,2 μm gözenek boyutuna sahip bir şırınga filtresinden süzün. Çözeltiyi 5 dakika boyunca 0-4 °C'lik bir rafta bırakın.
    2. Önceden soğutulmuş 20 mM asetik asit çözeltisinde 3 mg/mL kollajen stoğunu 50 μg/mL'ye kadar seyreltin. 10 kez ters çevirerek karıştırın ve daha sonra kollajen jelleşmesini önlemek için çözeltiyi 0-4 ° C'lik bir rafta tutarak kuyucuk başına 30 μL kollajen çözeltisi (5 μg kolajen /cm2) dağıtın.
    3. Kuyu tabanlarının tamamen kollajenle kaplandığından emin olun ve ardından plakayı oda sıcaklığında (RT) 1 saat laminer akış altında bırakın.
    4. Çözeltiyi nazikçe çıkarın ve 30 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç yıkama yapın. Kollajen ayrılmasını önlemek için çok kanallı 100 μL veya 50 μL pipet kullanın.
  2. Culture INT407 kollajen kaplı görüntüleme plakalarındaki epitel hücreleri, enfeksiyondan 20-24 saat önce.
    1. Minimum Esansiyel Ortamdaki 25cm2 şişelerdeki INT407 hücrelerini, fetal sığır serumunun (FBS) %10'u ile rutin olarak kültürlemek, bundan böyle tanımlanacak Kültür Ortamı (CM), penisilin 100 U / mL ve streptomisin 100 μg / mL (Pen / Strep) ile desteklenmiştir.
    2. INT407 şişelerini 5 mL PBS ile iki kez yıkayın ve daha sonra enfeksiyondan 20-24 saat önce nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 3-5 dakika boyunca hücreleri 1 mL tripsin-EDTA çözeltisi ile ayırın. Hücreleri sayın ve CM'de 3 x 105 hücreli / mL süspansiyon hazırlayın.
    3. %100 birleşme elde etmek için kollajen kaplı görüntüleme plakalarına 100 μL hücre süspansiyonu/kuyusu dağıtın. Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için nemlendirilmiş %5 CO2 atmosferinde 1 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Daha sonra, 100 μL CM ekleyin ve nemlendirilmiş% 5 CO 2 atmosferinde enfeksiyona kadar20-24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin (adım 1.4).
      NOT: Hücre içi bakterileri görüntülemek için, Salmonella suşları, Dr. Olivia Steele-Mortimer tarafından nazikçe sağlanan pCHAR-Duo muhabir plazmidi ile dönüştürülür. Burada test edilen suşlar, protokolün kapsadığı fenotip çeşitliliğini temsil etmek ve bölüm 4'teki görüntü analizlerini doğrulamak için seçilmiştir. Bu çalışmada kullanılan suşlar hakkında daha fazla ayrıntı için temsili sonuçlara bakın.
  3. pCHAR-Duo muhabir plazmidini taşıyan Salmonella suşlarının sabit faz kültürlerini hazırlayın.
    1. Salmonella gliserol stoğunu 10 μL'lik bir pipetin ucuyla numune alın ve ampisilin 100 μg / mL ile desteklenmiş 1 mL Luria Bertani suyuna (10 g tripton, 5 g maya özü ve litre başına 10 g sodyum klorür) aşılayın.
    2. ~ 1 x 109 Koloni Oluşturma Birimi (CFU) / mL8'e karşılık gelen sabit büyüme aşamasına ulaşmak için enfeksiyondan önce 20 saat boyunca inokülumu statik olarak 37 ° C'de inkübe edin.
  4. INT407 epitel hücrelerini Salmonella ile enfekte edin.
    NOT: Enfeksiyonlar üçlü olarak gerçekleştirilir.
    1. INT407 hücrelerini 200 μL PBS/kuyucuk ile nazikçe yıkayın.
    2. Enfeksiyon çokluğu (MOI) olarak tanımlanan epitel hücresi başına istenen sayıda CFU elde etmek için CM'de bakterileri gece kültürü seyrelterek Salmonella inokulumunu hazırlayın. Burada MOI 100 kullanıldı.
    3. 200 μL / kuyucuk aşılayın ve ardından plakayı nefes alabilen bir sızdırmazlık membranı ile örtün ve nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Aşılama, enfeksiyonun sıfır zamanı olarak kabul edilir.
    4. İnokulumu çıkarın ve 200 μL PBS / kuyucuk ile nazikçe yıkayın ve ardından kuyucuk başına gentamisin 100 μg / mL ile 200 μL CM ekleyin. Plakayı nefes alabilen bir sızdırmazlık membranı ile örtün ve daha sonra nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    5. CM'yi gentamisin 100 μg / mL ile çıkarın ve 200 μL PBS / kuyucuk ile nazikçe yıkayın. Kuyucuk başına 10 μg / mL gentamisin ile 200 μL CM ekleyin, plakayı nefes alabilen bir sızdırmazlık membranı ile örtün ve daha sonra nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde 8 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.

2. Numune fiksasyonu ve epitel hücre boyama

NOT: Numunelerin doğrudan ışığa maruz kalmaktan korunmasını sağlayın. 96 kuyucuklu bir plakanın kuyuları için hacimler belirtilmiştir. Farklı hücre kültürü plakaları veya destekleri için hacim optimizasyonu gereklidir.

  1. Enfeksiyondan 8 saat sonra, CM'yi çıkarın ve 200 μL / PBS kuyucuğu ile üç kez hafifçe yıkayın. Emici kağıt üzerindeki plakayı ters çevirerek PBS'yi çıkarın; aspire etmekten kaçının.
  2. Enfekte olmuş tek katmanları RT'de 20 dakika boyunca PBS'de 100 μL / kuyucuk paraformaldehit (PFA)% 4 ile sabitleyin. PFA% 4'ü çıkarın ve 200 μL / PBS kuyucuğu ile üç kez yıkayın. Plaka 4 °C'de maksimum 16-24 saat saklanabilir. Sonraki adıma geçin.
  3. Leke epitel hücreleri.
    NOT: DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) DNA boyası (adım 2.3.1) sadece çekirdekleri boyamak için alan analizi için kullanılır ve Yüksek İçerikli Tarama (HCS) boyası (adım 2.3.2) tüm epitel hücresini boyamak için tek hücreli analiz için kullanılır. Diğer hücresel lekeler kullanılabilir, ancak görüntü toplama ve analizinin optimizasyonu gereklidir.
    1. Alan analizi: 100 μL/kuyucuk DAPI (PBS'de 300 nM çözelti) dağıtın ve RT'de ışıktan korunarak 5 dakika inkübe edin.
    2. Tek hücreli analiz: RT'de 15 dakika boyunca PBS'de 100 μL / triton 0.1x kuyucuğu ile geçirgenleştirin. PBS ile üç kez yıkayın ve PBS'de 1:2000 seyreltilmiş 100 μL / kuyucuk HCS boyası dağıtın. RT'de ışıktan korunarak 30 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Boyama solüsyonunu çıkarın ve 200 μL/kuyucuk PBS ile üç kez yıkayın. Otomatik görüntü alma için 50 μL/kuyucuk PBS ekleyin.

