Sentetik mRNA Transfeksiyonunu Takiben Tümör Hücresi Migrasyonu ve İnvazyonunun Gerçek Zamanlı Kantitatif Ölçümü

Tümör hücresi motilitesi metastazda çok önemli bir rol oynar ^1,2. Tümör hücrelerinin komşu ve uzak sağlıklı dokulara yayılması kanser tedavisini zorlaştırır ve nüksetmeye katkıda bulunur ^3,4. Bu nedenle, tümör hücresi motilitesinin mekanizmalarını anlamak ve ilgili terapötik stratejiler geliştirmek esastır. Birçok tümör hücresi gen ekspresyon profillerini değiştirdiğinden, gen ekspresyon profilindeki hangi değişikliklerin tümör hücresi motilitesinin^{değişmesine} yol açtığını anlamak çok önemlidir ^5,6.

Hücre göçünü in vitro olarak ölçmek için çeşitli testler geliştirilmiştir. Bazı tahliller, yalnızca belirli zaman noktalarında ölçümlere izin verdiği için yalnızca sınırlı bilgi sağlarken, diğerleri gerçek zamanlı olarak tümör hücresi motilitesi hakkında kapsamlı bilgi sunar⁷. Bu hücre motilite testlerinin birçoğu belirli bir zamanda veya son noktada nicel sonuçlar sağlayabilse de, deney süresi boyunca hücre göçü hızındaki dinamik değişiklikler hakkında yeterince ayrıntılı bilgi sağlayamamaktadır. Ek olarak, deneysel tasarıma, hücre tiplerine ve hücre sayılarına bağlı olarak hücre göç hızındaki potansiyel değişiklikleri incelemek zor olabilir. Ayrıca, komplike olmayan tedavilerin etkileri, geleneksel motilite testlerinin basit miktar tayini ile araştırılabilir, ancak çeşitli kombine tedavilerin karmaşık etkilerini incelemek için daha karmaşık miktar tayini gerekebilir⁸.

Mikroelektrotlarla kaplanmış bir mikrotitre plakasının elektrik akımını izlemek için bir cihaz geliştirilmiştir⁹. Hücrelerin kuyu yüzeyine yapışması elektron akışını engeller ve empedans, hücrelerin kantitatif ve nitel bağlanması ile ilişkilidir. Kuyu dibinde mikroelektrotların varlığı, hücre yapışmasının, yayılmasının ve çoğalmasının ölçülmesine izin verir. Üst kamaranın mikro gözenekli bir zarının altında mikroelektrotların varlığı, hücre göçünün ve alt bölmeye invazyonun ölçülmesine izin verir, üst bölme invazyona izin vermek için hücre dışı matris (ECM) proteinleri ile kaplanır¹⁰.

Daha önce, tümör hücresi göçü ve invazyonunun empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümlerinin, tüm deney boyunca gerçek zamanlı verilerin yanı sıra çeşitli deneysel koşullar altında anlık karşılaştırmalar ve nicelemeler sağladığı gösterilmiştir¹¹. Bu yöntem makalesinde, tümör hücresi göçü ve istilasında ilgilenilen proteinlerin rolünü test etmek için gen yıkımı indüklendi. Test edilen deney koşulları altında tam gelişmiş bir gen yıkım etkisi, küçük enterferans yapan RNA'lar (siRNA'lar)⁸ ile elektroporasyondan 3-4 gün sonra sürdüğünden, hücreler elektroporasyondan sonra yeniden kaplandı ve tümör hücresi göçünün ve invazyonunun empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümü için 3 gün sonra yeniden toplandı.

Kinaz (Crk) ve Crk benzeri (CrkL) CT10 regülatörü, çeşitli büyüme faktörü reseptör kinaz yolaklarının ve reseptör olmayan tirozin kinaz yolaklarının¹² aşağı akışında protein-protein etkileşimlerine aracılık eden adaptör proteinlerdir. Yüksek Crk ve CrkL protein seviyeleri, glioblastoma¹³ dahil olmak üzere birçok insan kanserinde kötü prognoza katkıda bulunur. Bununla birlikte, yüksek Crk ve CrkL proteinlerinin nasıl kötü bir prognoza yol açtığı açık değildir. Bu nedenle, Crk ve CrkL aşırı ekspresyonunun tümör hücre fonksiyonları üzerindeki etkisini tanımlamak önemlidir. Daha önce, glioblastoma hücre göçü ve invazyonu için endojen seviyelerde Crk ve CrkL proteinlerinin gerekli olduğunu göstermek için bir gen yıkım çalışması yapılmıştır⁸. Burada, Crk ve CrkL aşırı ekspresyonunun tümör hücresi göçü ve invazyonu üzerindeki etkisini ele almak için modifiye edilmiş bir test sistemi geliştirilmiştir.