3. Otomatik floresan mikroskop ile görüntü alma

NOT: Burada, alan analizi için adım 3.1.1'deki düşük büyütme (10x/0,3 NA, 1 μm/piksel hedefi) ve tek hücreli analiz için adım 3.1.2'deki yüksek büyütme (40x/0,75 NA, 0,255 μm/piksel hedefi) toplama protokolünde kullanılır. Diğer büyütmeler kullanılabilir, ancak görüntü yakalama ve analizin optimizasyonu gereklidir. Mevcut mikroskop tarafından izin verilirse, görüntüleri büyük örnek alanlarını kaydetmek için fayans adı verilen bitişik alanların bir "mozaiği" olan Karo Bölgeleri (TR'ler) olarak alın. Otomatik netleme prosedürü sırasında numuneye maruz kalmayı azaltmak için her karo için bir tane ayarlamak yerine otomatik netlemeyi TR'nin ortasına ayarlayın.

  1. Referans z-pozisyonu olarak hücre boyama kanalında (HCS boyaması ve DAPI nükleer boyası için mavi kanal) yazılım otomatik odaklamasını kullanın. Hücre boyama kanalında (465 nm, hücreler veya çekirdekler) ve pCHAR-Duo muhabir kanallarında mCherry (610 nm, hücre içi Salmonella) ve GFP'de (509 nm, sitozolik hiper-replikasyon yapan Salmonella) görüntüler elde edin.
    1. Alan analizi: Görüntü ≥104 hücre/teknik çoğaltma (yani, teknik bir çoğaltmaya karşılık gelen dört karo/kuyudan oluşan en az üç TR önerilir) 10x büyütmede.
      NOT: Tek bir z-düzlemi, hem vakuolar içeren hücreleri hem de sitozolik hiper-replikasyon yapan Salmonellae içeren hücreleri 10x büyütmede görüntülemek için yeterlidir.
    2. Tek hücreli analiz: 40x büyütmede görüntü ≥1.000 hücre/teknik çoğaltma (yani, teknik bir çoğaltmaya karşılık gelen 16 karo/kuyudan oluşan en az iki TR önerilir). Hem vakuolar içeren hücreleri hem de sitozolik hiper-replikasyon yapan Salmonellae içeren hücreleri görüntülemek için çoklu z-düzlemleri gereklidir. Optimal z-yığınını tanımlayın (sekiz z-düzlemi elde etmek için 0,55 μm aralıklı 3,85 μm z-yığını, 40x'te sitozolik hiper-çoğalan Salmonellae ile enfekte olmuş INT407 hücrelerine gösterilir). Her z-düzlemi bundan böyle n/8 olarak tanımlanmıştır ve n, 1 (alttaki z-düzlemine karşılık gelir) ile 8 (üstteki z-düzlemine karşılık gelir) arasındadır.
  2. Her alımın çıktısı, tüm alanların, kanalların ve z-düzlemlerinin görüntülerini içeren Acquisition.czi adlı bir dosyadır. TR'ler alınmışsa, Dikiş yöntemi için girdi olarak tek bir Acquisition.czi dosyası kullanarak her TR'nin genel bir görüntüsünü elde etmek için kutucukları birleştirin.

4. ImageJ kullanarak görüntü analizi

NOT: Adım 4.1 ve adım 4.2, yukarıda açıklanan deney ve edinme için özel olarak tasarlanmıştır. Diğer deneysel ayarlar analizin optimizasyonunu gerektirebilir. Tek bir Acquisition.czi dosyasının analizi açıklanmaktadır. Toplu analiz için, tek hücreli çözümleme komut dosyasını ve alan çözümleme komut dosyasını ek dosyalar (Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) olarak bulun. Komut dosyalarında ve ImageJ komutlarında kullanılan etiketler aşağıdaki bölümlerde kalın yazılmıştır.