Son zamanlarda, mRNA'nın in vitro sentezi ve terapötik uygulamaları, SARS-CoV-2'ye karşı mRNA aşılarının geliştirilmesi nedeniyle yeniden dikkat çekmiştir (Verbeke ve ^ark.14 tarafından gözden geçirilmiştir). Ayrıca kanser ve diğer hastalıklarda sentetik mRNA kullanımında kayda değer ilerlemeler kaydedilmiştir^15,16. Hücrelerin elektroporasyonu, sentetik mRNA iletmek ve geçici genetik modifikasyonu indüklemek için etkili bir yöntemdir (Campillo-Davo ve ark.17 tarafından gözden geçirilmiştir) ve sentetik mRNA kullanımı, ölümsüzleştirilmiş fibroblastlarda^hızlı ve verimli gen ekspresyonunu sağlar ¹⁸. Bu yöntem makalesi, tümör hücresi göçünü ve invazyonunu incelemek için sentetik mRNA kullanarak gen aşırı ekspresyonunu gerçek zamanlı hücre analizleriyle birleştirir. Bununla birlikte, siRNA'lar için kullanılan deneysel şema, sentetik mRNA transfeksiyonu ile çalışmaz, çünkü eksojen proteinlerin seviyesi hızla artar ve sentetik mRNA transfeksiyonu¹⁸ üzerine kademeli olarak azalır. Bu nedenle, yöntem, hücreleri ek olarak kültürlemeden, transfeksiyondan hemen sonra hücre göçü ve istilasının gerçek zamanlı analizini gerçekleştirmek için değiştirilmiştir.

Bu yöntem makalesi, empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümlerin tümör hücrelerinin sentetik mRNA'larla transfeksiyonu ile birleştirilmesinin, gen yukarı regülasyonunun tümör hücresi göçü ve invazyonu üzerindeki etkilerinin hızlı ve kapsamlı bir analizini sağladığını göstermektedir. Bu yöntem belgesi, glioblastoma hücrelerinin göçünün ve istilasının Crk ve CrkL'nin aşırı ekspresyonundan nasıl etkilendiğini ölçmek için ayrıntılı prosedürleri açıklamaktadır. Makale, sentetik mRNA'nın tümör hücresi göçü üzerindeki konsantrasyona bağlı etkilerini inceleyerek, protein seviyelerindeki artışın tümör hücresi göçünü nasıl uyardığını açıkça açıklamaktadır. Ek olarak, gen ekspresyonundaki değişikliklerin tümör hücresi invazyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ECM jelinin konsantrasyonunu değiştiren bir yaklaşım sunulmaktadır.