  1. Alan analizi
    1. ImageJ'de, komut dosyasında AcquisitionTitle olarak adlandırılan Acquisition.czi dosyasını açın: Dosya > Open > AcquisitionTitle.czi. Tüm kanalları gösteren bir pencere açılacaktır. Kanallar, satın alma sırasına bağlı olarak c:1-3/3 olarak gösterilir. Burada, c: 1/3 maviye (DAPI), c: 2/3'e mCherry'ye (hücre içi Salmonella) ve c: 3/3 GFP'ye (sitozolik hiper-replikasyon Salmonellae) karşılık gelir.
    2. Adım 4.1.6 ve 4.1.7'de görüntüleri alan ölçümüne hazırlamak için rastgele gürültüyü azaltın.
      1. AcquisitionTitle1 penceresini edinmek için Image > Duplicate > OK komutunu kullanarak AcquisitionTitle penceresini çoğaltın.
      2. Gauss Bulanıklaştırma İşlemi > Filtresi aracılığıyla AcquisitionTitle1>e Gauss bulanıklaştırması uygulayın. Varsayılan Sigma değerini 2 olarak bırakın ve Tamam'a tıklayın. Bir İşlem Yığını? penceresi açılacak, tüm kanalları işlemek için Evet'e tıklayın.
      3. gaussian filtrelenmiş AcquisitionTitle1 dosyasını orijinal dosyadan çıkarın AcquisitionTitle by Process > Image Calculator: AcquisitionTitle as Image1 (Resim1 olarak AcquisitionTitle) öğesini seçin, açılır listeden Çıkar işlemini seçin ve ardından Image2 olarak AcquisitionTitle1 öğesini seçin. Tamam'a tıklayın. Bir İşlem Yığını? penceresi açılacaktır. ResultsOfAcquisitionTitle penceresini edinmek üzere üç görüntüyü (kanal) de işlemek için Evet'e tıklayın.
    3. Kanalları Görüntü > Renk > Kanalları Böl aracılığıyla bölün. Artık her kanal görüntüsü ayrı bir pencerede gösteriliyor ve ImageJ tarafından otomatik olarak C-ResultsOfAcquisitionTitle olarak adlandırılıyor. Burada C1-ResultsOfAcquisitionTitle DAPI'ye, C2-ResultsOfAcquisitionTitle mCherry'ye ( hücre içi Salmonella) ve C3-ResultsOfAcquisitionTitle GFP'ye (sitozolik hiper-replikasyon Salmonella) karşılık gelir.
    4. Epitel hücre çekirdeklerinin kapladığı alanı ölçmek için C1-ResultsOfAcquisitionTitle görüntüsünü işleyin.
      1. Çekirdek alanı içinde delik olarak görünen nükleolusu homojenize etmek için İşlem > Pürüzsüz'e gidin.
      2. Image > kullanarak arka planı hariç tutmak için C1-ResultsOfAcquisitionTitle resmini eşik > Eşik Ayarla: Koyu Arka Plan'ı işaretleyin ve açılır listeden Kırmızı'yı seçin. Üçgen otomatik eşiğini ayarlayın ve ardından çekirdekler kırmızı göründüğünde ve arka plan siyah göründüğünde minimum eşik değerini ayarlamak için üst kaydırıcıyı kullanın (Eşik = 100, bu protokolde uygulanır).
        NOT: Adım 4.1.4.2, 4.1.7, 4.2.3.6.1 ve 4.2.4.3'te açıklanan otomatik eşikler, kullanıcının sırasıyla çekirdek/epitel hücreleri ve bakteriler için en uygun eşiği manuel olarak tanımlaması için bir kılavuz olarak önerilmiştir. Otomatik eşiğin değeri, komut dosyasında tanımlanan el ile eşik tarafından geçersiz kılınır. Tanımlanan manuel eşik, tüm parti analizine uygulanacaktır.
    5. Ölçümü eşiklipiksellerle sınırlamak için Analizi > Ayarla: Eşiğle Sınırla'yı işaretleyin'i kullanarak ilgilendiğiniz ölçüleri seçin. Eşikli piksellerin kapladığı toplam alana karşılık gelen Kontrol Alanı (yani, C1-ResultsOfAcquisitionTitle'daki çekirdekler, C2-ResultsOfAcquisitionTitle'daki hücre içi Salmonella, C3- ResultsOfAcquisitionTitle'daki sitozolik hiper-replikasyon Salmonellae). Sonuç tablosundaki her görüntünün edinme başlığını ve kanalını kaydetmek için Görüntü Etiketi'ni işaretleyin.
    6. Analiz > Ölç'ü kullanarak çekirdeklerin kapladığı alanı ölçün. Ölçümler otomatik olarak açılan sonuç tablosuna kaydedilir.
    7. Süreç C2-ResultsOfAcquisitionTitle ve C3-ResultsOfAcquisitionTitle sırasıyla genel hücre içi Salmonellae ve sitozolik hiper-replikasyon Salmonellae'nin kapladığı alanı ölçmek için. Bazı değişikliklerle 4.1.4-4.1.6 adımlarını izleyin: adım 4.1.4.1'deki yumuşatma adımını atlayın ve Salmonellae kırmızı ve arka plan siyah göründüğünde minimum eşik değerini (üst kaydırıcı) ayarlamak için bir kılavuz olarak adım 4.1.4.2'deki Üçgen yerine Otsu otomatik eşiğini kullanın (Eşik = 200 önerilir).
    8. Sonuç tablosunu Dosya > Farklı Kaydet > Tüm Dosyaları kullanarak kaydedin.
    9. Analiz edilen her AcquisitionTitle dosyası için alan oranlarını hesaplamak üzere bir e-tabloda Sonuç tablosunu açın:
      1. Enfeksiyon oranını hesaplayın: toplam hücre içi Salmonella'nın (burada kırmızı kanal, C2-) kapladığı alanı, epitel hücre çekirdeklerinin kapladığı alana bölün (burada DAPI, C1-).
      2. Hiper-replikasyon oranını hesaplayın: sitozolik hiper-replikasyon Salmonella'nın (yeşil kanal, C3-) kapladığı alanı, toplam hücre içi Salmonella'nın (kırmızı kanal, C2-) kapladığı alana bölün.
  2. Tek hücreli analiz
    1. Acquisition.czi dosyasını ImageJ'de açın, komut dosyasında AcquisitionTitle olarak adlandırılmıştır: Dosya Menüsü > Acquisition.czi'> açın. Tüm kanalların ve tüm z düzlemlerinin görüntülerini gösteren bir pencere açılacaktır.
    2. Kanalları Görüntü > Renk > Kanalları Böl'e göre bölün. Kanallar artık ImageJ tarafından otomatik olarak C-AcquisitionTitle olarak adlandırılan ayrı pencerelerde gösteriliyor. Burada, C1-AcquisitionTitle penceresi epitel hücrelerine (mavi), C2-AcquisitionTitle penceresi hücre içi Salmonellae'ye (mCherry) ve C3-AcquisitionTitle penceresi sitozolik hiper-replikasyon Salmonellae kanalına (GFP) karşılık gelir. Her C-AcquisitionTitle penceresi edinilen tüm z-düzlemlerini içerir.
    3. İşleme C1-EdinmeUnvanı epitel hücrelerine karşılık gelen pencere, segment hücrelerine.
      1. Hücre segmentasyonu için kullanılacak z düzlemi görüntüsünü seçin. C1-AcquisitionTitle penceresini seçin ve Image > Duplicate komutunu kullanın: seçilen z-düzleminin numarasını yazın (yani, z 1/8'i seçmek için 1), Başlık kutusuna C1Zplane yazın, Yığını Çoğalt'ın işaretini kaldırın ve ardından yalnızca seçilen z-düzlemi görüntüsünü çoğaltmak için Tamam'a tıklayın. Seçilen z-düzlemi görüntüsünü gösteren C1Zplane adlı bir pencere açılacaktır.
      2. Görüntü kontrastını artırmak için elde edilen C1Zplane görüntüsünü işleyin. Açık İşlem > Kontrastı Artırın: doymuş pikselleri ayarlayın (yani, burada% 1 kullanılır) ve Normalleştir'i işaretleyin. Ardından, kontrast normalleştirilmiş bir C1Zplane görüntüsü elde etmek üzere kontrast geliştirme tekniğini uygulamak için Tamam'a tıklayın.
      3. Epitel hücrelerini segmentlere ayırmak için kontrast normalleştirilmiş C1Zplane görüntüsünü işleyin. FindMaxima menüsünü açmak için İşlem > Bul Maxima'yı kullanın: ilk olarak, her bir epitel hücresine yalnızca bir maksimuma noktası atfetmek üzere Gürültü Toleransı'nı ayarlamak için Önizleme Noktası Seçimi'ni işaretleyin. Şikayet Kenar Maxima'yı Hariç Tut. Çıkış tipi Segmente Parçacıklar'ı seçin ve işaretlenmiş maksimum noktası başına her parçalanmış parçacığı gösteren yeni bir ikili maske benzeri görüntü olan C1ZplaneSegmented'i elde etmek için Tamam'a tıklayın.
        NOT: Find Maxima ImageJ algoritması, hücreleri segmentlere ayırmak için kullanılır. Maxima noktaları (piksel yoğunluğu zirveleri) görüntü boyunca algılanır ve potansiyel olarak hücrelere karşılık gelir. Bir gürültü eşiği (gürültü toleransı) ayarlanır ve maksimuma noktalarının etrafındaki bitişik alan, maksimum noktası başına her bir parçalanmış parçacığı, dolayısıyla her hücreyi tanımlayan ikili maske benzeri bir görüntü oluşturmak için analiz edilir.
      4. Parçalı hücrelerin maskesini oluşturmak için C1ZplaneSegmented görüntüsünü işleyin. Parçacıkları Analiz > Analiz Et'i kullanın: Maskeleri Göster ve Kenarlarda Hariç Tut seçeneğini belirleyin. Hücre kümeleri ve hücre kesirleri gibi yanlış bölümlere ayrılmış nesneleri dışlamak için Size parametresine karşılık gelen maskeye dahil edilecek parçacıkların alan aralığını ayarlayın. Hatalı şekilde bölümlere ayrılmış nesnelerin alanını puanlamak için, araç çubuğundaki Değnek izleme aracını kullanın: Değnek ile parçacığı seçin ve ardından hatalı nesnelerin alanını ölçmek için Analiz > Ölçü'yü açın. Boyut aralığını ayarlayın (önerilen aralık 250-1700 piksel2) ve MaskofC1ZplaneSegmented ikili maskesini edinmek için Tamam'a tıklayın.
      5. Varsayılan olarak, MaskOfC1ZplaneSegmented ikili maskesinin ters çeviren bir LUT'u vardır. Araç çubuğunda LUT'u Ters Çevir > LUT'u kullanın.
      6. Hücre segmentasyonunu düzeltmek için MaskOfC1ZplaneSegmented ikili maskesini işleyin:
        1. Adım 4.2.3.2'de elde edilen eşik kontrastlı normalleştirilmiş C1Zplane görüntüsü. Resim > > Eşiğini Ayarla: Koyu Arka Plan'ı işaretleyin. Varsayılan otomatik eşik ayarını belirleyin. Kırmızı seçeneğini belirleyin ve hücreler koyu arka plan bırakarak tamamen kırmızı görünene kadar minimum kesme değerini (üst çubuk) ayarlayın (Eşik = bu protokolde uygulanan 8.000). Ardından, kontrast normalleştirilmiş C1Zplane görüntüsünü, beyaz ve arka planı siyah olan ikili bir görüntüye dönüştürmek için Uygula'ya tıklayın.
        2. MaskOfC1ZplaneSegmented ikili maskesinde doğru hücre segmentasyonu. İşlem > Görüntü Hesaplayıcısı'nı kullanın: Image1 olarak MaskOfC1ZplaneSegmented'i seçin, açılır listeden AND işlemini seçin ve ardından eşikli kontrast normalleştirilmiş C1Zplane'yi Image2 olarak seçin. Tamam'a tıklayın. Çıkış görüntüsü otomatik olarak ImageJ tarafından C1Zplane Segmente Edilmiş Maske Sonuçları olarak adlandırılır.
      7. C1Zplane Maskesinin İşlem Sonuçları, her bir tek segmentli hücreyi bir İlgi Bölgesi (ROI) olarak etiketlemek için Segmente Edilmiştir. Parçacıkları analiz > analiz et'i kullanın. Boyut'u adım 4.2.3.4'teki gibi ayarlayın ve ardından Hiçbir Şey Gösterme seçeneğini belirleyin. Tüm parçacıkları (segmentlere ayrılmış hücreler) ROI Manager aracına eklemek için Yöneticiye Ekle'yi işaretleyin. Ayrıca, Kenarlarda Hariç Tut'u da işaretleyin. Tamam'a tıklayın. YG Yöneticisi Menüsü, YG olarak tanımlanan, ilgili y ve x koordinatlarıyla benzersiz bir şekilde etiketlenmiş tüm parçacıkların (segmentlere ayrılmış hücreler) bir listesini gösterecektir.
      8. Yatırım getirisi verilerini, YG Yöneticisi Menüsü aracılığıyla ROI-cells-AcquisitionTitle olarak.zip Daha > Kaydet'e tıklayarak kaydedin. ROI-cells-AcquisitionTitle.zip, tek hücre analizi için adım 4.2.4.6'da açılacaktır.
    4. İşleme C2-AcquisitionTitle pencere (burada kırmızı kanal), hücre içine karşılık gelir Salmonellae, enfekte hücrelerin sayısını ve hücre içi vakuolar yükü ölçmek için.
      1. Sitozolik hiper-replikasyon yapan Salmonella'nın odak dışı piksellerini kaldırmak için yeşil kanalı (C3-) kırmızı kanaldan (C2-) çıkarın.
        1. İşlem > Görüntü Hesaplayıcısı'nı kullanın. Image1 olarak C2-Acquisitiontitle'ı seçin, açılır listeden Subtract işlemini seçin ve ardından Image2 olarak C3-Acquisitiontitle'ı seçin. Yeni Pencere Oluştur'u işaretleyin ve Tamam'a tıklayın.
        2. İşlem Yığınında Evet'e tıklayarak tüm z-yığınına çıkarma uygulayın? pencere. Çıktı penceresi komut dosyasında ResultsOfC2AcquisitionTitle olarak adlandırılır.
      2. Rastgele gürültüyü azaltmak için ResultsOfC2AcquisitionTitle işlemini gerçekleştirin.
        1. ResultsOfC2AcquisitionTitle penceresini Resim Menüsü'ne tıklayarak > Çoğalt. Duplicate Stack'i işaretleyin ve ResultsOfC2AcquisitionTitle1 penceresini edinmek için Tamam'a basın.
        2. Gauss Bulanıklaştırmasını İşlem > Filtresi aracılığıyla ResultsOfC2AcquisitionTitle1 penceresine Gauss Bulanıklığı > uygulayın. Sigma değerini 2 olarak bırakın veya özelleştirin (yani, burada Sigma: 4 kullanıldı). Tamam'a tıklayın ve İşlem Yığını? penceresinde Evet'e tıklayarak Gauss Blur'u tüm z-yığınına uygulayın.
        3. Gauss filtrelenmiş ResultsOfC2AcquisitionTitle1 öğesini İşlem > Image Calculator'a tıklayarak ResultsOfC2AcquisitionTitle öğesine çıkarın. ResultsOfC2AcquisitionTitle as Image1 (Resim1) öğesini seçin, açılır listeden Operation Subtract (Çıkarma İşlemi) seçeneğini belirleyin ve ardından ResultsOfC2AcquisitionTitle1 as Image2 (Resim2 olarak ResultsOfC2AcquisitionTitle1) öğesini seçin. Tamam'a tıklayın. İşlem Yığını? penceresinde Evet'e tıklayarak tüm z-yığınına çıkarma uygulayın ve ImageJ tarafından C2-AcquisitionTitle Sonuçlarının Sonuçları olarak otomatik olarak adlandırılan bir pencere elde edin.
      3. Salmonella'yı arka plandan ayırmak için C2-AcquisitionTitle Sonuçlarının Sonuçlarını işleyin. Resim > > Eşiğini Ayarla: Koyu arka plan seçeneğini işaretleyin ve Otsu otomatik eşiğini ayarlayın. Salmonellae tamamen kırmızı görünene kadar minimum kesme değerini (üst çubuk) ayarlayın ve koyu arka plan bırakın (bu protokolde uygulanan Eşik = 100). Uygula'ya tıklayın ve İkiliye Dönüştür penceresi açılacaktır: Siyah arka planı kontrol edin ve ardından Tamam'a tıklayın. Tam z-yığını artık ikili görüntülere dönüştürülür.
      4. Adım 4.2.4.3: Görüntü > Yığınları > Set Diliminden C2-AcquisitionTitle ikili penceresinin sonuçlarında vakuolar Salmonellae odak düzlemine karşılık gelen orta-Z-düzlemini seçin ve tercih edilen z-düzleminin numarasını yazın (örneğin, burada z: 4/8 kullanılır). Tamam'a tıklayın.
      5. Her YG (hücre) için kaydedilecek ölçümleri ayarlayın. Analizi Kullan > Ölçümü Ayarla: Her YG'nin toplam alanına karşılık gelen Alanı'nı kontrol edin. Her YG için yalnızca eşikli piksellerin (hücre içi Salmonella) kapladığı Alan kesirini kaydetmek için Alan Kesiri ve Eşik ile Sınırla'yı kontrol edin. Her bir YG'yi sonuç tablosundaki görüntü başlığı, kanal, z düzlemi ve x-y koordinatlarıyla etiketlemek için Görüntü Etiketi'ni işaretleyin.
      6. Hücre içi Salmonellae'nin seçilen z-düzlemini kayıt etiketlerine, Salmonellae'nin her bir hücre (ROI) için işgal ettiği Area ve %Area'ya işleyin: 4.2.3.8 adımında kaydedilen ROI-cells-AcquisitionTitle.zip dosyasını Dosya > Aç ile açın ve ROI Yöneticisi Menüsünde Ölçüm'e tıklayın. Çıktı, seçilen ölçümleri raporlayan bir tablodur.
      7. Sonuç tablosunu, sonuçlar penceresindeki Dosya > Farklı Kaydet'i kullanarak kaydedin .
      8. Bir elektronik tabloda ResultTable'ı açın: etiket Hücre içi Salmonella'nın kapladığı alan ve %Alan, x ve y koordinatlarıyla benzersiz bir şekilde tanımlanan konturlu bir hücreye karşılık gelen her ROI için belirtilir.
      9. Salmonellae'ye karşılık gelen eşikli piksellerin kapladığı %Area > 0'ı gösteren ROI'lere karşılık gelen enfekte hücrelerin sayısını ölçün (yani, burada enfekte olmuş hücreleri tanımlamak için %Alan >% 0.2 olarak kabul edilir). Ardından, enfekte olmuş hücrelerin toplam hücreler üzerindeki yüzdesini hesaplayın.
      10. Salmonella/hücrenin vakuolar yükünü, enfekte olmuş tüm hücreler için vakuolar Salmonella'nın kapladığı ortalama %Alanı'nı hesaplayarak ölçün.
    5. Sitozolik hiper-replikasyon yapan Salmonella'yı gösteren hücrelerin sayısını ölçmek için yeşil kanalı ( C3-AcquisitionTitle) işleyin. 4.2.4.2 ile 4.2.4.9 arasındaki adımları izleyin, ancak bazı değişikliklerle birlikte.
      1. Üst z-düzlemleri üzerinde çalışın (burada z: 7/8), çünkü sitozolik hiper-replikasyon gösteren hücreler tek katmandan çıkıntı yapar; bu nedenle, hiper-replikasyon Salmonellası olmayan hücrelere kıyasla farklı bir düzleme odaklanırlar.
      2. Sitozolik hiper-replikasyon yapan Salmonellae (yeşil) içeren hücrelerin sayısını, Salmonellae tarafından işgal edilen yüksek %Alan gösteren hücreleri (ROI'ler) puanlayarak ölçün (örneğin; sitozolik hiper-replikasyon yapan Salmonellae içeren hücreleri tanımlamak için %20'lik bir >% 20'lik bir alan kabul edilir). Daha sonra, sitozolik hiper replikasyon-Salmonella içeren hücrelerin yüzdesini, adım 4.2.4.9'da puanlanan enfekte hücrelerin toplamı üzerinde hesaplayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitel hücrelerinin Salmonella suşları ile enfeksiyonu
Bu protokol, epitel hücreleri içindeki Salmonella'nın hücresel invazyonu ve sitozolik replikasyonunu (Şekil 1A) ve vakuolar yükü (Şekil 1B) analiz etmek için geliştirilmiştir. Protokol, aşağıdaki üç Salmonella suşu (S) kullanılarak doğrulandı. Typhimurium SL1344 referans gerinimi (S. Tm), S. Derby ER1175 wildtype (S. Derby wt) ve S'nin izojenik mutantı Derby ER1175 sipA geni olmadan (S. Derby ΔsipA). S. Derby ER1175 suşu domuzdan izole edilmiştir ve Salmonella izolatlarının IZSLER gözetim koleksiyonuna aittir. Suşlar, protokolün kapsadığı fenotip çeşitliliğini temsil etmek için seçildi. Özellikle, bu suşlar seçildi, çünkü epitel hücreleri içindeki davranışlarının istila veya replikasyon açısından farklı olduğu zaten biliniyordu9; bu nedenle, protokolün hücre içi Salmonella fenotiplerindeki farklılıkları nicel olarak ayırt etmesine izin verip vermediğini test etmek için değerli kontrollerdi. Özellikle, S. Tm ve S. Derby wt dahil edildi çünkü daha önce S. Tm, S'den daha yüksek invazyon ve hücre içi replikasyon verimliliğine sahiptir. Derbi wt9 iken S. Derby Δ sipA, virülans efektörüSipA, hiper-replikasyonun başlangıcında çok önemli bir rol oynadığı için hiper-replikasyon bozukluğu olan bir suş olarak eklenmiştir10,11. Daha önce S için rapor edilmişti. Sitosolik replikasyonun invazyon sonrası 4 saat başladığını ve daha sonra sitozolik popülasyonun epitel hücresini 8 saat11,12 ile doldurmak için hızla hiper-çoğaldığını belirten Tm. Sürekli olarak, 8 saat uzunluğundaki enfeksiyon, S'de de sitozolik hiper-replikasyon fenotipini gözlemlemek ve ölçmek için uygundu. Derbi wt ve S. Derby ΔsipA.