1. mRNA sentezi

NOT: mRNA sentezi için, kullanımdan önce RNazları etkisiz hale getirmek için tüm reaktifler ve ekipman özel olarak işlenmelidir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, aletler ve reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. DNA'nın doğrusallaştırılması
   NOT: CrkI ve CrkL'nin fare cDNA'ları, C-terminalinde FLAG epitop etiketini eklemek için pFLAG-CMV-5a ekspresyon vektörüne klonlandı ve daha önce açıklandığı gibi T7 promotörünü dahil etmek için pcDNA3.1/myc-His vektörüne alt klonlandı ^18,19.
   1. Plazmit DNA'yı kısıtlama enzimi ile doğrusallaştırmak için bir mikrosantrifüj tüpüne 10 μL 10x reaksiyon tamponu, 1.5 μL PmeI (10.000 birim / mL) ve 10 μg bir plazmit DNA ekleyin. Reaksiyon hacmini 100 μL'ye getirmek için nükleaz içermeyen su ekleyin.
   2. Hafifçe vurarak karıştırın, döndürün ve reaksiyon karışımını gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
   3. Döndürün ve reaksiyon karışımına 5 μL %10 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 1 μL proteinaz K (20 mg/mL, RNA derecesi) ekleyin. Hafifçe vurarak karıştırın, döndürün ve 50 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   4. Çeker ocak altında, ekstraksiyon için plazmit reaksiyon karışımına fenol:kloroform:izoamil alkolün alt fazından 100 μL ekleyin. Vorteks ve ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 18.800 × g'da santrifüjleyin. Üst fazı yeni bir tüpe taşıyın.
   5. Adım 1.1.4'ü kloroform:izoamil alkol ile 24:1'de tekrarlayın.
   6. Yeni tüpte, 200 μL nükleaz içermeyen su ekleyerek reaksiyon hacmini 300 μL'ye getirin ve ardından 30 μL 3 M sodyum asetat ve 600 μL %100 etanol ekleyin.
   7. Girdap ile karıştırın ve ardından DNA'nın etanol çökelmesi için 30-60 dakika boyunca −20 ° C'ye koyun.
   8. 4 °C'de 20 dakika boyunca 18.800 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti 1 mL %70 etanol ile durulayın. Santrifüjlemeyi 10 dakika tekrarlayın ve ardından süpernatanı tamamen çıkarın.
   9. Kapak açıkken 2 dakika kurutun, 30 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve DNA peletini yeniden süspanse edin.
   10. Bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin.
   11. Agaroz jel elektroforezi kullanarak doğrusallaştırılmış DNA'nın boyutunu ve miktarını doğrulayın.
2. T7 RNA polimeraz kullanılarak RNA sentezi
   1. Bir mikrosantrifüj tüpüne 10x transkripsiyon tamponu, ATP, GTP, UTP, CTP ve T7'nin her birine 2 μL ve 1 μg doğrusallaştırılmış DNA ekleyin. Reaksiyon hacmini 20 μL'ye getirmek için nükleaz içermeyen su ekleyin.
   2. Hafifçe vurarak karıştırın, döndürün ve reaksiyon karışımını RNA sentezi için 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
   3. Döndürün, 1 μL DNaz (2 U/μL) ekleyin ve şablon DNA'yı çıkarmak için 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
3. RNA'nın lityum klorür çökelmesi
   1. Reaksiyon karışımına 10 μL lityum klorür (7,5 M) ekleyin. Hafifçe vurarak karıştırın, döndürün ve reaksiyon karışımını −20 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   2. 4 °C'de 20 dakika boyunca 18.800 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti 500 μL %70 etanol ile durulayın. Santrifüjlemeyi 10 dakika tekrarlayın ve ardından süpernatanı tamamen çıkarın.
   3. Kapak açıkken 2 dakika kurutun, 30 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve RNA peletini yeniden süspanse edin.
4. Kapatma
   1. RNA örneğini 65 °C'de 10 dakika ısıtın ve ardından soğuması için buzun üzerine koyun.
   2. Her biri 5 μL 10x kapatma tamponu, 10 mM GTP ve 1 mM (10x) S-adenosilmetiyonin (SAM), her biri 2 μL bir kapatma enzim karışımı ve O-metiltransferaz enzim karışımı ve 1.25 μL RNaz inhibitörü ekleyin. Hafifçe vurarak karıştırın, döndürün ve reaksiyon karışımını 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
5. Poli(A) kuyruk
   1. Numuneyi döndürün ve ardından 6 μL nükleaz içermeyen su, 20 μL 5x E-PAP tamponu, 10 μL 25 mM MnCl₂, 10 μL 10 mM ATP ve 4 μL E-PAP poli(A) atık enzimi ekleyin. Hafifçe vurarak karıştırın, döndürün ve reaksiyon karışımını 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
6. Lityum klorür çökeltmesi ve sentetik mRNA'nın miktarının belirlenmesi
   1. 50 μL lityum klorür (7,5 M) ekleyin ve adım 1.3.1-1.3.3'te açıklandığı gibi lityum klorür çökeltme işlemini gerçekleştirin.
   2. Bir spektrofotometre kullanarak mRNA konsantrasyonunu ölçün.
   3. Formaldehit (%1-%2), agaroz (%1) jel elektroforezi kullanarak mRNA'nın boyutunu ve miktarını doğrulayın.

2. Hücre istilası ve migrasyon (CIM) plakalarının hücre dışı matris (ECM) jel kaplaması

NOT: Bir hücre istilası ve göçü (CIM) plakası, empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizi için ticari olarak üretilmiş 16 oyuklu bir plakadır. Hücre invazyon testi için, CIM plakalarını daha önce tarif edildiği gibi ancak bazı modifikasyonlarla ECM jeli ile kaplayın¹¹.

1. Dondurucudan bir miktar ECM jel stoğu çıkarın ve buz üzerinde tutun.
2. ECM jelini (10 mg/mL) bir çalışma konsantrasyonuna (100 μg/mL) seyreltin, 990 μL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamını (DMEM) (serum veya antibiyotiksiz) bir mikrosantrifüj tüpünde 10 μL ECM jeli ile karıştırın. Nazik pipetleme ile karıştırın.
3. CIM plakasının üst odasının 16 oyuğunun her birine 60 μL seyreltilmiş ECM jeli ekleyin. Hava kabarcıklarından kaçınarak ters pipetleme yöntemini uygulayın^20,21.
   NOT: Her hücre hattı için ECM jelinin konsantrasyonunu optimize edin. Glioblastoma hücre hatları için, optimizasyon için 0.1 μg/μL ila 1 μg/μL ECM jeli kullanıldı.
4. CIM plakasının üst haznesini, plaka kapağı kapalı olacak şekilde, bir jel tabakası oluşturmak için yaklaşık 4 saat boyunca bir CO₂ inkübatörünün içindeki koruyucu plastik bir tabaka üzerine yerleştirin.
   DİKKAT: CIM plakasının ECM jeli ile kaplanması sırasında, CIM plakasının üst odasının elektrotları, deneycinin elleriyle veya biyogüvenlik kabini veya CO₂ inkübatörü dahil olmak üzere ekipmanın yüzeyleriyle doğrudan temas etmemelidir.

3. Tümör hücrelerinin hazırlanması

NOT: Tüm hücre kültürü materyalleri steril tutulmalıdır. Tümör hücrelerini, daha önce açıklandığı gibi, ancak bazı modifikasyonlarla uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) ile biyolojik bir güvenlik kabini altında toplayın ve elektropoze edin¹¹.

1. Tümör hücrelerinin kültürü
   1. %5 CO 2 inkübatörde 37 ° C'de 100 mm x 20 mm polistiren doku kültürü kabı başına% 5 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik içeren 10 mL DMEM içinde kültür_U-118MG hücreleri (kültür koşulu).
2. Tümör hücrelerinin serum tükenmesi
   NOT: Hücrelerin FBS'de bulunan kemoatraktanlara maruz kalması, hücre göçü ve invazyon testlerinden önce yüksek konsantrasyonda FBS kullanılarak en aza indirilmelidir.
   1. Eski ortamı çıkarın ve çanak başına% 0.5 FBS ve% 1 antibiyotik içeren 10 mL önceden ısıtılmış DMEM ekleyin (düşük serum ortamı).
   2. Adım 3.2.1'i tekrarlayın.
   3. Hücreleri 37 °C'de% 5 CO₂ inkübatörde 4 saat veya daha uzun süre inkübe edin.
3. Tümör hücrelerinin toplanması
   1. Eski ortamı çıkarın, tabak başına 8 mL önceden ısıtılmış Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) ekleyin, DPBS'yi çıkarın, yüzeyi kaplamak için önceden ısıtılmış %0,05 tripsin-EDTA (2 mL/tabak) ekleyin ve CO₂ inkübatörde 30 saniye inkübe edin.
   2. Tripsin-EDTA'yı dikkatlice aspire edin, düşük serum ortamı (7 mL / tabak) ekleyin ve ardından hücreleri 50 mL veya 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın.
   3. Küçük bir hücre hacmini ayırın ve hücreleri saymak için elde taşınan otomatik bir hücre sayacı kullanın.
   4. Toplam hücre sayısını ve 10.000 hücre/μL için gerekli hacmi hesaplayın.
   5. Hücreleri, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 × g'da santrifüjleyerek döndürün, süpernatanı aspire edin,% 0.5 FBS (antibiyotiksiz) içeren hesaplanan DMEM hacmini ekleyin ve hücre peletini nazikçe yeniden süspanse edin.
   6. Her tedavi için 1.1 milyon hücre içeren 110 μL hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   7. Hücreleri dört farklı tedavi için dört mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için adım 3.3.6'yı tekrarlayın.
      NOT: Bir CIM plakasında toplam 16 kuyu bulunur. Karşılaştırma için dört farklı işlem tasarlayın, böylece her işlem için CIM plakasının dört kuyusu atanabilir. Aşağıdaki deneyler için elektropore hücreleri kullanın: western blot analizleri (35 mm doku kültürü kabı başına 0.3 milyon hücre), dört kuyucuk gerçek zamanlı hücre göç testi (0.1 milyon hücre / kuyu) ve dört kuyu gerçek zamanlı hücre istilası testi (0.1 milyon hücre / kuyu) her tedavi için. Deneysel tasarım değişirse elektroporasyona tabi tutulması gereken hücre sayısını ayarlayın.