Alan analizi
Adım 4.1'deki alan analizi, epitel hücrelerinin Salmonella (enfeksiyon oranı) ile genel kolonizasyonunun bir ölçümünü ve hiper-replikasyonun (hiper-replikasyon oranı) bir ölçümünü sağlar. Şekil 2'de açıklanan alan analizi iş akışında, rastgele gürültü azaltılır ve ardından kanallar bağımsız olarak bölünür ve işlenir. Arka planı alan ölçümünden hariç tutmak için her kanal için bir eşik ayarlanır. Ardından, eşikli piksellerin kapladığı alan her kanal için ölçülür. Alan analizinin çıktısı, her bir edinme dosyası için, epitel hücre çekirdeği (mavi kanal), hücre içi mCherry eksprese eden Salmonellae (kırmızı kanal) ve mCherry ile birlikte GFP'yi (yeşil kanal) eksprese eden sitozolik hiper-replikasyon Salmonellae'nin kapladığı alanların genişlemesini bildiren bir tablo raporlamasıdır. Enfeksiyon oranı, mCherry eksprese eden Salmonella'nın kapladığı alanın, konakçı hücre çekirdeklerinin kapladığı alana bölünmesiyle hesaplanır. Test edilen suşların sonuçları S. Tm, her iki S'ye kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir enfeksiyon oranı gösterir. Derbi suşları, beklendiği gibi (Şekil 3A). Bu nedenle, bu sonuçlar Salmonella suşlarının epitel hücrelerini kolonize etme kabiliyetindeki farklılıkları tespit etmede alan analizinin etkinliğini göstermektedir. Salmonella hiper-replikasyon oranı, GFP eksprese eden Salmonellae'nin kapladığı alanın, hücre içi mCherry-eksprese eden Salmonellae'nin kapladığı alana bölünmesiyle ölçülür. SipA'nın hiper replikasyonu belirlemedeki rolüyle tutarlı olarak, S için önemli ölçüde azaltılmış bir hiper replikasyon oranı. Derby ΔsipA suşu S ile karşılaştırıldığında ölçüldü. Derbi wt, (Şekil 3B). S arasında hiper-replikasyon farkı gözlenmedi. Tm ve S. Derbi wt. Genel olarak, alan analizi, tahlil edilen suşlar arasında farklı hiper-replikasyon seviyelerini etkili bir şekilde ortaya koymuştur.