4. Tümör hücrelerinin elektroporasyonu

1. Ortamı çıkarmak için, her tüpteki hücre süspansiyonuna 1 mL DPBS ekleyin, mini bir santrifüj kullanarak tüpü her 10 saniyede bir 180° döndürürken hücre süspansiyonunu her seferinde 10 saniye boyunca üç kez döndürün ve bir mikropipet kullanarak süpernatanı çıkarın.
   NOT: Kompakt ancak kolayca yeniden süspanse edilebilir bir hücre peleti oluşturmak önemlidir.
2. 10 μL'de 0.1 milyon hücre elde etmek için hücre peletine 110 μL resüspansiyon tamponu R ekleyin.
3. İstenen ekspresyon seviyesine bağlı olarak 0.2-20 ng/μL'lik bir konsantrasyon elde etmek için hücre peletine sentetik mRNA ekleyin. Hücre peletini hafifçe vurarak veya hafifçe pipetleyerek hafifçe karıştırın ve yeniden süspanse edin.
   NOT: Protein ekspresyonu ile biyolojik etkiler arasındaki spesifik korelasyonu araştırmak için farklı konsantrasyonlarda sentetik mRNA kullanın, western blot analizini kullanarak protein ekspresyonunu inceleyin ve istenen ekspresyon seviyesine yol açan sentetik mRNA konsantrasyonunu belirleyin.
4. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini 1,350 V'ta bir elektroporasyon sistemi ile 10 ms boyunca her seferinde üç darbeyle elektropore edin.
5. Elektroporasyonlu hücreleri,% 0.5 FBS içeren 1.1 mL DMEM içeren yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
6. Hücre süspansiyonunun geri kalanı elektroporasyona girene kadar elektroporasyonu tekrarlayın. 1.1 mL'de 1.1 milyon hücre elde etmek için elektroporasyonlu hücreleri mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.
   NOT: Hem 100 μL hem de 10 μL elektroporasyon uçları, büyük hacimli hücreleri elektroporatörlük etmek için kullanılabilir, ancak 10 μL ve 100 μL için elektroporasyon uçları iki ayrı kitte bulunur ve ayrı olarak satın alınması gerekir. Yeniden süspansiyon tamponu R her iki kitte de bulunur.
7. İlgili tüm elektroporasyonları tamamladıktan sonra, havuzlanmış hücreleri yavaşça yeniden süspanse edin.
8. 35 mm x 10 mm'lik bir polistiren doku kültürü kabında 0.3 milyon hücreyi% 5 FBS içeren 2 mL DMEM ile kaplayın ve toplam hücre lizat hazırlığı ve western blot analizleri için hücreleri kültür koşulu altında 1 gün boyunca kültürleyin.
9. Gerçek zamanlı hücre analiz sistemi hazır olana kadar elektroporasyonlu hücrelerin geri kalanını oda sıcaklığında tutun.

5. Gerçek zamanlı hücre analizörünün, programın ve CIM plakalarının ayarlanması

NOT: Daha önce açıklandığı gibi gerçek zamanlı hücre analizörünü ve iki CIM plakasını hazırlayın¹¹.

1. Gerçek zamanlı hücre analizörünün dengelenmesi
   1. Sistemi kültür koşulu altında dengelemek için gerçek zamanlı hücre analizörünü kullanımdan birkaç saat önce bir CO₂ inkübatörüne taşıyın.
2. Analiz programının kurulması
   1. Masaüstündeki gerçek zamanlı hücre analiz yazılımı simgesine çift tıklayarak analiz programını açın.
   2. Varsayılan Deneme Modeli Kurulumu seçeneği açıldıktan sonra, üç denemeyi ayrı ayrı çalıştırma seçeneğini belirleyin.
      NOT: Her kızağın ayrı bir penceresi vardır. Ölçüm aralığını ve süresini, veri analizini ve diğer deneysel koşulları ayarlamak için farklı sekmeler vardır.
   3. Sayı sekmesine tıklayarak her bir kızağı açın.
   4. Deneme Notları sekmesine tıklayın, verilerin kaydedileceği klasörü seçin ve denemenin adını girin.
   5. Düzen sekmesine tıklayın, bir seferde dört kuyu seçip numune bilgilerini girerek her tedavi koşulu için dörtlü kuyular ayarlayın ve ardından Uygula'ya tıklayın.
   6. Zamanlama sekmesine tıklayın | Hücre empedansı ölçümlerinin iki adımlı modunu ayarlamak için bir adım ekleyin. Ardından, ilk adımı ayarlamak için Uygula'ya tıklayın.
   7. Tekrar Adım ekle'ye tıklayın, geçiş ve işgal süresi için aralık için 10 dakika ve 48 saat girin ve ikinci adımı ayarlamak için Uygula'ya tıklayın.
      NOT: İlk adım, bir kerelik bir temel ölçüm alır (1 dakikalık aralıklarla bir tarama). İkinci adım, deney için hücre empedansını ölçer (örneğin, 48 saat boyunca 10 dakikalık aralıklarla 289 tarama). Deneysel tasarıma bağlı olarak aralığı ve süreyi ayarlayın.
   8. Bir sonraki yuvaya geçin ve 5.2.3-5.2.7 adımlarını tekrarlayarak ayarlayın.
3. CIM plakalarının hazırlanması
   1. Hücre empedans ölçümü başlamadan bir saat önce, CIM plakasının alt odasının kuyucuklarını% 10 serum veya diğer kemoatraktanlar içeren 160 μL DMEM ile doldurun.
   2. ECM jel kaplı kuyucukları (istila için) veya kaplanmamış kuyucukları (migrasyon için) içeren üst hazneyi alt hazne ile birleştirin.
   3. Hücre migrasyon tahlili için CIM plakasının üst odasının kuyucuklarına 50 μL düşük serumlu ortam ekleyin ve CIM plakasını sistemin kızağına yerleştirin.
   4. Mesaj sekmesine tıklayın ve Bağlantılar tamam mesajının görüntülendiğinden emin olun. CIM plakası artık deney için hazırdır.
   5. CIM plakasını kültür durumuna alıştırmak için gerçek zamanlı hücre analizinden önce monte edilmiş CIM plakasını CO₂ inkübatörde 30-60 dakika önceden inkübe edin.

6. Gerçek zamanlı hücre analizi ve veri aktarımı

NOT: Daha önce açıklandığı gibi bir temel okuma, hücre tohumlama, hücre empedansı ölçümü ve veri dışa aktarımı gerçekleştirin¹¹.

1. Temel okuma
   NOT: Taban çizgisi, CIM plakası alıştırıldıktan sonra ve hücreler üst bölmenin kuyucuklarına eklenmeden önce okunmalıdır.
   1. Her yuva için Başlat düğmesine tıklayın. Farklı Kaydet penceresi görüntülendiğinde, temel okumayı gerçekleştirmek için deneysel dosyayı kaydedin.
2. Hücre tohumlama
   1. CIM plakasını yuvadan çıkarın ve plaka tutucudaki biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
   2. Kontrol ünitesindeki programa göre CIM plakasının üst odasının kuyucuklarına 100 μL (100.000 hücre içeren) elektroporasyonlu hücre ekleyin. Hava kabarcıklarından kaçınarak ters pipetleme yöntemini uygulayın.
   3. Hücrelerin kuyu dibine eşit şekilde yayıldığından emin olmak için CIM plakasını oda sıcaklığında 30 dakika biyogüvenlik kabininin altında bırakın.
3. Hücre empedansı ölçümü
   1. Tamamen monte edilmiş CIM plakasını ilgili kızağa geri taşıyın. İkinci adım için hücre empedansı ölçümünü başlatmak için beşik Başlat düğmesine tıklayın.
   2. Çizim sekmesine tıklayın, ardından Tümünü Ekle düğmesine tıklayın ve verileri gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için Ortalama ve STD DEV kutularını seçin.
      NOT: Varsayılan çizim seçeneği, x ekseni için Zaman ve y ekseni için Hücre İndeksi'dir . Çizim Seçimi bölümü, kullanıcının y ekseni için alternatif seçenekler seçmesine olanak tanır: Normalleştirilmiş Hücre İndeksi veya Delta Hücre İndeksi. Son tarama yapıldıktan sonra deney tamamlanır ve sonuçlar otomatik olarak kaydedilir.
4. Verilerin analiz için dışa aktarılması
   1. Çizim sekmesine tıklayın ve her bir kuyu için verileri ayrı ayrı kopyalamak için Ortalama ve STD DEV kutularını seçin.
   2. Çizim alanına sağ tıklayın ve Verileri Liste Biçiminde Kopyala'yı seçin.
   3. Boş bir elektronik tablo dosyası açın, verileri yapıştırın ve ardından dosyayı kaydedin.
   4. Analiz programına geri dönün, her beşik için Plaka sekmesine tıklayın ve beşik denemesini kapatmak için Serbest Bırak'ı seçin.
   5. Elektronik tablo dosyasına geri dönün ve ham verilerin zamanını, ikinci adımdaki başlangıç zamanı ölçümün gerçek başlangıç zamanı olacak şekilde ayarlayın.

Crk ve CrkL proteinleri, nöronlar22, T hücreleri23, fibroblastlar 18,19 ve çeşitli tümör hücreleri13 dahil olmak üzere birçok hücre tipinin hareketliliğinde önemli rol oynar. Glioblastoma24,25,26'da Crk ve CrkL proteinlerinin yükseldiği bildirildiğinden, Crk'nın bir ek varyantı olan CrkI'nin aşırı ekspresyonunun glioblastoma hücre göçü üzerindeki etkileri bu çalışmada incelenmiştir. U-118MG hücreleri, farklı konsantrasyonlarda sentetik CrkI mRNA ile elektroporasyona tabi tutuldu ve protein seviyeleri ve hücre göçü açısından analiz edildi. U-118MG glioblastoma hücrelerinin değişen konsantrasyonlarda sentetik CrkI mRNA ile elektroporasyonu, transfeksiyondan 1 gün sonra FLAG etiketli CrkI proteininde konsantrasyona bağlı bir artışa neden oldu (Şekil 1A). 0.2 ng/μL ve 2 ng/μL mRNA, eksojen CrkI proteininin tespit edilemeyen veya mütevazı bir ekspresyonuna yol açarken, 20 ng/μL mRNA, endojen CrkI proteininden çok daha yüksek bir ekspresyon seviyesi ile sonuçlandı.