Tek hücreli analiz
Tek hücreli analiz, tek hücreli çözünürlükte epitel hücreleri içindeki Salmonella invazyonu ve vakuolar yükünün sitozolik replikasyona karşı ölçülmesini sağlar. Adım 4.2'de açıklandığı gibi, her edinme dosyası için mavi, kırmızı ve yeşil kanallar bağımsız olarak işlenmiştir (Şekil 4). Spesifik olarak, epitel hücrelerine karşılık gelen mavi kanal, hücre segmentasyonunu elde etmek için adım 4.2.3'te işlendi. Ardından, segmentlere ayrılmış hücreler, y-x koordinatlarıyla benzersiz şekilde etiketlenmiş tüm segmentlere ayrılmış hücrelere karşılık gelen YG'lerin bir listesini elde etmek için İlgi Çekici Bölge (ROI) Yöneticisi'ne eklendi. GFP'yi ifade eden hiper replikasyon yapan Salmonellae'nin odak dışı piksellerini kaldırmak için, yeşil kanalın pikselleri kırmızı kanalınkilerden çıkarıldı. Tek hücreli analizin çıktı tablosu, her ROI için, yalnızca mCherry kurucu muhabirini veya GFP sitosol duyarlı muhabiri ifade eden Salmonellae tarafından işgal edilen ROI alanının alanını ve yüzdesini rapor eder. Sadece mCherry eksprese eden Salmonellae tarafından işgal edilen hücre alanının yüzdesi, enfekte hücrelerin yüzdesini ve ortalama vakuolar yükü hesaplamak için adım 4.2.4'te işlenmiştir (Şekil 5A). Vakum yükünün analizi S. Derbi suşları, S'den önemli ölçüde daha düşük ortalama bir vakuolar yük oluşturur. Tm (Şekil 5B). Tersine, S'de enfekte hücrelerin yüzdesinde sadece hafif ve anlamlı olmayan bir azalma gözlenmiştir. S. ile karşılaştırıldığında derbi suşları. Tm (Şekil 5A). GFP eksprese eden Salmonellae tarafından işgal edilen hücre alanının yüzdesi, hiper-replikasyon hızını elde etmek için adım 4.2.5'te işlendi. S arasında fark gözlenmedi. Tm ve S. Derbi wt, S. Derby Δ sipA, alan analizinin sonucu (Şekil 5C) ve SipA'nın hiper-replikasyonu indüklemedeki rolü ile tutarlı olarak hiper-replikasyonda önemli bir azalma göstermiştir.