Gerçek zamanlı hücre analiz sistemi kullanılarak yapılan hücre göçü testinden elde edilen sonuçlar, 0.2 ng/μL veya 2 ng/μL CrkI mRNA ile elektroporasyonun hücre göçünü büyük ölçüde etkilemediğini gösterdi. Bununla birlikte, 20 ng/μL CrkI mRNA ile elektroporasyon, 2 saat ile 13 saat arasında daha fazla hücrenin göç etmesiyle hücre göçünün net bir şekilde uyarılmasına yol açtı (Şekil 1B). CrkI protein seviyesi ile hücre göçü arasındaki karşılaştırma, glioblastoma hücre göçünün CrkI protein seviyesindeki artışla uyarıldığını ortaya koydu. Hücre göçünün önemli ölçüde uyarılmasına neden olmak için CrkI protein seviyesinin belirli bir eşikten daha yüksek olması gerektiği görülmektedir. Hücre göçü, göç eden hücreleri belirli zaman noktalarında saymak veya gözlemlemek için farklı şekillerde ölçülmüş olsaydı, hücre göçündeki bu tür bir değişikliği tanımlamak için çok daha fazla çaba gerekebilirdi.

CrkL aşırı ekspresyonunun farklı konsantrasyonlarda ECM proteinlerine sahip ECM jel katmanları yoluyla glioblastoma hücre istilasını nasıl etkilediğini incelemek için, U-118MG hücreleri sentetik CrkL mRNA ile elektroporasyona tabi tutuldu ve bir ECM jel tabakası yoluyla protein seviyeleri ve hücre istilası açısından analiz edildi. U-118MG glioblastoma hücrelerinin sentetik CrkL mRNA ile elektroporasyonu, transfeksiyondan 1 gün sonra FLAG etiketli CrkL proteininin sağlam bir ekspresyonuna yol açtı (Şekil 2A). ECM proteinlerinin konsantrasyonu arttıkça, kontrol hücrelerinin istilası yavaşladı (Şekil 2B). CrkL aşırı eksprese eden hücreler ayrıca hücre invazyonunda ECM jel konsantrasyonuna bağlı bir azalma gösterdi (Şekil 2C). Farklı ECM jel konsantrasyonlarında kontrol ve CrkL aşırı eksprese eden hücreler arasındaki karşılaştırma, CrkL aşırı ekspresyonunun genellikle ECM jel tabakası boyunca hücre invazyonunu uyardığını göstermiştir (Şekil 2D-G). Bununla birlikte, iki hücre popülasyonu arasındaki fark, ECM jel konsantrasyonuna bağlı olarak farklı zaman noktalarında belirginleşti.

0.1 μg / μL ECM jeli için, hücre invazyonunun CrkL aşırı ekspresyon aracılı stimülasyonu 8 saat ile 20 saat arasında belirgindi, ancak hücre invazyonundaki fark 32 saat sonra ihmal edilebilir düzeydeydi. 0.2 μg / μL ECM jeli için, CrkL aşırı ekspresyonu olan ve olmayan hücre invazyonundaki fark her zaman minimumdu (Şekil 2E). 0.5 μg / μL ECM jeli için, hücre invazyonundaki fark 24 saat ile 36 saat arasında belirgindi. 1 μg / μL ECM jeli için, hücre invazyonu üzerindeki CrkL aşırı ekspresyon etkisi 48 saatte hafifçe belirginleşti (Şekil 2G). Sonuçlar, kontrol ve CrkL aşırı eksprese eden hücreler arasındaki farkı tespit etme penceresinin, ECM jelinin konsantrasyonu arttıkça daha sonraki zamanlara kaydığını göstermektedir. Sonuçlar ayrıca, iki hücre popülasyonunun, farklı zaman noktalarında ECM jel konsantrasyonundaki artıştan farklı şekilde etkilendiğini göstermektedir. Örneğin, 12 saatte, CrkL aşırı eksprese eden hücreler, yalnızca 0.1 μg / μL ECM jelinde önemli ölçüde daha yüksek invazyon gösterdi (Şekil 2H). Bununla birlikte, 24 saatte, CrkL aşırı eksprese eden hücreler, test edilen ECM jel konsantrasyonlarında biraz daha yüksek veya benzer invazyon gösterdi (Şekil 2I). Bu nedenle, CrkL aşırı ekspresyonu olan ve olmayan iki hücre popülasyonu arasındaki farkların kapsamlı bir görünümünü elde etmek için hücre invazyonundaki hem zamana bağlı hem de ECM jel konsantrasyonuna bağlı farklılıkları araştırmak önemlidir. Bu sonuçlar, sentetik mRNA kullanılarak geçici aşırı ekspresyonun empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizleriyle birleştirilmesinin, gen aşırı ekspresyonu ile tümör hücresi göçü ve invazyonu arasındaki potansiyel korelasyonu analiz etmek için güçlü bir araç sağladığını göstermektedir. Sentetik mRNA ve ECM jelindeki konsantrasyon değişimlerinin etkilerinin incelenmesi daha doğru ve ayrıntılı bilgi sağlayacaktır.