figure-results-1
Şekil 1: Salmonella sitozolik hiperreplikasyonu ve vakuoler yük. (A) Salmonella hiper-replikasyonunun ve (B) yüksek büyütmede (40x) elde edilen vakuolar yükün temsili görüntüleri gösterilmiştir. Panel B, hiper-replikasyon yapmayan Salmonellae (z:4/8) kıyasla hiper-replikasyon yapan Salmonellae (z:7 /8) içeren hücrelerin farklı odak düzlemlerini göstermektedir. Beyaz ölçek çubukları 10 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Alan analizinin iş akışı. Alan analizinin iş akışı, pCHAR-Duo plazmidini (MOI 100) taşıyan Salmonella ile 8 saat boyunca enfekte olmuş INT407 hücrelerinin temsili düşük büyütmeli (10x) bir kazanımı için gösterilmiştir. İlk olarak, rastgele gürültü azaltılır ve daha sonra kanallar C1, C2 ve C3'e bölünür ve bağımsız olarak işlenir. Arka planı ölçüm alanından dışlamak için her kanal için bir eşik ayarlanır. Daha sonra, sadece C1'deki hücre çekirdeklerine, C2'deki tüm hücre içi Salmonellalara ve C3'teki sitozolik Salmonella'ya karşılık gelen eşikli piksellerin kapladığı alan her kanal için ölçülür. Burada analiz edilen görüntüler, dikişle birbirine kaynaşmış 10x büyütmede elde edilen dört fayansın sonuçlarıdır. Beyaz ölçek çubukları 100 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Alan analizinin sonuçları. Alan analizinin sonuçları gösterilir. (A) Enfeksiyon oranı, tüm hücre içi bakterileri temsil eden mCherry eksprese eden Salmonellae (C2 kanalı) tarafından işgal edilen alanın, konakçı hücre çekirdeği (C1 kanalı) tarafından işgal edilen alana bölünmesiyle hesaplanır. (B) Hiper-replikasyon oranı, sadece sitozolik hiper-çoğalan bakterileri temsil eden GFP eksprese Salmonellae (C3 kanalı) tarafından işgal edilen alanın, tüm hücre içi mCherry eksprese eden Salmonella'nın kapladığı alana bölünmesiyle ölçülmüştür. Her nokta bir çoğaltmayı temsil eder. Analiz, her biri üçlü olarak test edilen üç biyolojik replika üzerinde gerçekleştirildi. Siyah çizgiler ortalama değerleri gösterir. Anlamlılık iki kuyruklu t-testi kullanılarak hesaplandı ve p değerleri rapor edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Tek hücreli analizin iş akışı. Tek hücreli analizin iş akışı, pCHAR-Duo plazmidini (MOI 100) taşıyan Salmonella ile 8 saat boyunca enfekte olmuş INT407 hücrelerinin temsili bir yüksek büyütme kazanımı (40x) için gösterilmiştir. İlk olarak, kanallar C1, C2 ve C3'e bölünür ve bağımsız olarak işlenir. Epitel hücrelerine karşılık gelen mavi kanal (C1), hücre segmentasyonunu elde etmek için işlenir ve daha sonra her bölümlenmiş hücre, y-x koordinatlarıyla benzersiz bir şekilde etiketlenmiş bir İlgi Bölgesi (ROI) olarak tanımlanır. Kırmızı kanal (C2), odak dışı sitozolik hiper-replikasyon yapan Salmonellae'yi çıkarmak için yeşil kanal (C3) çıkarılarak işlenir, tüm vakuolar Salmonella'lar yalnızca mCherry'yi ifade eder ve ardından rastgele gürültü azaltılır ve eşik, arka planı ölçümlerden hariç tutacak şekilde ayarlanır. Son olarak, her ROI için vakuolar Salmonellae tarafından işgal edilen alan ölçülür. Toplam sitozolik GFP eksprese eden Salmonella'ya karşılık gelen yeşil kanal (C3) benzer şekilde işlenir. Burada analiz edilen görüntüler, dikişle birbirine kaynaşmış 16 fayansın sonuçlarıdır. Beyaz ölçek çubukları 100 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Tek hücreli analizin sonuçları. Tek hücreli analizin sonuçları gösterilmiştir. (A) Enfekte hücrelerin yüzdesi, hücre sayısının, yalnızca mCherry eksprese eden Salmonellae> 0.2 tarafından işgal edilen alanın bir yüzdesi ile toplam hücre sayısına bölünmesiyle elde edilir. (B) Ortalama vakuolar yük, enfekte olmuş hücrelerde sadece mCherry eksprese eden Salmonellae'nin kapladığı ortalama yüzde alanının hesaplanmasıyla elde edildi. (C) Hiper-replikasyon oranı, GFP eksprese eden Salmonellae'nin kapladığı alanın bir yüzdesine sahip hücre sayısının≥% 20'sinin toplam enfekte hücre sayısına bölünmesiyle hesaplanmıştır. Üçlü olarak test edilen üç ila dört biyolojik replikasyondan elde edilen veriler bildirilmiştir. Çubuklar standart ölçüm hatasını gösterir. Anlamlılık iki kuyruklu t-testi kullanılarak hesaplandı ve p değerleri rapor edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Alan analizi komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 2: Tek hücreli analiz komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salmonella'nın bağırsak epitel hücrelerini kolonize etme şekli, enfeksiyon sonucunu etkiler. İnvazyon üzerine, sitozolik hiper-replikasyon bağırsak iltihabını indükler3, oysa vakuoler replikasyon sistemik yayılmaya yol açabilir4. Salmonella suşları, bağırsak epitel hücrelerinin içinde istila etme ve çoğalma yeteneklerine göre değişebilir9. Gerçekten de, Salmonella, hastalığa neden olmak için farklı yeteneklere sahip 2.500'den fazla serovardan oluşan son derece çeşitli bir cinstir. Ek olarak, Salmonella, Avrupa Birliği'nde gıda kaynaklı salgınların en sık bildirilen nedenidir ve insan popülasyonunda büyük bir yayılmaya işaret etmektedir1. Bu nedenle, Salmonella'nın hücre içi fenotiplerinin nicelleştirilmesi için güvenilir, yüksek verimli yöntemlerin mevcudiyeti, çok sayıda Salmonella suşu arasındaki virülans farklılıklarını değerlendirmek ve sonuçta bu patojenin doğru ve suşa özgü bir risk değerlendirmesine izin vermek için büyük önem taşımaktadır.

Burada açıklanan protokol, Salmonella'nın epitel hücreleri içindeki davranışını hızlı ve otomatik bir şekilde ölçer. Epitel hücrelerinin enfeksiyonu 96 kuyucuklu görüntüleme mikroplakalarında gerçekleştirilir ve görüntü elde etmek için otomatik floresan mikroskobu kullanılır, bu da protokolü yüksek verimli uygulamalar için uygun hale getirir. Bu protokol, iki floresan muhabirin diferansiyel ekspresyonu yoluyla vakuolar'ın sitozolik Salmonella'dan ayırt edilmesini sağlayan pCHAR-Duo plazmidinden yararlanır5. Salmonella'nın hücre içi fenotipleri genellikle suşun başına çok sayıda suşun ve hücre kültürünün analizi için uygun olmayan ve operatör hatalarına ve operatörler arası varyasyona eğilimli olan zaman alıcı bir prosedür olan manuel puanlama ile analiz edilir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, alan analizi ve tek hücre analizi olmak üzere iki tamamlayıcı ve otomatik görüntü analizi geliştirilmiştir. Serbestçe kullanılabilen bir yazılım olan ImageJ, iki analizi geliştirmek için kullanıldı. Protokol yürütmeyi hızlandırmak için, operatör müdahalesi olmadan birden fazla edinme dosyasının toplu analizi için ImageJ komut dosyaları ek dosyalar olarak sağlanır.

Alan analizi, birkaç adımda, epitel hücrelerinin çekirdekleri tarafından özel olarak işgal edilen alanların ölçümü ve GFP ile birlikte mCherry veya mCherry eksprese eden Salmonellae ile epitel hücrelerinin genel kolonizasyonunu (enfeksiyon oranı) ve hiper-replikasyon seviyesini (hiper-replikasyon oranı) ölçmek için tasarlanmıştır. Alan analizi, hem vakuolar hem de hiper-replikasyon yapan Salmonellae'nin aynı z-düzleminde odaklandığı düşük büyütmede elde edilen görüntülere uygulanır ve mikroskobik alan başına çok sayıda epitel hücresi görüntülenerek edinme dosyalarının boyutunu ve sayısını azaltır. Alan analizi, çok sayıda numunenin otomatik, hızlı ve hesaplama açısından hafif bir analizine izin vererek tarama deneyleri gibi yüksek verimli testler için uygun hale getirir.