Şekil 1: CrkI aşırı ekspresyonunun glioblastoma hücre göçü üzerindeki etkileri. U-118MG hücreleri, FLAG etiketli CrkI mRNA'nın belirtilen konsantrasyonları (ng / μL) ile elektroporasyona tabi tutuldu. (A) Western blot analizleri için, elektroporasyonlu hücreler, toplam hücre lizat preparasyonundan 1 gün önce kültürlendi. Sentetik CrkI mRNA ile transfeksiyon sonrası protein seviyeleri karşılaştırıldı. Anti-Crk ve anti-CrkL antikorları, hem endojen hem de FLAG etiketli proteinleri saptamak ve endojen proteinler ile FLAG etiketli proteinler arasındaki oranı karşılaştırmak için kullanıldı. Yükleme kontrolleri olarak vinculin ve α-tubulin kullanıldı. (B) Hücre migrasyon analizleri için, elektroporasyonlu hücreler, daha fazla kültür olmaksızın bir CIM plakasına kaplandı. Her numune için dört kuyudan hücre indeksi değerleri elde edildi ve bunların ortalama ± SD değerleri gösterildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CrkL aşırı ekspresyonunun glioblastoma hücre invazyonu üzerindeki etkileri. U-118MG hücreleri, nükleaz içermeyenH2Oveya 20 ng/μL FLAG etiketli CrkL mRNA ile elektroporasyona tabi tutuldu. (A) Western blot analizleri için, elektroporasyonlu hücreler, toplam hücre lizat preparasyonundan 1 gün önce kültürlendi. Sentetik CrkL mRNA ile transfeksiyon sonrası protein seviyeleri karşılaştırıldı. Anti-Crk ve anti-CrkL antikorları, hem endojen hem de FLAG etiketli proteinleri saptamak ve endojen proteinler ile FLAG etiketli proteinler arasındaki oranı karşılaştırmak için kullanıldı. Yükleme kontrolleri olarak vinculin ve α-tubulin kullanıldı. (B-G) Hücre invazyon analizi için, elektroporasyonlu hücreler, daha fazla kültür olmadan bir ECM jel kaplamalı bir CIM plakasına kaplandı. Hücre indeksi değerleri her örnek için dört kuyudan elde edildi ve ortalama ± SD değerleri gösterildi. (B) Farklı ECM jel konsantrasyonlarına sahip kontrol hücrelerinden elde edilen hücre invazyonu verileri karşılaştırıldı. (C) Çeşitli ECM jel konsantrasyonlarına sahip CrkL aşırı eksprese eden hücrelerden elde edilen hücre invazyonu verileri karşılaştırıldı. (D-G) Kontrol ve CrkL aşırı eksprese eden hücreler arasındaki hücre invazyonu verileri, belirtilen ECM jel konsantrasyonu için karşılaştırıldı. (H) Kontrol ve CrkL aşırı eksprese eden hücreler arasında 12 saatte hücre istilasının karşılaştırılması. (I) Kontrol ve CrkL aşırı eksprese eden hücreler arasında 24 saatte hücre invazyonunun karşılaştırılması. Kısaltmalar: ECM = hücre dışı matris; CIM = hücre istilası ve göçü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Gen yıkımı veya gen aşırı ekspresyonunu takiben deneysel prosedürlerin şematik diyagramları . (A) siRNA transfeksiyonunu takiben gerçek zamanlı hücre analizinin deneysel prosedürü. Deneysel koşullar altında siRNA transfeksiyonundan sonra tam gen yıkımını indüklemek için 3-4 gün gerektiğinden, hücreler gerçek zamanlı hücre analizlerine hazır olmadan önce elektroporasyondan sonra 3 gün boyunca yeniden kaplandı ve kültürlendi. (B) Sentetik mRNA transfeksiyonunu takiben gerçek zamanlı hücre analizi için deneysel prosedür. Sentetik mRNA transfeksiyonundan protein ekspresyonu hızlı olduğundan, elektroporasyonlu hücreler aynı gün gerçek zamanlı hücre analizleri için kullanıldı. İki deneysel prosedür arasındaki farka dikkat edin; gerçek zamanlı hücre analizi, siRNA'lar kullanılarak gen yıkımı için elektroporasyondan 3 gün sonra gerçekleştirilirken, sentetik mRNA ile gen aşırı ekspresyonu için elektroporasyondan hemen sonra gerçek zamanlı hücre analizi yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.