Tek hücreli analiz, hücre segmentasyonu ve hücresel alanın ölçümü ve vakuoler ve sitozolik hiper-replikasyon Salmonella'nın kapladığı alan yüzdesi ile elde edilen tek hücreli çözünürlüğe sahip epitel hücreleri içindeki Salmonella fenotiplerini ölçmek için tasarlanmıştır. Alan analizi ile karakterize edilen epitel hücrelerinin genel kolonizasyonu burada üç kantitatif parametreye, enfekte olmuş hücrelerin yüzdesine, ortalama vakuolar yüke ve hiper-replikasyon hızına bölünür, bu nedenle her bir fenotipin genel kolonizasyona katkısını değerlendirmeyi ve nicelleştirmeyi sağlar, bu nedenle alan analizinin sonuçlarını tamamlar. Tek hücreli analizin sunduğu daha büyük ayrıntılar, daha yavaş görüntü elde etme ve analiz pahasına gelir. Aslında, tek hücreli çözünürlük elde etmek için, görüntü yakalama yüksek büyütmede gerçekleştirilir. Bu, hem vakuolar hem de sitozolik Salmonella'yı odakta gözlemlemek için çoklu z-düzlemlerine ihtiyaç duyulduğunu ve çok sayıda epitel hücresinin puanlanması için numune başına çok sayıda alanın elde edilmesinin gerekli olduğunu ve böylece alan analizine kıyasla edinim süresini uzattığını ima eder. Ayrıca, birkaç büyük edinme dosyasının analizi hesaplama açısından zorlayıcıdır, bu nedenle uygun bir iş istasyonu gerektirir (6 çekirdekli, 32 GB RAM iş istasyonu kullanılmıştır). Bu nedenle, tek hücreli analiz, sınırlı verim koşullarında tek başına veya epitel hücrelerinin içindeki Salmonella fenotiplerinin daha derin bir anlayışını elde etmek için alan analizine bağlı ikinci düzey bir yöntem olarak kullanılabilir.

İki tamamlayıcı analiz S kullanılarak doğrulandı. Tm, S. Derby wt ve S. Derby ΔsipA, epitel hücreleri içindeki davranışlarının invazyon veya replikasyon açısından farklı olduğu zaten bilindiği için seçildi 9,10. Alan ve tek hücreli analizlerin sonuçları, protokolün, test edilen suşların özelliklerine uygun olarak hücre içi Salmonella fenotiplerindeki farklılıkları nicel olarak ayırt etmesine izin verdiğini göstermektedir. Ayrıca, bu sonuçlar, tek hücreli analizin, her hücre içi fenotipin (invazyon, vakuolar yük ve sitozolik replikasyon) alan analizi kullanılarak puanlanan genel kolonizasyona katkısının nicelleştirilmesine izin verdiğini göstermektedir.

Bu protokol burada farklı Salmonella suşlarının in vitro patojenitesini incelemek için uygulanmıştır, ancak epitel hücreleri içindeki istila ve / veya replikasyonda rol oynayan genleri tanımlamak için rastgele mutantların incelenmesi gibi başka uygulamalara da sahip olabilir. Ek olarak, protokol, Salmonella'nın INT407 hücrelerinden diğer hücre hatları içindeki davranışını analiz etmek için uyarlanabilir. Ayrıca, diğer hücre içi mikroorganizmaların hücre-patojen etkileşimini incelemek için benzer yöntemler geliştirmek için başlangıç noktası olarak da kullanılabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, pCHAR-Duo plazmidini paylaştığı için Dr. Olivia Steele-Mortimer'e teşekkür eder. Bu çalışma İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından finanse edildi, PRC2019014 ve PRC2021004 hibe edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 oyuklu görüntüleme mikroplakasıEppendorf30741030Hücre kültürü ve enfeksiyon
AmpisilinSigma-Aldrich59349Bakteri kültürü
Axio gözlemci ters mikroskopZEISSOtomatik floresan mikroskobu
Axiocam 305 MonoZEISSMikroskop Kamera
Nefes alabilen sızdırmazlık membranıSigma-AldrichZ380059Enfeksiyon testi
Colibr & igrave; 5/7ZEISSLed ışık kaynağı
Kollajen I sıçan kuyruğuYaşam TeknolojileriA1048301Kollajen kaplama
DAPIInvitrogenD3571Hücre boyama
Fetal sığır serumuGibco10099-141Hücre kültürü ve enfeksiyon
GentamisinSigma-AldrichG12664Enfeksiyon tahlili
Buzlu asetik asitCarlo Erba401391Kollajen kaplama
HCS CellMask BlueInvitrogenH32720Hücre boyama
ImageJUlusal Sağlık Enstitüleri ve Optik ve Hesaplamalı Enstrümantasyon Laboratuvarı (LOCI, Wisconsin Üniversitesi)Görüntü işleme yazılımı
Minimum Temel Eagle's MediumSigma-AldrichM5650-500MLHücre kültürü ve enfeksiyon
Paraformaldehit %4İnvitrojenFB002Hücre fiksasyonu
Potasyum klorürPanReac AppliChem131494.1211PBS hazırlığı
Potasyum fosfat monobazikSigma-Aldrich60220PBS hazırlığı
Sodyum KlorürPanReac AppliChem131659.1214Bakteri kültürü ve PBS hazırlama
Sodyum fosfat DibasicSigma-Aldrich71640PBS hazırlama
Doku Kültürü Şişesi 25 cm2 fiş conta vidalı kapakEurocloneET7025Hücre kültürü
Triton X-100Biorad1610407Hücre boyama
Tripsin-EDTA (% 0.25)Gibco25200056Hücre kültürü ve enfeksiyon
Tripton,OksoitLP0042BBakteri kültürü
, Maya özütüBiolife, 4122202Bakteri kültürü
, , ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal. 19 (12), 6971(2021).
  2. Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire. Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).
  3. Knodler, L. A., et al. Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).
  4. Fulde, M., et al. Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo. Cell Host & Microbe. , (2019).
  5. Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475(2017).
  6. Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population. mBio. 8 (6), 01931(2017).
  7. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  8. Ibarra, J. A., et al. Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro. Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).
  9. Tambassi, M., et al. Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health. Scientific Reports. 10 (1), 21539(2020).
  10. Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells. PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354(2017).
  11. Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9 (1), 84681(2014).
  12. Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells. Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Salmonella PhenotypesIntracellular SalmonellaImageJ AnalysisFluorescence MicroscopyEpithelial CellsCytosolic Hyper ReplicationVacuolar ReplicationSingle Cell AnalysisHigh Throughput ScreeningCell Segmentation

İlgili makaleler